3 차원에서 세포 외 소포의 직접 스토카스틱 광학 재건 현미경 검사

요약

직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법 (dSTORM)은 빛 현미경 검사법의 전형적인 회절 한계를 우회하고 나노 미터 척도에서 엑소좀을 보는 데 사용됩니다. 엑소좀을 특성화하기 위해 2차원과 3차원에서 모두 사용할 수 있다.

초록

세포 외 소포 (EV)는 모든 세포 유형에 의해 방출되고 세포 신호 및 항상성에 중요한 역할을합니다. 전기 EV의 시각화는 종종 일반적인 빛 현미경 검사법의 회절 한계 아래에있는 작은 직경 (40-250 nm)으로 인해 간접적인 방법이 필요합니다. 우리는 2 차원과 3 차원 모두에서 회절 제한을 우회하기 위해 전기 TV의 초해상도 현미경 기반 시각화를 개발했습니다. 이 방법을 사용하여 XY 축및 XY 축에서 +/- 20 nm 해상도 내에서 EV의 3차원 모양을 해결하고 Z축을 따라 50nm 해상도로 해결할 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 초해상도 현미경 검사법이 외성뿐만 아니라 둘러싸인 바이러스를 포함한 EV의 특성화 방법으로 간주될 것을 제안합니다.

서문

세포 외 소포 (EV)는 모든 세포 유형에 의해 방출되는 막 바인딩 소포입니다. 그(것)들은 지질, 단백질, 대사 산물 및 핵산을 포함하고 조직과 기관 사이 세포 사이 를 현지으로 이 물질을 전송합니다. 전기 의 세 가지 기본 하위 유형이 있다: apoptotic 바디, microvesicles, 및 엑소좀^1,2. 여기에서, 우리는 엑소좀과 그들의 관련한 단백질에 우리의 토론을 집중합니다.

엑소좀은 초기 내종의 내후 신진에서 다중 혈관 체(MVB)로 유래한 소포를 분비한다. MVB는 그 때 플라즈마 막과 융합하여 외식을 세포외 공간으로 방출하여 다른^세포3,4로이동한다. 엑소좀은 40~150nm에 이르는 다양한 크기의 스펙트럼에 존재하며 테트라스판닌(CD9, CD63, CD81), 수송에 필요한 막 경계 내도 선별 복합체(ESCRT), 지질 래프트 관련 단백질^1,2,5,6,7로구성된 내피 반막 단백질로 풍부하게 함유되어 있다.

엑소좀의 생화학적 구성을 특징짓는 것은 연구자들이 기능성 특성을 더 잘 이해할 수 있는 인기 있는 분야가 되었습니다. 나노스케일 유동 세포측정, 나노입자 추적 분석(NTA), 스캐닝 및 투과 전자 현미경검사(TEM), 표면 플라스몬 공명, 저항 펄스 감지 및 전통적인 광 현미경 검사법을 포함한 엑소좀을 시각화하고 특성화하기 위한 많은 방법이 존재하며, 각각 내장된 프로및 단점^8,9을함유하고 있다. TEM 및 저저온-EM은 나노미터 기반 해상도를 달성할 수 있지만 탈수 및 동결 골절 단계가 필요하므로 EV^10,11을축소하거나 용해합니다. NTA는 빛 산란에 의존하여 한 번에 수백 대의 전기 Ev의 특성화를 허용하지만 입자 크기의 간접 측정이며 EV, 바이러스 및 단백질 집계^{12,13,14,15,16을}쉽게 구별할 수 없다. 나노스케일 유동 세포측정은 난리 경로로부터 광산란을 사용하여 크기 측정으로 변환할 수 있지만 신흥 기술이며, 다양한^{계측기(12,17,18)에}대한 검출의 선형 범위 내에 있는 입자의 크기에 대해서는 거의 합의가 없다.

형광 단백질 이나 염료를 사용 하 여 전통적인 빛 현미경 검사량 세포 구획을 시각화 하기 위한 가장 많이 사용 되는 기술 중 하나입니다., 단백질 복합체, 그리고 세포 내에서 신호 기계. 이 기술은 복합체의 국소화를 시각화하는 데 유용하지만, 전통적인 광 현미경 검사법(약 250-400 nm)의 회절 제한은 엑소좀(40-150 nm)^12,19,20의일반적인 크기 범위에서 단백질 또는 구조의 명확한 분해를 방지한다.

초분해능 현미경 검사법, 즉 직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법(dSTORM)은 특정 형광의 광전환 특성을 활용하고 이러한 깜박이는 이벤트를 감지하여 나노미터^{정밀도(21)로}이미지를 재구성하여 기존의 광 현미경 검사법과 구별한다. 포토스위칭 이벤트는 수만 개의 개별 노출 과정에서 고액 검출 카메라를 사용하여 수집되며, 포인트 스프레드 기능은 포토스위칭^{형광(19,20,22)의}정확한 위치를 높은 신뢰도로 매핑하는 데 사용된다. 이를 통해 DSTORM은 빛 현미경 검사법의 회절 한계를 우회할 수 있습니다. 몇몇 단은 엑소좀 및 그들의 관련 단백질을 시각화하고 추적하기 위한 초해상도 기술의 사용을 보고했습니다^22,23,24,25. 최종 해상도는 형광의 생물학적 특성에 따라 다르지만 XY 축을 따라 +/-10-100 nm부터 다양하여 단일 분자 분해능을 허용합니다.

XY 축에서 이 척도에서 개별 형광을 해결하는 기능은 현미경 검사법에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 엑소좀의 3차원(3차원) dSTORM에 대한 데이터는 거의 없다. 따라서, 우리는 3-D에서 나노 미터 정밀도에 엑소좀을 포함하여 dSTORM 기반의 시각화 및 정제 된 전기 의 특성화를위한 표준 운영 절차 (SOP)를 확립하고자했습니다.

프로토콜

1 세포주 전파 및 유지 보수

1. 인간 골육종 세포 (U2OS)를 획득하고 10 % 엑소좀이없는 태아 소 혈청과 1 x 페니실린 / 연쇄 상미신 용액으로 보충 된 성장 배지에 세포를 배치합니다.
   참고 : 외성없는 태아 소 혈청은 McNamara 등에서 제시 된 프로토콜에 따라 생성되었습니다. al.²⁶.
2. T175 플라스크^26,27에서5% CO₂ 및 통로 세포에서 37°C에서 구리 코팅 인큐베이터에서 U2OS 세포를 유지한다. 세포는 중간 로그산학 성장 단계에서 유지되어야하며, 하위 집단이 발생하지 않도록하거나 고정 된 단계에서 세포 사멸 파편이 축적되는 것을 방지해야합니다.

2 엑소솜의 고립과 정화

1. 플라스크당 50mL의 미디어로 10개의 별도 T175 플라스크에서 U2OS 셀라인을 완전한 결합으로 성장시다. 세포 상체를 제거하고 0.45 μm 및 0.22 μm 진공 여과 장치를 통해 연속적으로 통과하십시오.
2. 더 작은 단백질 또는 대사^{산물(28)을}제거하기 위해 750 kDa 중공 섬유 카트리지가 장착된 여과 시스템에 대한 교차 흐름 여과(접선 흐름 여과라고도 함)를 교차플로하는 상체를 피한다.
   1. 상체를 30 psi의 일정한 전방 압력으로 접선 유동 여과 연산자 통과하고, <20 psi의 고정 압력을 유지하면서 10 이상의 psi의 Δ 압력을 생성한다. 재보테이트 탱크에 마그네틱 스터드 바를 놓고 150rpm^26으로설정합니다.
   2. 이송 속도를 40mL/min 이상으로 유지합니다. 저수지에 침투를 수집하고 폐기하십시오.
3. 상체를 30mL로 농축한 다음 4권의 PBS로 평형화합니다. 50mL 원문 튜브에서 필터링되고 평형된 용액을 수집합니다.
4. 40 mg/mL 폴리에틸렌 글리콜의 최종 농도로 하룻밤 사이에 4°C의 전기를 침전하여 분자량 8,000 Da. 원심분리기 는 4°C에서 1시간 동안 1,200xg에서 1시간 동안 1,200xg의 원심분리기, 1x PBS의 500μL로 재연한다.
5. 1h에 대한 4°C에서 1x PBS에서 50 μg/mL의 광전환 가능한 적색 막 과 50 μg/mL의 전기를 1시간 PBS로 1x PBS로 배양한다.
6. 분수 수집기에 부착된 단백질 정제 시스템의 컬럼을 통해 과도한 염료를 제거합니다. UV 흡광도를 통해 EV 분획을 식별하고 마이크로 센세이프분리기^{튜브(26)로}풀을 한다.
7. 선호도-1x PBS에 상형화된 안티 CD81 마그네틱 구슬을 사용하여 총 200μL의 전기자동차를 선택한다.
   1. 1x PBS에서 1x PBS로 100 μL을 희석하고 연속 흔들림이 있는 2mL 마이크로센심분리기 튜브에서 2시간 동안 4°C로 결합할 수 있도록 합니다.
8. 안티 CD81 구슬과 EV를 1x PBS로 세 번 세척합니다. 37°C에서 30분 동안 pH 2.0에서 100mM 글리신을 장착한 용액의 Elute CD81+ EV.
9. 파이펫 정제 CD81+ EV는 1배 PBS에서 pH 7.5에서 100mM Tris-HCl의 동일한 부피로 고정됩니다.
   참고: 정제된 CD81+ EV 용액의 알리쿼트(aliquot)는 용액의 순도와^EV(26)의존재를 확인하기 위해 나노입자 추적 분석 또는 전자 현미경 검사를 위해 예약될 수 있다.

3 고정 및 준비

1. 200 μL의 총 부피 (1 x PBS에서 pH 7.5에서 100 mM Tris-HCl에서 EV 샘플을 희석 할 수 있음)의 총 부피로 유리 바닥 μ 슬라이드 8 웰 플레이트에 친화성 정제 된 전기 를 배치하고 4 ° C에서 밤새 표면에 부착 할 수 있습니다.
2. 기존 용액을 8웰 플레이트에서 제거하지 않고, 1x PBS에 4% 파라포름알데히드의 200 μL을 1x PBS에 추가하여 플레이트에 EV를 고정하고 실온^21에서30분 동안 배양할 수 있도록 한다.
3. EV를 방해하지 않도록 마이크로 피펫으로 파라포름알데히드 및 과도한 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 1x PBS로 EV를 세척하여 과도한 파라포름알데히드를 제거합니다. 세워 절차를 세 번 수행합니다. 초과 1배 PBS를 제거합니다.
4. 제조업체의 프로토콜당 이미징 버퍼(파트 B)에서 희석된 5mM 프로토카테주아제 디산소제(파트 A)의 용액을 생성하여 시료당 dSTORM B-cubed 버퍼 용액 250μL를 준비합니다.
   참고: 광표백이 발생하면 완충제 내 효소의 농도가 10mM로 두 배가 될 수 있다.
   1. 산화 분자를 청소하기 위해 이미징하기 전에 실온에서 20 분 동안 제조업체의 프로토콜당 각 우물에 준비 된 버퍼 250 μL을 추가하십시오.
      참고: EV는 즉시 보거나 최대 1주일 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. 모든 시각화 전에 다음 저장소를 교체합니다.

4 직접 적증 광학 재건 현미경 교정

1. 분자 생물학 급수에서 0.5%의 농도로 100nm 마이크로스피어를 희석하고 유리 바닥 μ 슬라이드 8웰 플레이트의 각 우물에 200 μL을 배관하여 초해상도 현미경의 보정에 필요한 구슬을 준비한다.
   1. 구슬이 실온에서 1시간 동안 우물에 정착하도록 허용합니다.
2. 기존 용액을 제거하지 않고 PBS에 4% 파라포름알데히드의 200 μL을 교정 비드 솔루션에 각 웰에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양할 수 있도록 합니다.
3. 조심스럽게 구슬을 방해하지 않도록 마이크로 파이펫으로 파라 포름알데히드를 제거하고 1 배 PBS로 구슬을 세 번 씻으라. 3.4 단계에 따라 버퍼를 준비합니다.
4. PBS 1x을 제거하고 각 웰에 준비된 버퍼의 250 μL을 추가합니다. 버퍼가 시각화전에 20분 동안 앉을 수 있도록 허용합니다.
5. 무대에 무엇이든 배치하기 전에 현미경 연결 버튼을 사용하여 3D 현미경에 연결하십시오. 목표에 100x 오일을 추가하고 목표 위에 우물의 중심을 배치합니다. 획득 설정에서 473 및 640 nm 난초 레이저를 켜고 보기를클릭합니다.
   1. 3D 렌즈가 활성화되지 않으면 이미지 표시 옵션의 Photon Counts를 클릭하여 광자 포화 설정 아래에서 구슬을 볼 수 있습니다. 초기 레이저 파워를 473 nm 레이저의 경우 8.4 mW로 설정하고 640 nm 레이저의 경우 11.6 mW로 설정합니다.
   2. 레이저의 초점을 약 -300 nm 또는 교정 구슬의 초점 평면으로 줄여 개별 구슬의 명확한 해상도를 생성합니다. Z-평면에 초점을 맞추면 레이저 전력 레벨을 조정하여 각 시야의 변동을 고려합니다.
6. 계측기 기능하에서 3D 매핑 교정 및 채널 매핑 보정을 완료하여 X축, Y 축 및 Z축에서 오류를 가져옵니다. 최대 FOV 수 20, 대상 포인트 수를 4,000점으로 설정하고 채널 매핑 교정 시 채널 간 최대 거리에서 5.0픽셀로 채널 간 제외 반지름을 설정합니다.
7. 교정이 >90%의 포인트 커버리지와 좋은 매핑 품질을 생성하도록 합니다. 향후 이미지 수집을 위해 지정된 교정 데이터를 저장합니다.

5 3차원의 EV 시각화

1. 목표에 100x 오일을 추가하고 준비된 EV를 현미경에 넣습니다. 3D 렌즈가 활성화되지 않고, 640 nm 흥분 레이저를 켜고 처음에는 신호및 시야의 강도에 따라 1.2 mW와 12.5 mW 사이로 올려 적막이 염색된 염색 된 EV를 자극한다.
   1. 이미지 표시 옵션에서 보기 메서드를 광자 채도에서 백분위수로 전환하여 TV를 더 잘 시각화합니다. 레이저 전원을 조정하여 노이즈를 최소화하고 신호를 최대화합니다. 다른 모든 매개 변수를 유지 관리합니다.
   2. Z축의 위쪽 또는 아래 쪽 아이콘을 클릭하여 Z 평면의 초점을 조정합니다.
      참고: Z-평면은 -200~350nm 사이에 초점을 맞추어야 하지만 시야에 따라 다릅니다.
2. 노출 시간을 20ms로 설정하고, 프레임 캡처는 10,000프레임으로, 초기 레이저 전력은 1.2mW와 12.5mW 사이로, 또는 5.1 단계에서 결정된 레이저 전력을 신호 및 시야의 강도에 따라 설정한다.
   1. 아이콘을 사용하여 3D 렌즈를 활성화하고 획득 버튼을 클릭하여 획득을 시작합니다.
3. 이미지 수집 전반에 걸쳐 레이저 전력을 1000프레임마다 10개씩 3배 증가하거나 높은 신호 대 잡음 비율을 유지할 수 있습니다. 획득 하는 동안 Z-평면을 조정 하지 마십시오.
   참고: 레이저는 최대 90mW 레이저 전력으로 올릴 수 있습니다.

6 인수 후 수정 및 EV 추적

1. 이미지 수집 후 보기 분석 창으로 전환합니다. 필터링되지 않은 이미지에서 드리프트 보정을 수행한 다음 필터를 활성화합니다. 표 1에따라 광자 수, 국소화 정밀도, 시그마 및 프레임 인덱스를 조정합니다.
2. 시야 및 내보내기 필드에서 개별 EV의 X축을 따라 XYZ 평면 보기 도구를 오버레이합니다. 포토스위칭 이벤트의 CSV 파일입니다.
3. Xx x 에서 개별 EV를 X x 별 시야의 비스분시로 정렬된 히스토그램 도구를 사용하여 사진 전환 이벤트를 설정된 거리 그룹으로 비합니다.
4. 단일 EV의 이미지를 가져와 파일을 .tiff 저장합니다.
5. Z축을 따라 배치에 따라 3D 시각화 도구와 색상을 사용하여 개별 EV의 3D 비디오를 만듭니다.

결과

이 연구의 목적은 3차원(3차원)으로 나노미터 해상도로 개별 전기를 시각화하는 초해상도 현미경 검사법의 효과를 평가하는 것이었습니다. 개별 EV의 모양과 크기를 분석하기 위해 광전환 가능한 염료를 채택하고 극한빨간색, 막 교화 염료로 전기를 배양하고^{크로마토그래피(29)를}통해 과잉 염료를 제거했습니다. 친화성 캡처 안티 CD81 및 적색 스테인드 전기는 640 nm 흥분 레이저에...

토론

전기자동차는 많은 세포내 프로세스 및 세포 간 신호^1,30에서중요한 역할을 하기 때문에 연구의 인기 영역이 되었다. 그러나, 그들의 시각화는 그들의 작은 크기가 빛 현미경 검사법의 회절 한계 이하로 떨어지기 때문에 어려운 것으로 판명됩니다. 직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법(dSTORM)은 시간이 지남에 따라 개별 형광의 광전환 이벤트를 캡처하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 µ-Slide 8 well plates	Ibidi	80827
1X PBS	Gibco	14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution	Gibco	15140-122
50 mL conical tube	Thermo Fisher	339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus	Genesee	25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter	Cytiva	29-0142-95
AKTA Flux S	Cytiva	29-0384-37
AKTA Start	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads	Thermo Fisher	10616D
B-cubed buffer	ONI	BCA0017
CellMask Red	Thermo Fisher	C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher	10566016
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Frac 30 Fraction collector	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0	Thermo Fisher	BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column	Cytiva	17548151
Molecular Biology Grade Water	Corning	9820003
Nanoimager	Oxford Nanoimaging	Custom
Paraformaldehhyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Polyethylene glycol	Thermo Fisher	BP233-1
RNase A	Promega	A797C
T175 Flasks	Genesee	25-211
Tetraspek microspheres	Invitrogen	T7279
Tris- HCl pH=7.5	Thermo Fisher	BP153-1
Unicorn V	Cytiva	29022094-ECOMINSSW