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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) viene utilizzata per bypassare il limite di diffrazione tipico della microscopia ottica e per visualizzare gli esosomi su scala nanometrica. Può essere impiegato sia in due che in tre dimensioni per caratterizzare gli esosomi.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) vengono rilasciate da tutti i tipi di cellule e svolgono un ruolo importante nella segnalazione cellulare e nell'omeostasi. La visualizzazione dei veicoli elettrici richiede spesso metodi indiretti a causa del loro piccolo diametro (40-250 nm), che è al di sotto del limite di diffrazione della tipica microscopia ottica. Abbiamo sviluppato una visualizzazione basata sulla microscopia a super-risoluzione dei veicoli elettrici per aggirare il limite di diffrazione in due e tre dimensioni. Usando questo approccio, possiamo risolvere la forma tridimensionale dei veicoli elettrici entro la risoluzione di +/- 20 nm sull'asse XY e la risoluzione di +/- 50 nm lungo l'asse Z. In conclusione, proponiamo che la microscopia a super-risoluzione sia considerata come un metodo di caratterizzazione dei veicoli elettrici, compresi gli esosomi, così come i virus avvolti.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono vescicole legate alla membrana rilasciate da tutti i tipi di cellule. Contengono lipidi, proteine, metaboliti e acidi nucleici e trasferiscono questi materiali localmente tra le cellule e distalmente tra tessuti e organi. Esistono tre sottotipi principali di veicoli elettrici: corpi apoptotici, microvescicole ed esosomi1,2. Qui, concentriamo la nostra discussione sugli esosomi e le loro proteine associate.

Gli esosomi sono vescicole secrete provenienti dal germogliamento verso l'interno dei primi endosomi nel corpo multivesicolare (MVB). L'MVB si fonde quindi con la membrana plasmatica, rilasciando gli esosomi nello spazio extracellulare per viaggiare verso altre cellule3,4. Gli esosomi esistono su uno spettro di dimensioni che va da 40 a 150 nm e sono arricchiti con proteine transmembrana endosomiali note come tetraspanine (CD9, CD63, CD81), complesso di selezione endosomiale legato alla membrana necessario per il trasporto (ESCRT) e proteine associate a zattere lipidiche1,2,5,6,7.

Caratterizzare la composizione biochimica degli esosomi è diventato un campo popolare per i ricercatori per comprendere meglio la loro natura funzionale. Esistono molti metodi per visualizzare e caratterizzare gli esosomi, tra cui la citometria a flusso su scala nanometrica, l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), la microscopia elettronica a scansione e trasmissione (TEM), la risonanza plasmonica di superficie, il rilevamento di impulsi resistivi e la microscopia ottica tradizionale, ognuno dei quali contiene pro e contro intrinseci8,9. TEM e cryo-EM possono raggiungere una risoluzione basata su nanometri, ma spesso richiedono fasi di disidratazione e congelamento-frattura, riducendo o lisando così i veicoli elettrici10,11. NTA si basa sulla diffusione della luce, consentendo la caratterizzazione di centinaia di veicoli elettrici alla volta, ma è una misura indiretta della dimensione delle particelle e non può facilmente distinguere tra EV, virus e aggregati proteici12,13,14,15,16. La citometria a flusso su scala nanometrica impiega la diffusione della luce da un percorso di eccitazione, che può quindi essere tradotto in misurazioni delle dimensioni, ma è una tecnologia emergente, e c'è poco consenso su quale dimensione delle particelle siano all'interno del range lineare di rilevamento per vari strumenti12,17,18.

La microscopia ottica tradizionale che utilizza proteine fluorescenti o coloranti è stata una delle tecniche più utilizzate per visualizzare compartimenti subcellulari, complessi proteici e macchinari di segnalazione all'interno di una cellula. Mentre questa tecnica si rivela utile nella visualizzazione della localizzazione di complessi, il limite di diffrazione della microscopia ottica tradizionale (circa 250-400 nm) impedisce la chiara risoluzione di proteine o strutture nell'intervallo di dimensioni tipiche di un esosoma (40-150 nm)12,19,20.

La microscopia a super-risoluzione, ovvero la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM), si distingue dalla microscopia ottica convenzionale impiegando le proprietà fotocommutabili di specifici fluorofori e rilevando questi eventi lampeggianti per ricostruire le immagini fino alla precisione nanometrica21. Gli eventi di photoswitching vengono raccolti utilizzando una telecamera di rilevamento ad alto framerate nel corso di decine di migliaia di esposizioni individuali e viene utilizzata una funzione di diffusione puntuale per mappare con elevata sicurezza la posizione esatta del fluoroforofotoregistratore 19,20,22. Ciò consente a dSTORM di aggirare il limite di diffrazione della microscopia ottica. Diversi gruppi hanno riportato l'uso di tecniche di super-risoluzione per visualizzare e tracciare gli esosomi e le loro proteine associate22,23,24,25. La risoluzione finale dipende dalle proprietà biofisiche del fluoroforo, ma spesso varia da +/-10-100 nm lungo l'asse XY, consentendo la risoluzione a singola molecola.

La capacità di risolvere singoli fluorofori su questa scala sull'asse XY ha rivoluzionato la microscopia. Tuttavia, ci sono pochi dati sul dSTORM tridimensionale (3-D) di un esosoma. Pertanto, abbiamo cercato di stabilire una procedura operativa standard (SOP) per la visualizzazione e la caratterizzazione basate su dSTORM di veicoli elettrici purificati, inclusi gli esosomi con precisione nanometrica in 3D.

Protocollo

1 Propagazione e manutenzione delle linee cellulari

  1. Acquisire cellule di osteosarcoma umano (U2OS) e posizionare le cellule nel mezzo di crescita integrato con siero bovino fetale privo di esosomi al 10% e 1 soluzione di penicillina / streptomicina.
    NOTA: Il siero bovino fetale privo di esosomi è stato generato seguendo il protocollo presentato in McNamara et. al.26.
  2. Mantenere le celle U2OS in un incubatore rivestito di rame a 37 °C nel 5% di CO2 e le celle di passaggio in palloni T17526,27. Le cellule devono essere mantenute nella fase di crescita logaritmica media per evitare l'insorgere di sottopopolazioni o dall'accumulo di detriti apoptotici durante la fase stazionaria.

2 Isolamento e purificazione degli esosomi

  1. Far crescere le linee cellulari U2OS fino alla piena confluenza in 10 palloni T175 separati con 50 ml di supporti per pallone. Rimuovere il surnatante cellulare e successivamente passarlo attraverso un apparato di filtrazione sottovuoto da 0,45 μm e 0,22 μm.
  2. Sottoporre il surnatante alla filtrazione a flusso incrociato (nota anche come filtrazione a flusso tangenziale) su un sistema di filtrazione dotato della cartuccia a fibra cava da 750 kDa al fine di rimuovere proteine o metaboliti più piccoli28.
    1. Passare il surnatante attraverso l'operatore di filtrazione a flusso tangenziale a una pressione in avanti costante di 30 psi, mantenendo una pressione di ritenzione di <20 psi per produrre una pressione Δ di 10 o più psi. Posizionare una barra di agitazione magnetica nel serbatoio del retentato e impostare su 150 rpm26.
    2. Mantenere la velocità di avanzamento a 40 ml/min o superiore. Raccogliere il permeato in un serbatoio e smaltirlo.
  3. Concentrare il surnatante a 30 ml e quindi equilibrare con quattro volumi di 1x PBS. Raccogliere la soluzione filtrata ed equilibrata a flusso incrociato in un tubo conico da 50 ml.
  4. Precipitare i veicoli elettrici a 4 °C durante la notte in una concentrazione finale di 40 mg/mL di polietilenglicole con un peso molecolare di 8.000 Da. Centrifugare i veicoli elettrici a 1.200 x g a 4 °C per 1 ora e risospendere in 500 μL di 1x PBS.
  5. Incubare i veicoli elettrici con 50 μg/mL di colorante intercalante a membrana rossa fotocomveggibile e 50 μg/mL di RNasi A in 1x PBS a 4 °C per 1 ora.
  6. Rimuovere il colorante in eccesso attraverso una colonna su un sistema di purificazione delle proteine collegato a un collettore di frazioni. Identificare le frazioni EV attraverso l'assorbanza UV e raggrupparle in un tubo microcentrifuga26.
  7. Affinità-selezionare un totale di 200 μL di veicoli elettrici utilizzando perline magnetiche anti-CD81 bilanciate in 1x PBS.
    1. Diluire 100 μL delle perle magnetiche anti-CD81 in 1x PBS per un volume totale di 1 mL e lasciarle legare a 4 °C per 2 ore in un tubo microcentrifuga da 2 mL con oscillazione continua.
  8. Lavare le perline anti-CD81 e EV tre volte con 1x PBS. Elute CD81+ EV dalla soluzione con 100 mM di glicina a pH 2,0 per 30 minuti a 37 °C.
  9. Pipettare il CD81+ EV purificato in un volume uguale di 100 mM Tris-HCl a pH 7,5 in 1x PBS.
    NOTA: Un'aliquota della soluzione purificata CD81+ EV può essere riservata all'analisi di tracciamento delle nanoparticelle o alla microscopia elettronica al fine di confermare la purezza della soluzione e la presenza di EV26.

3 Fissazione e preparazione

  1. Posizionare i veicoli elettrici purificati per affinità su lastre a 8 pozzetti con fondo di vetro μ-slide in un volume totale di 200 μL (può diluire il campione EV in 100 mM Tris-HCl a pH 7,5 in 1x PBS) e consentire di aderire alla superficie durante la notte a 4 °C.
  2. Senza rimuovere la soluzione esistente dalla piastra a 8 pozzetti, fissare i veicoli elettrici sulle piastre aggiungendo 200 μL di paraformaldeide al 4% in 1x PBS alla soluzione contenente EV in ciascun pozzetto e consentire l'incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente21.
  3. Rimuovere con attenzione la paraformaldeide e la soluzione in eccesso con una micropipetta per non disturbare i veicoli elettrici. Lavare l'EV con 1x PBS per rimuovere l'eccesso di paraformaldeide. Eseguire la procedura di lavaggio tre volte. Rimuovere l'eccesso di 1x PBS.
  4. Preparare 250 μL di soluzione tampone a cubetti di dSTORM B per campione creando una soluzione di 5 mM di protocatechuate diossigenasi (Parte A) diluita in tampone di imaging (Parte B) secondo il protocollo del produttore.
    NOTA: la concentrazione dell'enzima nel tampone può essere raddoppiata a 10 mM se si verifica il fotosbiancamento.
    1. Aggiungere 250 μL del tampone preparato a ciascun pozzetto secondo il protocollo del produttore per 20 minuti a temperatura ambiente prima dell'imaging per eliminare le molecole ossidanti.
      NOTA: l'EV può quindi essere visualizzato immediatamente o conservato a 4 °C per un massimo di una settimana. Sostituire il buffer successivo all'archiviazione prima di ogni visualizzazione.

4 Calibrazione diretta al microscopio a ricostruzione ottica stocastica

  1. Preparare le perline necessarie per la calibrazione del microscopio a super-risoluzione diluendo microsfere da 100 nm ad una concentrazione dello 0,5% in acqua di grado di biologia molecolare e pipettando 200 μL in ciascun pozzetto di una piastra a 8 pozzetti con fondo di vetro μ vetrino.
    1. Lasciare che le perline si depositino nei pozzetti per 1 ora a temperatura ambiente.
  2. Senza rimuovere la soluzione esistente, aggiungere 200 μL di paraformaldeide al 4% in PBS a ciascun pozzetto alla soluzione di perline di calibrazione e consentire l'incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere con cura la paraformaldeide con una micropipetta per non disturbare le perline e lavare le perline tre volte con 1x PBS. Preparare il buffer secondo il passaggio 3.4.
  4. Rimuovere 1x PBS e aggiungere 250 μL del tampone preparato a ciascun pozzetto. Consentire al buffer di rimanere per 20 minuti prima della visualizzazione.
  5. Prima di posizionare qualsiasi cosa sul palco, collegarsi al microscopio 3D utilizzando il pulsante Collega il microscopio. Aggiungi olio 100x all'obiettivo e posiziona il centro del pozzo sopra l'obiettivo. Nell'impostazione Acquisisci, attiva i laser di eccitazione a 473 e 640 nm e fai clic su Visualizza.
    1. Senza l'obiettivo 3D attivato, visualizzare le perline sotto l'impostazione di saturazione dei fotoni facendo clic su Conteggi fotoni nelle opzioni di visualizzazione delle immagini. Impostare le potenze laser iniziali su 8,4 mW per il laser a 473 nm e a 11,6 mW per il laser a 640 nm.
    2. Ridurre la messa a fuoco del laser a circa -300 nm o il piano focale delle perle di calibrazione per produrre una chiara risoluzione delle singole perle. Una volta che il piano Z è focalizzato, regolare ulteriormente i livelli di potenza del laser per tenere conto della variazione in ciascun campo visivo.
  6. Sotto le funzioni dello strumento, completare la calibrazione della mappatura 3D e la calibrazione della mappatura dei canali per ottenere gli errori sugli assi X, Y e Z. Impostare il numero massimo di FOV su 20, il numero target di punti su 4.000, la distanza massima tra i canali a 5,0 pixel e il raggio di esclusione tra i canali a 10,0 pixel durante la calibrazione della mappatura dei canali.
  7. Assicurarsi che la calibrazione produca una copertura puntuale del >90% e una qualità di mappatura buona. Salvare i dati di calibrazione forniti per future acquisizioni di immagini.

5 Visualizzazione di EV in tre dimensioni

  1. Aggiungere olio 100x sull'obiettivo e posizionare i veicoli elettrici preparati nel microscopio. Senza l'obiettivo 3D attivato, accendere il laser di eccitazione a 640 nm e inizialmente sollevarlo tra 1,2 mW e 12,5 mW a seconda dell'intensità del segnale e del campo visivo per eccitare i veicoli elettrici colorati con colorante intercalante a membrana rossa.
    1. Nelle opzioni Visualizzazione immagine, cambia il metodo di visualizzazione dalla saturazione dei fotoni ai percentili per visualizzare meglio i veicoli elettrici. Regola la potenza del laser per ridurre al minimo il rumore, massimizzando al contempo il segnale. Mantenere tutti gli altri parametri.
    2. Regolate la messa a fuoco del piano Z facendo clic sull'icona su o giù sull'asse Z.
      NOTA: il piano Z deve essere focalizzato tra -200 e -350 nm, ma varia a seconda del campo visivo.
  2. Impostare il tempo di esposizione a 20 ms, l'acquisizione del fotogramma a 10.000 fotogrammi e la potenza laser iniziale tra 1,2 mW e 12,5 mW o la potenza laser determinata nel passaggio 5.1, a seconda dell'intensità del segnale e del campo visivo.
    1. Attivare l'obiettivo 3D utilizzando l'icona e avviare l'acquisizione facendo clic sul pulsante Acquisisci.
  3. Durante l'acquisizione delle immagini, aumentare la potenza del laser di 3 incrementi di 10 ogni 1000 fotogrammi, o abbastanza per mantenere un elevato rapporto segnale-rumore. Non regolare il piano Z durante l'acquisizione.
    NOTA: il laser può essere sollevato fino a un massimo di 90 mW di potenza laser.

6 Modifica post-acquisizione e tracciamento EV

  1. Dopo l'acquisizione dell'immagine, passare alla finestra di visualizzazione Analizza. Eseguire la correzione della deriva sull'immagine non filtrata, quindi attivare i filtri. Regolare il conteggio dei fotoni, la precisione di localizzazione, i sigma e l'indice del fotogramma in base alla Tabella 1.
  2. Sovrapporre uno strumento di visualizzazione piana XYZ lungo l'asse X dei singoli veicoli elettrici dal campo visivo ed esportare . File CSV di eventi di photoswitching.
  3. Taglia in due singoli veicoli elettrici sull'asse XY in un campo visivo X per Y utilizzando uno strumento di istogramma lineare, che raccoglie gli eventi di fotointerruttoria in gruppi di distanza impostati.
  4. Scatta immagini di singoli veicoli elettrici e salvali come file .tiff.
  5. Crea video 3D di singoli veicoli elettrici utilizzando uno strumento di visualizzazione 3D e colora in base al posizionamento lungo l'asse Z.

Risultati

L'obiettivo di questo studio era valutare l'efficacia della microscopia a super-risoluzione nella visualizzazione di singoli veicoli elettrici con risoluzione nanometrica in tre dimensioni (3-D). Per analizzare la forma e le dimensioni dei singoli veicoli elettrici, abbiamo impiegato un colorante fotointercabilibile e incubato i veicoli elettrici con un colorante intercalante a membrana di colore rosso lontano e rimosso il colorante in eccesso attraverso la cromatografia29. I veicoli elettrici ant...

Discussione

I veicoli elettrici sono diventati un'area di studio popolare a causa del loro importante ruolo in molti processi intracellulari e nella segnalazione da cellula a cellula1,30. Tuttavia, la loro visualizzazione si rivela difficile in quanto le loro piccole dimensioni scendono al di sotto del limite di diffrazione della microscopia ottica. La microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) è un metodo diretto di visualizzazione che aggira il limite ...

Divulgazioni

M.G.C. non ha conflitti di interesse da dichiarare. R.P.M e D.P.D. ricevono supporto materiale da Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. e Cytiva Inc. (ex GE Healthcare). R.P.M. e D.P.D. dichiarano interessi concorrenti per l'eventuale commercializzazione di alcune delle informazioni presentate. Questi sono gestiti dall'Università della Carolina del Nord. Le fonti di finanziamento non sono state coinvolte nelle interpretazioni o nella scrittura di questo manoscritto.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare Oxford Nanoimaging per il loro feedback costruttivo e la guida. Questo lavoro è stato finanziato dal 5UM1CA121947-10 a R.P.M. e dal 1R01DA040394 al D.P.D.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
15 µ-Slide 8 well platesIbidi80827
1X PBSGibco14190-144
1X Penicillin Streptomycin solutionGibco15140-122
50 mL conical tubeThermo Fisher339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatusGenesee25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filterCytiva29-0142-95
AKTA Flux SCytiva29-0384-37
AKTA StartCytiva29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beadsThermo Fisher10616D
B-cubed bufferONI BCA0017
CellMask RedThermo FisherC10046
Dubelco's Modified Eagle MediumThermo Fisher10566016
Fetal Bovine SerumVWR97068-085
Frac 30 Fraction collectorCytiva29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0Thermo FisherBP381-5
HiTrap CaptoCore 700 ColumnCytiva17548151
Molecular Biology Grade WaterCorning9820003
NanoimagerOxford NanoimagingCustom
ParaformaldehhydeElectron Microscopy Sciences15710
Polyethylene glycolThermo FisherBP233-1
RNase APromegaA797C
T175 FlasksGenesee25-211
Tetraspek microspheresInvitrogenT7279
Tris- HCl pH=7.5Thermo FisherBP153-1
Unicorn VCytiva29022094-ECOMINSSW

Riferimenti

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