細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

要約

直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、光顕微鏡の典型的な回折限界をバイパスし、ナノメートルスケールでエキソソームを見るために使用されます。エキソソームを特徴付けるために2次元と3次元の両方で採用することができます。

要約

細胞外小胞(EV)は、細胞の種類を全て放出し、細胞シグナル伝達や恒常性に重要な役割を果たす。EV の視覚化には、通常の光顕微鏡の回折限界を超える小径 (40 ~250 nm) による間接的な方法が必要な場合が多い。我々は、2次元と3次元の両方で回折限界をバイパスするEVの超解像顕微鏡ベースの視覚化を開発しました。この方法を使用すると、XY 軸での解像度 +/- 20 nm 以内、Z 軸に沿った解像度 +/- 50 nm の解像度に、EV の 3 次元の形状を解決できます。結論として、我々は、超解像顕微鏡をエキソソームを含むEVの特性評価方法として、また、エンベロープウイルスとして考慮することを提案する。

概要

細胞外小胞(EV)は、全ての細胞タイプによって放出される膜結合小胞である。脂質、タンパク質、代謝産物、核酸を含み、細胞間で細胞間で局所的に、組織と器官の間で遠位に移動します。EV には、アポトーシス体、微小小胞、エキソソーム^1、2という 3 つの主要なサブタイプがあります。ここでは、エキソソームとその関連タンパク質に焦点を当てます。

エキソソームは、初期の子宮体の内出から多胸体(MVB)に由来する小胞を分泌する。MVBは、その後、細胞膜と融合し、エキソソームを細胞外空間に放出して、他の細胞^3、4に移動する。エキソソームは40~150nmの範囲の大きさのスペクトルに存在し、テトラスパニン(CD9、CD63、CD81)、輸送に必要な膜結合性内膜選別複合体(ESCRT)、および脂質いかだ関連タンパク質^{1、2、5、6、7}と呼ばれる内皮貫膜タンパク質で富化される。

エキソソームの生化学的構成を特徴付け、研究者が機能性をよりよく理解する人気の分野となっています。ナノスケールフローサイトメトリー、ナノ粒子追跡解析(NTA)、走査・透過電子顕微鏡(TEM)、表面プラズモン共鳴、抵抗パルスセンシング、従来の光顕微鏡など、エキソソームの視覚化と特徴付けには多くの方法があり、それぞれに本質的な長所と短所^8,9が含まれています。TEMとcryo-EMはナノメートルベースの分解を達成することができるが、しばしば脱水および凍結破壊ステップを必要とし、それによって^EV10、11を収縮またはライシングする。NTAは光散乱に依存し、一度に数百個のEVの特性を持たせることができますが、粒子サイズの間接的な測定であり、EV、ウイルス、およびタンパク質凝集^体12、13、14、15、16を容易に区別することはできません。ナノスケールフローサイトメトリーは励起路からの光散乱を採用し、その後サイズ測定に変換することができるが、新たな技術であり、様々な機器^12、17、18の検出の線形範囲内にある粒子のサイズについてはほとんどコンセンサスがない。

蛍光タンパク質や色素を用いた従来の光顕微鏡は、細胞内の細胞内コンパートメント、タンパク質複合体、およびシグナル伝達機械を可視化するために最も採用されている技術の1つであった。この技術は、複合体の局在化を可視化するのに有用であることが証明されるが、従来の光顕微鏡(250〜400nm前後)の回折限界は、エキソソーム(40-150 nm)12、19、20の典型的なサイズ範囲におけるタンパク質または構造の明確な分解能を防ぐ。

超解像顕微鏡、すなわち直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、特定の蛍光ホルの光スイッチ可能な特性を採用し、これらの点滅事象を検出してナノメートル精度²¹まで画像を再構築することによって、従来の光顕微鏡と区別する。光スイッチングイベントは、数万個の個別露光の過程で高フレームレート検出カメラを用いて収集され、ポイントスプレッド関数は、光スイッチング蛍光体^19、20、22の正確な位置を高い信頼度でマッピングするために使用される。これにより、dSTORMは光顕微鏡の回折限界をバイパスすることができます。いくつかのグループは、エキソソームおよび関連するタンパク質^{22、23、24、25}を視覚化および追跡するための超解像技術の使用^を報告している。最終的な分解能は、フルオロフォアの生物物理学的性質に依存しますが、多くの場合、XY軸に沿って+/-10-100nmの範囲であり、単一分子分解能を可能にします。

XY軸でこのスケールで個々の蛍光体を解決する能力は、顕微鏡に革命を起こしました。しかし、エキソソームの3次元(3次元)dSTORMに関するデータはほとんどありません。そこで、3次元のエキソソームからナノメートルの精度を含む、精製EVのdSTORMベースの可視化と特性評価のための標準的な操作手順(SOP)を確立することを求めました。

プロトコル

1 細胞株の伝播と維持

1. ヒト骨肉腫細胞(U2OS)を取得し、10%エキソソームフリーウシ胎児血清および1xペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加した成長培地に細胞を入れる。
   注:エキソソームフリーの胎児ウシ血清は、マクナマラで提示されたプロトコルに従って生成されました。al.²⁶.
2. U2OS細胞を銅被覆インキュベーターの37°Cで5%CO2、T175フラスコ^26,27の通過細胞に維持する。細胞は、亜集団が生じるのを防ぐために、または静止期中にアポトーシスの破片の蓄積から、中対数成長期に維持されなければならない。

2 エキソソームの分離と精製

1. U2OS細胞株を10個のT175フラスコでフルコンフルに成長させ、フラスコあたり50 mLのメディアを使用します。細胞上清を取り除き、0.45 μmおよび0.22 μmの真空ろ過装置を通して連続的に通過させる。
2. より小さなタンパク質または代謝物²⁸を除去するために、750 kDa中空繊維カートリッジを備えた濾過システム上に、上清をクロスフロー濾過(接線流ろ過量とも呼ばれる)を供する。
   1. 30psiの一定の前方圧力で接線流ろ過演算子を通して上清を通過し、10以上のpsiのΔ圧力を生成するために<20psiの保持圧力を維持しながら。リテンテートタンクに磁気攪拌棒を入れ、150 rpm²⁶に設定します。
   2. 供給速度を40 mL/min以上に保つ。貯水池に透過物を収集し、それを処分します。
3. 上清を30mLに濃縮し、4巻の1x PBSで平衡化する。50 mL円錐管で、クロスフローをフィルタして平衡化した溶液を収集します。
4. 40mg/mLポリエチレングリコールの最終濃度4,000 Da.遠心分離機でEVを4°Cで1時間4°Cで1,200 x g、500 μLで再懸濁します。
5. 50 μg/mLの光切り替え可能な赤膜インターカレル染料と50 μg/mLのRNase Aを4°Cで4°Cで1時間インキュベートします。
6. 分画コレクターに取り付けられたタンパク質精製システム上のカラムを通して余分な染料を除去する。UV吸光度を介してEV画分を識別し、マイクロ遠心チューブ²⁶にそれらをプールします。
7. 1x PBSで平衡化されたアンチCD81磁気ビーズを使用して、合計200μLのEVをアフィニティ選択します。
   1. 1x PBSで100μLの抗CD81磁気ビーズを1mLの全容に希釈し、連続揺れが続く2 mLマイクロ遠心分離チューブで4°Cで2時間結合します。
8. 1x PBSでアンチCD81ビーズとEVを3回洗浄します。37°Cで30分間pH 2.0で100 mMグリシンを用いた溶液からCD81+EVをエリュートします。
9. 精製したCD81+EVを1x PBSのpH 7.5で等量の100 mM Tris-HClにピペットします。
   注:精製されたCD81+EV溶液のアリコートは、溶液の純度および^EV26の存在を確認するために、ナノ粒子追跡分析または電子顕微鏡のために予約されてもよい。

3 固定と準備

1. 全容200μLのガラス底μスライド8ウェルプレートに親和性精製EVを配置し(1x PBSでpH 7.5で100mM Tris-HClでEVサンプルを希釈することができます)、4°Cで一晩表面に付着させることができます。
2. 8ウェルプレートから既存の溶液を取り除かずに、各ウェルのEV含有溶液に1x PBSに4%パラホルムアルデヒドの200 μLを加えてプレートにEVを固定し、室温²¹で30分間インキュベートできるようにします。
3. EVを乱さないために、マイクロピペットでパラホルムアルデヒドと過剰溶液を慎重に除去します。余分なパラホルムアルデヒドを除去するために1x PBSでEVを洗浄します。洗浄手順を3回行います。余分な1倍のPBSを取り除きます。
4. 250 μLのdSTORM B立方体バッファー溶液を、メーカーのプロトコルごとにイメージングバッファー(パートB)で希釈した5 mM原テクテクチエオキシゲナーゼ(パートA)の溶液を作成して、サンプルごとに調製します。
   注:光の漂白が発生した場合、バッファー内の酵素の濃度は10 mMに倍増することがあります。
   1. 調製したバッファーの 250 μL をメーカーのプロトコルごとに、室温で 20 分間ずつ追加してから、酸化分子を清掃します。
      注:EVはすぐに見るか、4°Cで最大1週間保存することができます。ビジュアライゼーションの前に、ストレージに続くバッファーを交換してください。

4 直接確率的光学再構成顕微鏡校正

1. 100 nmマイクロスフィアを分子生物学グレードの水濃度0.5%に希釈し、ガラス底μスライド8ウェルプレートの各ウェルに200 μLをピペット化して、超解像顕微鏡のキャリブレーションに必要なビーズを準備します。
   1. ビーズを室温で1時間ウェルに落ち着かせる。
2. 既存の溶液を取り除かずに、PBSに4%パラホルムアルデヒドを200 μL加えて、各ウェルをキャリブレーションビーズ溶液に加え、室温で30分間インキュベートします。
3. 慎重にビーズを邪魔しないようにマイクロピペットでパラホルムアルデヒドを除去し、1x PBSでビーズを3回洗浄します。ステップ 3.4 に従ってバッファーを準備します。
4. 1x PBSを取り出し、準備したバッファの250 μLを各ウェルに追加します。ビジュアライゼーションの前にバッファを 20 分間待機させます。
5. ステージ上に何かを置く前に、顕微鏡ボタンを接続して3D 顕微鏡に接続 します。目的に100x油を加え、目的の上に井戸の中心を置きます。取得設定 で 、473 および 640 nm の励起レーザーをオンにして、[ 表示] をクリックします。
   1. 3-D レンズをアクティブにせずに、[イメージ表示]オプションでフォトン数をクリックして、フォトンの彩度設定の下にビーズを表示します。最初のレーザーパワーを473 nmレーザーの場合は8.4 mW、640 nmレーザーでは11.6 mWに設定します。
   2. レーザーの焦点を-300 nm前後、またはキャリブレーションビーズの焦点面に下げ、個々のビーズの明確な解像度を生成します。Z面が焦点を合わせられたら、レーザーパワーレベルを調整して、各視野の変動を考慮します。
6. 計器機能の下で、3次元マッピングキャリブレーションとチャンネルマッピングキャリブレーションを完了して、X軸、Y軸、Z軸の誤差を取得します。FOV の最大数を 20、目標ポイント数を 4,000、チャネル間の最大距離を 5.0 ピクセルに設定し、チャネルマッピングのキャリブレーション中にチャネル間の除外半径を 10.0 ピクセルに設定します。
7. キャリブレーションにより、ポイントカバレッジが>90%、マッピング品質が良好であることを確認します。将来の画像取得のために、指定されたキャリブレーションデータを保存します。

5 3次元でのEVの可視化

1. 目的に100x油を加え、準備したEVを顕微鏡に入れます。3Dレンズが作動しない場合は、640 nmの励起レーザーをオンにし、信号の強度と視野に応じて1.2mWから12.5mWの間に最初に上げて、赤色膜間の色素染色されたEVを励起させます。
   1. [ イメージ表示 ]オプションで、表示方法をフォトン飽和からパーセンタイルに切り替えて、EV をより適切に視覚化します。信号を最大化しながら、ノイズを最小限に抑えるためにレーザーパワーを調整します。他のすべてのパラメーターを維持します。
   2. Z 軸の上または下のアイコンをクリックして、Z 平面のフォーカスを調整します。
      注: Z 平面は -200 ~ -350 nm の間に焦点を合わせる必要がありますが、視野によって異なります。
2. 露光時間を20 ms、フレームキャプチャを10,000フレームに、初期レーザーパワーを1.2 mW~12.5 mWの間に設定するか、または、信号と視野の強度に応じてステップ5.1で決定したレーザーパワーを設定します。
   1. アイコンを使用して3Dレンズをアクティブにし、取得ボタンをクリックして 取得 を開始します。
3. 画像取得中は、1000 フレームごとに 10 ずつ、または高い信号対雑音比を維持するのに十分な単位でレーザーパワーを上げます。取得中に Z 平面を調整しないでください。
   メモ:レーザーは最大90mWのレーザーパワーまで上げてもよい。

6 取得後の変更と EV トレース

1. 画像の取得後、[ 分析] 表示ウィンドウに切り替えます。フィルタされていない画像に対してドリフト補正を実行し、フィルタをアクティブにします。 表 1に従って、フォトン数、ローカリゼーション精度、シグマ、およびフレームインデックスを調整します。
2. XYZ 平面ビュー ツールを、ビューおよびエクスポート のフィールドから個々の EV の X 軸に沿ってオーバーレイします。写真スイッチングイベントのCSVファイル。
3. X by Y 視野の XY 軸上の個々の EV を二分する場合、ライン ヒストグラム ツールを使用して、フォトスイッチング イベントを設定された距離グループにビン分割します。
4. 単一のEVの画像を撮り、.tiffファイルとして保存します。
5. 3-D 視覚化ツールを使用して、個々の EV の 3D ビデオを作成し、Z 軸に沿った配置に従って色を設定します。

結果

本研究の目的は、3次元(3次元)のナノメートル分解能を有する個々のEVを可視化する上での超解像顕微鏡の有効性を評価することであった。個々のEVの形状と大きさを解析するために、光切り替え可能な色素を採用し、遠赤色の膜インターカラット色素でEVをインキュベートし、クロマトグラフィー²⁹を介して過剰な色素を除去した。アフィニティキャプチャー抗CD81および赤色...

ディスカッション

EVは、多くの細胞内プロセスおよび細胞間シグナル^伝達1,30において重要な役割を果たしているため、研究分野として人気となっている。しかし、その小さなサイズが光顕微鏡の回折限界を下回るので、その視覚化は困難であることが判明した。直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、個々の蛍光体の光スイッチングイベントを経時に捉え、これらの...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 µ-Slide 8 well plates	Ibidi	80827
1X PBS	Gibco	14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution	Gibco	15140-122
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus	Genesee	25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter	Cytiva	29-0142-95
AKTA Flux S	Cytiva	29-0384-37
AKTA Start	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads	Thermo Fisher	10616D
B-cubed buffer	ONI	BCA0017
CellMask Red	Thermo Fisher	C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10566016
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Frac 30 Fraction collector	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0	Thermo Fisher	BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column	Cytiva	17548151
Molecular Biology Grade Water	Corning	9820003
Nanoimager	Oxford Nanoimaging	Custom
Paraformaldehhyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Polyethylene glycol	Thermo Fisher	BP233-1
RNase A	Promega	A797C
T175 Flasks	Genesee	25-211
Tetraspek microspheres	Invitrogen	T7279
Tris- HCl pH=7.5	Thermo Fisher	BP153-1
Unicorn V	Cytiva	29022094-ECOMINSSW