JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) משמשת לעקיפת מגבלת עקיפה אופיינית של מיקרוסקופיית אור ולהציג אקסוזומים בסולם הננומטר. זה יכול להיות מועסק בשניים ושלושה ממדים כדי לאפיין אקסוזומים.

Abstract

שלל חוץ-תאי (EVs) משוחררים על ידי כל סוגי התאים וממלאים תפקיד חשוב באיתות התא ובהומאוסטזיס. ההדמיה של EVs דורשת לעתים קרובות שיטות עקיפות בשל הקוטר הקטן שלהם (40-250 ננומטר), שהוא מתחת לגבול העקיפה של מיקרוסקופיית אור טיפוסית. פיתחנו הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר של EVs כדי לעקוף את מגבלת עקיפה בשניים ושלושה ממדים. באמצעות גישה זו, אנו יכולים לפתור את הצורה התלת ממדית של EVs בתוך +/- 20 ננומטר רזולוציה על ציר XY ו + / - 50 ננומטר רזולוציה לאורך ציר Z. לסיכום, אנו מציעים כי מיקרוסקופיה ברזולוציית-על תיחשב כשיטת אפיון של EVs, כולל אקסוזומים, כמו גם וירוסים עטופים.

Introduction

שלל חוץ-תאי (EVs) הם שלוקים הקשורים בממברנה המשתחררים על ידי כל סוגי התאים. הם מכילים שומנים, חלבונים, מטבוליטים וחומצות גרעין ומעבירים חומרים אלה באופן מקומי בין תאים ומעבירים בין רקמות ואיברים. ישנם שלושה תתי סוגים עיקריים של EVs: גופים אפופוטוטיים, microvesicles, ו exosomes1,2. כאן, אנו ממקדים את הדיון שלנו על אקסוזומים והחלבונים הקשורים שלהם.

אקסוזומים הם שלל מופרש שמקורו בהתפתחות הפנימית של אנדוזומים מוקדמים לתוך הגוף הרב-לשוני (MVB). לאחר מכן MVB מתמזג עם קרום הפלזמה, משחרר את exosomes לתוך החלל החוץ תאי לנסוע לתאים אחרים3,4. אקסוזומים קיימים על ספקטרום של גדלים הנעים בין 40 ל -150 ננומטר ומועשרים בחלבוני טרנס-מברן אנדוסומלית המכונים טטרספנינים (CD9, CD63, CD81), קומפלקס מיון אנדוסומאלי הקשור לממברנה הנדרש להובלה (ESCRT), וחלבונים הקשורים לרפסודה של שומנים1,2,5,6,7.

אפיון ההרכב הביוכימי של אקסוזומים הפך לתחום פופולרי עבור חוקרים להבין טוב יותר את האופי התפקודי שלהם. קיימות שיטות רבות להדמיה ואפיון אקסוזומים, כולל ציטומטריית זרימה ננומטרית, ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA), מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה ושידור (TEM), תהודה פלסמון פני השטח, חישת דופק התנגדותית ומיקרוסקופיה אור מסורתית, שכל אחד מהם מכיל יתרונות פנימיים וחסרונות8,9. TEM ו- cryo-EM יכולים להשיג רזולוציה מבוססת ננומטר, אך לעתים קרובות דורשים צעדי התייבשות ושבר בהקפאה, ובכך מתכווצים או מתרוממים EVs10,11. NTA מסתמכת על פיזור אור, המאפשר אפיון של מאות EVs בכל פעם, אבל היא מדידה עקיפה של גודל החלקיקים ולא יכול להבחין בקלות בין EVs, וירוסים, וחלבון אגרגטים12,13,14,15,16. ציטומטריית זרימה ננומטרית משתמשת בפיזור אור מנתיב עירור, אשר לאחר מכן ניתן לתרגם למדידות גודל, אבל היא טכנולוגיה מתפתחת, ויש קונצנזוס קטן על מה גודל החלקיקים נמצאים בטווח הליניארי של זיהוי עבור מכשירים שונים12,17,18.

מיקרוסקופיה אור מסורתית באמצעות חלבונים או צבעים פלואורסצנטיים הייתה אחת הטכניקות הנפוצות ביותר להדמיית תאים תת-תאיים, מתחמי חלבון ומכונות איתות בתוך תא. בעוד טכניקה זו מוכיחה שימושית לדמיין את לוקליזציה של מתחמים, מגבלת עקיפה של מיקרוסקופיה אור מסורתית (סביב 250-400 ננומטר) מונעת את הרזולוציה הברורה של חלבונים או מבנים בטווח הגודל הטיפוסי של exosome (40-150 ננומטר)12,19,20.

מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, כלומר, מיקרוסקופיה שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM), מבדילה את עצמה ממיקרוסקופיה קלה קונבנציונלית על ידי שימוש בתכונות הניתנות לצילום של פלואורופורים ספציפיים וזיהוי אירועים מהבהבים אלה כדי לשחזר תמונות עד לדיוק ננומטר21. אירועים של פוטו-וויצ'ינג נאספים באמצעות מצלמת זיהוי בקצב גבוה במהלך עשרות אלפי חשיפות בודדות, ופונקציית התפשטות נקודה משמשת למיפוי בביטחון רב את המיקום המדויק של הפלורופור השוטף19,20,22. זה מאפשר dSTORM לעקוף את מגבלת עקיפה של מיקרוסקופיית אור. מספר קבוצות דיווחו על שימוש בטכניקות ברזולוציית-על להדמיה ומעקב אחר אקסוזומים והחלבונים הקשורים22,23,24,25. הרזולוציה הסופית תלויה בתכונות הביופיסיות של הפלואורופור, אך לעתים קרובות נעה בין +/-10-100 ננומטר לאורך ציר ה-XY, ומאפשרת רזולוציה של מולקולה אחת.

היכולת לפתור פלואורופורים בודדים בקנה מידה זה על ציר XY חוללה מהפכה במיקרוסקופיה. עם זאת, יש מעט נתונים על dSTORM תלת מימדי (תלת-ממדי) של אקסוזום. לכן, ביקשנו לקבוע נוהל הפעלה סטנדרטי (SOP) להדמיה ואפיון מבוססי dSTORM של EVs מטוהרים, כולל אקסוזומים לדיוק ננומטר בתלת-ממד.

Protocol

1 הפצה ותחזוקה של קווי תאים

  1. לרכוש תאי אוסטאוסרקומה אנושיים (U2OS) ולמקם את התאים במדיום הצמיחה בתוספת 10% סרום בקר עוברי ללא אקסוזום ופתרון 1x פניצילין/סטרפטומיצין.
    הערה: סרום בקר עוברי ללא אקסוזום נוצר בעקבות הפרוטוקול שהוצג במקנמרה et. אל26.
  2. לשמור על תאי U2OS באינקובטור מצופה נחושת ב 37 °C ב 5% CO2 ותאי מעבר T175 צלוחיות26,27. התאים חייבים להישמר בשלב הצמיחה הלוגריתמי באמצע כדי למנוע תת-אוכלוסין הנובע, או מהצטברות של פסולת אפופטוטית במהלך השלב הנייח.

2 בידוד וטיהור אקסוזומים

  1. הגדל את קווי התא U2OS להשפעה מלאה ב-10 צלוחיות T175 נפרדות עם 50 מ"ל של מדיה לבקבוקון. הסר את תא supernatant ולאחר מכן לעבור אותו דרך 0.45 מיקרומטר ו 0.22 מיקרומטר סינון ואקום מנגנון סינון.
  2. נתן את supernatant לסינון זרימה צולבת (הידוע גם בשם סינון זרימה משיק) על מערכת סינון מצויד מחסנית 750 kDa חלול סיבים על מנת להסיר חלבונים קטנים יותר או מטבוליטים28.
    1. מעבר supernatant דרך מפעיל סינון זרימה משיק בלחץ קדימה מתמיד של 30 פסאיי, תוך שמירה על לחץ שמירה של <20 פסאיי כדי לייצר לחץ Δ של 10 או יותר פסאיי. מניחים מוט מערבוב מגנטי במיכל retentate ומגדירים ל 150 סל"ד26.
    2. שמור על קצב ההזנה ב 40 מ"ל / דקה ומעלה. אוספים את החפירה במאגר ונפטרים ממנו.
  3. מרכז את supernatant ל 30 מ"ל, ולאחר מכן שיווי משקל עם ארבעה כרכים של 1x PBS. לאסוף את זרימה צולבת מסנן ופתרון מכויל בצינור חרוט 50 מ"ל.
  4. לזרז את EVs ב 4 °C (55 °F) בריכוז סופי של 40 מ"ג / מ"ל פוליאתילן גליקול עם משקל מולקולרי של 8,000 Da. צנטריפוגה EVs ב 1,200 x גרם ב 4 °C (4 °F) עבור 1 שעות resuspend ב 500 μL של 1x PBS.
  5. לדגור על EVs עם 50 מיקרוגרם / מ"ל של צבע intercalating קרום אדום photowitchable ו 50 מיקרוגרם / מ"ל של RNase A ב 1x PBS ב 4 °C (5 °F) עבור 1 שעה.
  6. הסר צבע עודף דרך עמודה במערכת טיהור חלבונים המחוברת לאספן שברים. זהה שברי EV באמצעות ספיגת UV ובריכה אותם לתוך צינור microcentrifuge26.
  7. זיקה-לבחור סך של 200 μL של EVs באמצעות חרוזים מגנטיים נגד CD81 שיווי משקל ב 1x PBS.
    1. לדלל 100 μL של החרוזים המגנטיים נגד CD81 ב 1x PBS לנפח כולל של 1 מ"ל ולאפשר להם להיקשר ב 4 °C (2 °F) עבור 2 שעות בצינור microcentrifuge 2 מ"ל עם נדנדה רציפה.
  8. לשטוף את החרוזים נגד CD81 ו EV שלוש פעמים עם PBS 1x. Elute CD81+ EV מהפתרון עם גליצין 100 מ"מ ב- pH 2.0 למשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F).
  9. Pipette CD81 + EV מטוהר לנפח שווה של 100 mM Tris-HCl ב pH 7.5 ב 1x PBS.
    הערה: aliquot של פתרון CD81 + EV מטוהר עשוי להיות שמור לניתוח מעקב חלקיקים או מיקרוסקופיה אלקטרונית על מנת לאשר את טוהר הפתרון ואת נוכחותם של EVs26.

3 קיבעון והכנה

  1. הנח/י כלי עבודה מטוהרים על לוחות 8-באר מטוהרים מזכוכית בתחתית זכוכית μ בנפח כולל של 200 μL (יכול לדלל דגימת EV ב-100 מ"מ טריס-HCl ב-pH 7.5 ב-1x PBS) ולאפשר לדבוק בפני השטח למשך הלילה ב-4 °C (C).
  2. מבלי להסיר את הפתרון הקיים מהצלחת 8-well, לתקן EVs על הצלחות על ידי הוספת 200 μL של 4% paraformaldehyde ב 1x PBS לפתרון המכיל EV בכל באר ולאפשר דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר21.
  3. הסר בזהירות paraformaldehyde ופתרון עודף עם micropipette כדי לא להפריע את EVs. לשטוף את EV עם 1x PBS כדי להסיר paraformaldehyde עודף. בצע את הליך הכביסה שלוש פעמים. הסר עודף 1x PBS.
  4. הכן 250 μL של פתרון חיץ dSTORM B-cubed לכל מדגם על-ידי יצירת פתרון של 5 mM protocatechuate dioxygenase (חלק A) מדולל במאגר הדמיה (חלק B) לכל פרוטוקול של היצרן.
    הערה: ריכוז האנזים במאגר עשוי להיות מוכפל ל 10 mM אם מתרחשת ליבנה.
    1. הוסף 250 μL של המאגר המוכן לכל באר לפי פרוטוקול היצרן במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני הדמיה כדי לחפש מולקולות חמצון.
      הערה: לאחר מכן ניתן לצפות ב- EV באופן מיידי או לאחסן אותו ב- 4 °C (70 °F) למשך עד שבוע. החלף את המאגר הבא לפני כל פריט חזותי.

4 כיול מיקרוסקופי שחזור אופטי סטוכאסטי ישיר

  1. הכן את החרוזים הדרושים לכיול המיקרוסקופ ברזולוציית העל על ידי דילול מיקרוספרות של 100 ננומטר לריכוז של 0.5% במים מולקולריים כיתה וצינור 200 μL לתוך כל באר של צלחת 8-שקופית μ-שקופית 8-באר.
    1. אפשר לחרוזים להתיישב בבארות במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  2. מבלי להסיר את הפתרון הקיים, להוסיף 200 μL של 4% paraformaldehyde ב- PBS לכל באר לפתרון חרוז הכיול ולאפשר דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר בזהירות את paraformaldehyde עם micropipette לא להפריע החרוזים לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1x PBS. הכן את המאגר בהתאם לשלב 3.4.
  4. הסר 1x PBS והוסף 250 μL של המאגר המוכן לכל באר. אפשר למאגר לשבת 20 דקות לפני הפריט החזותי.
  5. לפני הנחת משהו על הבמה, התחבר למיקרוסקופ תלת-ממדי באמצעות לחצן חבר את המיקרוסקופ. מוסיפים שמן 100x למטרה ומניחים את מרכז הבאר על גבי המטרה. בהגדרה רכישה, הפעל את לייזרי העירור 473 ו- 640 ננומטר ולחץ על הצג.
    1. ללא הפעלת העדשה בתלת-ממד, הצג את החרוזים תחת הגדרת רוויית הפופוטונים על-ידי לחיצה על ספירת פוטון באפשרויות תצוגת תמונה. הגדר את כוחות הלייזר הראשוניים ל-8.4 מ"ו ללייזר 473 ננומטר ול-11.6 מ"ו ללייזר 640 ננומטר.
    2. להקטין את המוקד של הלייזר סביב -300 ננומטר או את המישור המוקד של חרוזי הכיול כדי לייצר רזולוציה ברורה של החרוזים בודדים. לאחר שמישור Z ממוקד, התאם עוד יותר את רמות צריכת הלייזר כדי להסביר וריאציה בכל שדה ראייה.
  6. תחת פונקציות המכשיר, כיול מיפוי תלת-ממדי וכיול מיפוי ערוצים כדי לקבל את השגיאות בציר X- - Y ו- Z. הגדר את המספר המרבי של FOVs ל- 20, את מספר הנקודות היעד ל- 4,000, את המרחק המרבי בין ערוצים ל- 5.0 פיקסלים ואת רדיוס האי-הכללה בין ערוצים ל- 10.0 פיקסלים במהלך כיול מיפוי הערוצים.
  7. ודא שהכיול מייצר כיסוי נקודתי של >90% ואיכות מיפוי טובה. שמור את נתוני הכיול הנתונים עבור רכישות עתידיות של תמונות.

5 הדמיה של EV בשלושה ממדים

  1. מוסיפים שמן 100x על המטרה ומניחים את ה- EVs המוכנים במיקרוסקופ. ללא הפעלת העדשה התלת-ממדית, הפעל את לייזר העירור של 640 ננומטר והעלה אותו בתחילה ל- 1.2 מגוואט ל- 12.5 מגוואט בהתאם לעוצמת האות ושדה הראייה כדי לרגש את הממברנה האדומה צובעת את הרכבים המוכתמים.
    1. תחת האפשרויות תצוגת תמונה, עברו את שיטת הצפייה מרוויה פוטונית לאוכלונים כדי להציג את ה-EVs באופן חזותי טוב יותר. כוונן את עוצמת הלייזר כדי למזער רעשים, תוך מיקסום האות. שמור על כל הפרמטרים האחרים.
    2. התאם את המוקד של מישור Z על-ידי לחיצה על סמל למעלה או למטה בציר Z.
      הערה: מטוס Z צריך להיות ממוקד בין -200 ל -350 ננומטר, אך ישתנה בהתאם לשדה הראייה.
  2. הגדר את זמן החשיפה ל- 20 אלפיות שני, את לכידת המסגרת ל- 10,000 פריימים ואת עוצמת הלייזר ההתחלתית ל- 1.2 מגוואט ל- 12.5 מגוואט, או את עוצמת הלייזר שנקבעה בשלב 5.1, בהתאם לעוצמת האות ושדה הראייה.
    1. הפעל את העדשה 3-D באמצעות הסמל ולהתחיל את הרכישה על ידי לחיצה על כפתור רכישה.
  3. במהלך רכישת התמונה, העלה את עוצמת הלייזר ב-3 במרווחים של 10 כל 1000 פריימים, או מספיק כדי לשמור על יחס אות לרעש גבוה. אל תתאים את מטוס Z במהלך הרכישה.
    הערה: ניתן להעלות את הלייזר למקסימום של 90 mW כוח לייזר.

6 שינויים לאחר הרכישה ומעקב אחר EV

  1. לאחר רכישת התמונה, עבור לחלון הצפייה 'ניתוח'. בצע תיקון סחף בתמונה הלא מסוננת ולאחר מכן הפעל מסננים. התאם את ספירת הפופוטים, דיוק ההתאמה לשפות לוקליזציה, סיגמות ואינדקס מסגרות בהתאם לטבלה 1.
  2. שכבת-על כלי תצוגה של מישור XYZ לאורך ציר X של כלי ערך חשמליים בודדים משדה הראייה והייצוא . קבצי CSV של אירועי צילום.
  3. חצו את הרכבים האלקטרוניים הבודדים בציר XY בשדה תצוגה X by Y באמצעות כלי היסטוגרמה של קו, המכניס בין אירועים של צילומי תמונות לקבוצות מרחק מוגדרות.
  4. צמו תמונות של EVs בודדים ושמרו אותם כקבצים .tiff.
  5. צרו סרטוני וידאו תלת-ממדיים של כלי עבודה אלקטרוניים בודדים באמצעות כלי תצוגה חזותי תלת-ממדי וצבע בהתאם למיקום לאורך ציר Z.

תוצאות

מטרת מחקר זה הייתה להעריך את האפקטיביות של מיקרוסקופיה ברזולוציית-על בהדמיית EVs בודדים ברזולוציית ננומטר בשלושה ממדים (תלת-ממד). כדי לנתח את הצורה והגודל של EVs בודדים, השתמשנו בצבע פוטו-חוטי ודגרנו את ה- EVs עם צבע אדום בהרבה, ממברנה מתערבב, והסרנו צבע עודף דרך כרומטוגרפיה29. לאחר ?...

Discussion

רכבים הסביבה הפכו לתחום מחקר פופולרי בשל תפקידם החשוב בתהליכים תאיים רבים ובאיתות מתא לתא1,30. עם זאת, ההדמיה שלהם מוכיחה להיות קשה כמו הגודל הקטן שלהם נופל מתחת לגבול עקיפה של מיקרוסקופיה אור. מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) היא שיטה ישירה להדמ?...

Disclosures

M.G.C. אין ניגודי אינטרסים להצהיר. R.P.M ו- D.P.D. מקבלים תמיכה חומרית מאוקספורד ננו-הדמיה (ONI) Inc. ו- Cytiva Inc. (לשעבר GE Healthcare). R.P. .M ו- D.P.D. מצהירים על אינטרסים מתחרים למסחור אפשרי של חלק מהמידע המוצג. אלה מנוהלים על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה. מקורות המימון לא היו מעורבים בפרשנויות או בכתיבה של כתב יד זה.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ל-Oxford Nanoimaging על המשוב וההדרכה הבונים שלהם. עבודה זו מומנה על ידי 5UM1CA121947-10 ל R.P.M. ואת 1R01DA040394 ל D.P.D.D.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 µ-Slide 8 well platesIbidi80827
1X PBSGibco14190-144
1X Penicillin Streptomycin solutionGibco15140-122
50 mL conical tubeThermo Fisher339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatusGenesee25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filterCytiva29-0142-95
AKTA Flux SCytiva29-0384-37
AKTA StartCytiva29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beadsThermo Fisher10616D
B-cubed bufferONI BCA0017
CellMask RedThermo FisherC10046
Dubelco's Modified Eagle MediumThermo Fisher10566016
Fetal Bovine SerumVWR97068-085
Frac 30 Fraction collectorCytiva29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0Thermo FisherBP381-5
HiTrap CaptoCore 700 ColumnCytiva17548151
Molecular Biology Grade WaterCorning9820003
NanoimagerOxford NanoimagingCustom
ParaformaldehhydeElectron Microscopy Sciences15710
Polyethylene glycolThermo FisherBP233-1
RNase APromegaA797C
T175 FlasksGenesee25-211
Tetraspek microspheresInvitrogenT7279
Tris- HCl pH=7.5Thermo FisherBP153-1
Unicorn VCytiva29022094-ECOMINSSW

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved