細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

要約

直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、光顕微鏡の典型的な回折限界をバイパスし、ナノメートルスケールでエキソソームを見るために使用されます。エキソソームを特徴付けるために2次元と3次元の両方で採用することができます。

要約

細胞外小胞(EV)は、細胞の種類を全て放出し、細胞シグナル伝達や恒常性に重要な役割を果たす。EV の視覚化には、通常の光顕微鏡の回折限界を超える小径 (40 ~250 nm) による間接的な方法が必要な場合が多い。我々は、2次元と3次元の両方で回折限界をバイパスするEVの超解像顕微鏡ベースの視覚化を開発しました。この方法を使用すると、XY 軸での解像度 +/- 20 nm 以内、Z 軸に沿った解像度 +/- 50 nm の解像度に、EV の 3 次元の形状を解決できます。結論として、我々は、超解像顕微鏡をエキソソームを含むEVの特性評価方法として、また、エンベロープウイルスとして考慮することを提案する。

概要

細胞外小胞(EV)は、全ての細胞タイプによって放出される膜結合小胞である。脂質、タンパク質、代謝産物、核酸を含み、細胞間で細胞間で局所的に、組織と器官の間で遠位に移動します。EV には、アポトーシス体、微小小胞、エキソソーム^1、2という 3 つの主要なサブタイプがあります。ここでは、エキソソームとその関連タンパク質に焦点を当てます。

エキソソームは、初期の子宮体の内出から多胸体(MVB)に由来する小胞を分泌する。MVBは、その後、細胞膜と融合し、エキソソームを細胞外空間に放出して、他の細胞^3、4に移動する。エキソソームは40~150nmの範囲の大きさのスペクトルに存在し、テトラスパニン(CD9、CD63、CD81)、輸送に必要な膜結合性内膜選別複合体(ESCRT)、および脂質いかだ関連タンパク質^{1、2、5、6、7}と呼ばれる....

プロトコル

1 細胞株の伝播と維持

1. ヒト骨肉腫細胞(U2OS)を取得し、10%エキソソームフリーウシ胎児血清および1xペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加した成長培地に細胞を入れる。
   注:エキソソームフリーの胎児ウシ血清は、マクナマラで提示されたプロトコルに従って生成されました。al.²⁶.
2. U2OS細胞を銅被覆インキュベーターの37°Cで5%CO2、T175フラスコ^26,27の通過細胞に維持する。細胞は、亜集団が生じるのを防ぐために、または静止期中にアポトーシスの破片の蓄積から、中対数成長期に維持されなければならない。

2 エキソソームの分離と精製

1. U2OS細胞株を10個のT175フラスコでフルコンフルに成長させ、フラスコあたり50 mLのメディアを使用します。細胞上清を取り除き、0.45 μmおよび0.22 μmの真空ろ過装置を通して連続的に通過させる。
2. より小さなタンパク質または代謝物²⁸を除去するために、750 kDa中空繊維カートリッジを備えた濾過システム上に、上清をクロスフロー濾過(接線流ろ過量とも呼ばれる)を供する。
   1. 30ps....

結果

本研究の目的は、3次元(3次元)のナノメートル分解能を有する個々のEVを可視化する上での超解像顕微鏡の有効性を評価することであった。個々のEVの形状と大きさを解析するために、光切り替え可能な色素を採用し、遠赤色の膜インターカラット色素でEVをインキュベートし、クロマトグラフィー²⁹を介して過剰な色素を除去した。アフィニティキャプチャー抗CD81および赤色.......

ディスカッション

EVは、多くの細胞内プロセスおよび細胞間シグナル^伝達1,30において重要な役割を果たしているため、研究分野として人気となっている。しかし、その小さなサイズが光顕微鏡の回折限界を下回るので、その視覚化は困難であることが判明した。直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、個々の蛍光体の光スイッチングイベントを経時に捉え、これらの.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 µ-Slide 8 well plates	Ibidi	80827
1X PBS	Gibco	14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution	Gibco	15140-122
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus	Genesee	25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter	Cytiva	29-0142-95
AKTA Flux S	Cytiva	29-0384-37
AKTA Start	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads	Thermo Fisher	10616D
B-cubed buffer	ONI	BCA0017
CellMask Red	Thermo Fisher	C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10566016
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Frac 30 Fraction collector	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0	Thermo Fisher	BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column	Cytiva	17548151
Molecular Biology Grade Water	Corning	9820003
Nanoimager	Oxford Nanoimaging	Custom
Paraformaldehhyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Polyethylene glycol	Thermo Fisher	BP233-1
RNase A	Promega	A797C
T175 Flasks	Genesee	25-211
Tetraspek microspheres	Invitrogen	T7279
Tris- HCl pH=7.5	Thermo Fisher	BP153-1
Unicorn V	Cytiva	29022094-ECOMINSSW