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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) est utilisée pour contourner la limite de diffraction typique de la microscopie optique et pour visualiser les exosomes à l’échelle nanométrique. Il peut être utilisé en deux et trois dimensions pour caractériser les exosomes.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont libérées par tous les types de cellules et jouent un rôle important dans la signalisation cellulaire et l’homéostasie. La visualisation des véhicules électriques nécessite souvent des méthodes indirectes en raison de leur petit diamètre (40-250 nm), qui est inférieur à la limite de diffraction de la microscopie optique typique. Nous avons développé une visualisation des véhicules électriques basée sur la microscopie à super-résolution pour contourner la limite de diffraction en deux et trois dimensions. En utilisant cette approche, nous pouvons résoudre la forme tridimensionnelle des véhicules électriques à une résolution de +/- 20 nm sur l’axe XY et à une résolution de +/- 50 nm le long de l’axe Z. En conclusion, nous proposons que la microscopie à super-résolution soit considérée comme une méthode de caractérisation des VE, y compris les exosomes, ainsi que des virus enveloppés.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des vésicules liées à la membrane libérées par tous les types de cellules. Ils contiennent des lipides, des protéines, des métabolites et des acides nucléiques et transfèrent ces matériaux localement entre les cellules et distalement entre les tissus et les organes. Il existe trois sous-types primaires de VE : les corps apoptotiques, les microvésicules et les exosomes1,2. Ici, nous concentrons notre discussion sur les exosomes et leurs protéines associées.

Les exosomes sont des vésicules sécrétées provenant du bourgeonnement vers l’intérieur des endosomes précoces dans le corps multivésiculeux (MVB). Le MVB fusionne ensuite avec la membrane plasmique, libérant les exosomes dans l’espace extracellulaire pour se déplacer vers d’autres cellules3,4. Les exosomes existent sur un spectre de tailles allant de 40 à 150 nm et sont enrichis de protéines transmembranaires endosomales appelées tétraspanines (CD9, CD63, CD81), de complexe de tri endosomal lié à la membrane nécessaire au transport (ESCRT) et de protéines associées au radeau lipidique1,2,5,6,7.

La caractérisation de la composition biochimique des exosomes est devenue un domaine populaire pour les chercheurs afin de mieux comprendre leur nature fonctionnelle. De nombreuses méthodes existent pour visualiser et caractériser les exosomes, y compris la cytométrie en flux à l’échelle nanométrique, l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), la microscopie électronique à balayage et à transmission (TEM), la résonance plasmonique de surface, la détection d’impulsions résistives et la microscopie optique traditionnelle, chacune contenant des avantages et des inconvénients intrinsèques8,9. Tem et cryo-EM peuvent atteindre une résolution basée sur le nanomètre, mais nécessitent souvent des étapes de déshydratation et de congélation-rupture, rétrécissant ou lysant ainsi les VÉHICULESélectriques 10,11. NTA repose sur la diffusion de la lumière, permettant la caractérisation de centaines de VE à la fois, mais est une mesure indirecte de la taille des particules et ne peut pas facilement distinguer entre les VE, les virus et les agrégats de protéines12,13,14,15,16. La cytométrie en flux à l’échelle nanométrique utilise la diffusion de la lumière à partir d’un chemin d’excitation, qui peut ensuite être traduite en mesures de taille, mais il s’agit d’une technologie émergente, et il existe peu de consensus sur la taille des particules dans la plage linéaire de détection pour divers instruments12,17,18.

La microscopie optique traditionnelle utilisant des protéines ou des colorants fluorescents a été l’une des techniques les plus utilisées pour visualiser les compartiments subcellulaires, les complexes protéiques et les mécanismes de signalisation au sein d’une cellule. Bien que cette technique s’avère utile pour visualiser la localisation des complexes, la limite de diffraction de la microscopie optique traditionnelle (environ 250-400 nm) empêche la résolution claire des protéines ou des structures dans la gamme de taille typique d’un exosome (40-150 nm)12,19,20.

La microscopie à super-résolution, à savoir la microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM), se distingue de la microscopie optique conventionnelle en utilisant les propriétés photoscommutables de fluorophores spécifiques et en détectant ces événements clignotants pour reconstruire des images jusqu’à une précision nanométrique21. Les événements de commutation de photos sont collectés à l’aide d’une caméra de détection à fréquence d’images élevée au cours de dizaines de milliers d’expositions individuelles, et une fonction d’étalement de points est utilisée pour cartographier avec une grande confiance l’emplacement exact du fluorophore de commutation de photos19,20,22. Cela permet à dSTORM de contourner la limite de diffraction de la microscopie optique. Plusieurs groupes ont signalé l’utilisation de techniques de super-résolution pour visualiser et suivre les exosomes et leurs protéines associées22,23,24,25. La résolution finale dépend des propriétés biophysiques du fluorophore, mais varie souvent de +/-10 à 100 nm le long de l’axe XY, ce qui permet une résolution à molécule unique.

La capacité de résoudre les fluorophores individuels à cette échelle sur l’axe XY a révolutionné la microscopie. Cependant, il existe peu de données sur le dSTORM tridimensionnel (3D) d’un exosome. Par conséquent, nous avons cherché à établir une procédure d’exploitation standard (SOP) pour la visualisation et la caractérisation basées sur dSTORM des véhicules électriques purifiés, y compris les exosomes à la précision nanométrique en 3D.

Protocole

1 Propagation et entretien des lignées cellulaires

  1. Acquérir des cellules d’ostéosarcome humain (U2OS) et placer les cellules dans le milieu de croissance complété par 10% de sérum fœtal bovin sans exosome et 1x solution de pénicilline / streptomycine.
    REMARQUE: Le sérum fœtal bovin sans exosomes a été généré conformément au protocole présenté dans McNamara et. al.26.
  2. Maintenir les cellules U2OS dans un incubateur revêtu de cuivre à 37 °C dans 5% de CO2 et les cellules de passage dans des flacons de T17526,27. Les cellules doivent être maintenues en phase de croissance mi-logarithmique pour empêcher l’apparition de sous-populations ou l’accumulation de débris apoptotiques pendant la phase stationnaire.

2 Isolement et purification des exosomes

  1. Cultivez les lignées cellulaires U2OS jusqu’à leur pleine confluence dans 10 flacons T175 distincts avec 50 mL de milieu par flacon. Retirez le surnageant de la cellule et passez-le successivement à travers un appareil de filtration sous vide de 0,45 μm et 0,22 μm.
  2. Soumettre le surnageant à une filtration à flux croisé (également appelée filtration à flux tangentiel) sur un système de filtration équipé de la cartouche à fibres creuses de 750 kDa afin d’éliminer les protéines ou métabolites plus petits28.
    1. Faire passer le surnageant à travers l’opérateur de filtration à écoulement tangentiel à une pression avant constante de 30 psi, tout en maintenant une pression de rétention de <20 psi pour produire une pression Δ de 10 psi ou plus. Placez une barre d’agitation magnétique dans le réservoir de rétentat et réglez à 150 tr/min26.
    2. Maintenir la vitesse d’alimentation à 40 mL/min ou plus. Recueillir le perméat dans un réservoir et l’éliminer.
  3. Concentrer le surnageant à 30 mL, puis équilibrer avec quatre volumes de 1x PBS. Recueillir la solution filtrée et équilibrée à flux croisé dans un tube conique de 50 mL.
  4. Précipiter les VE à 4 °C pendant la nuit à une concentration finale de 40 mg/mL de polyéthylène glycol d’un poids moléculaire de 8 000 Da. Centrifuger les VE à 1 200 x g à 4 °C pendant 1 h et remettre en suspension dans 500 μL de 1x PBS.
  5. Incuber les VE avec 50 μg/mL de colorant d’intercalage à membrane rouge photoscommutable et 50 μg/mL de RNase A dans 1x PBS à 4 °C pendant 1 h.
  6. Enlevez l’excès de colorant à travers une colonne sur un système de purification des protéines attaché à un collecteur de fractions. Identifier les fractions EV grâce à l’absorbance UV et les regrouper dans un tube de microcentrifugation26.
  7. Sélectionnez par affinité un total de 200 μL de véhicules électriques à l’aide de billes magnétiques anti-CD81 équilibrées en 1x PBS.
    1. Diluer 100 μL des billes magnétiques anti-CD81 dans 1x PBS à un volume total de 1 mL et les laisser se lier à 4 °C pendant 2 h dans un tube de microcentrifugation de 2 mL à bascule continue.
  8. Lavez les billes anti-CD81 et EV trois fois avec 1x PBS. Elute CD81+ EV de la solution avec 100 mM de glycine à pH 2,0 pendant 30 min à 37 °C.
  9. Pipette le CD81+ EV purifié dans un volume égal de 100 mM Tris-HCl à pH 7,5 dans 1x PBS.
    REMARQUE: Une aliquote de solution purifiée de CD81+ EV peut être réservée à l’analyse de suivi des nanoparticules ou à la microscopie électronique afin de confirmer la pureté de la solution et la présence de VE26.

3 Fixation et préparation

  1. Placer les véhicules électriques purifiés par affinité sur des plaques de 8 puits à fond de verre μ-glissière dans un volume total de 200 μL (peut diluer l’échantillon EV dans 100 mM Tris-HCl à pH 7,5 dans 1x PBS) et laisser adhérer à la surface pendant la nuit à 4 ° C.
  2. Sans retirer la solution existante de la plaque à 8 puits, fixez les VE sur les plaques en ajoutant 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans 1x PBS à la solution contenant du VE dans chaque puits et laissez incuber pendant 30 min à température ambiante21.
  3. Retirez soigneusement le paraformaldéhyde et l’excès de solution à l’aide d’une micropipette afin de ne pas déranger les VE. Lavez le VE avec 1x PBS pour éliminer l’excès de paraformaldéhyde. Effectuez la procédure de lavage trois fois. Retirez l’excès de 1x PBS.
  4. Préparer 250 μL de solution tampon cubée dSTORM B par échantillon en créant une solution de 5 mM de protocatéchuate dioxygénase (partie A) diluée dans un tampon d’imagerie (partie B) selon le protocole du fabricant.
    REMARQUE: La concentration de l’enzyme dans le tampon peut être doublée à 10 mM en cas de photoblanchiment.
    1. Ajouter 250 μL du tampon préparé à chaque puits selon le protocole du fabricant pendant 20 min à température ambiante avant l’imagerie pour piéger les molécules oxydantes.
      REMARQUE: Le VE peut alors être visualisé immédiatement ou stocké à 4 ° C pendant une semaine. Remplacez la mémoire tampon après le stockage avant chaque visualisation.

4 Calibrage direct de la microscopie par reconstruction optique stochastique

  1. Préparer les billes nécessaires à l’étalonnage du microscope à super-résolution en diluant des microsphères de 100 nm à une concentration de 0,5 % dans de l’eau de qualité biologie moléculaire et en pipetant 200 μL dans chaque puits d’une plaque de 8 puits à fond de verre μ lame.
    1. Laisser les perles se déposer dans les puits pendant 1 h à température ambiante.
  2. Sans retirer la solution existante, ajouter 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS à chaque puits de la solution de billes d’étalonnage et laisser incuber pendant 30 min à température ambiante.
  3. Retirez soigneusement le paraformaldéhyde avec une micropipette pour ne pas déranger les perles et lavez les perles trois fois avec 1x PBS. Préparez le tampon conformément à l’étape 3.4.
  4. Retirez 1x PBS et ajoutez 250 μL du tampon préparé à chaque puits. Laissez la mémoire tampon reposer pendant 20 minutes avant la visualisation.
  5. Avant de placer quoi que ce soit sur la scène, connectez-vous au microscope 3D à l’aide du bouton Connecter le microscope. Ajoutez 100x d’huile à l’objectif et placez le centre du puits au-dessus de l’objectif. Dans le paramètre Acquérir, allumez les lasers d’excitation 473 et 640 nm et cliquez sur Afficher.
    1. Sans l’objectif 3D activé, visualisez les perles sous le paramètre de saturation des photons en cliquant sur Nombre de photons dans les options d’affichage de l’image. Réglez les puissances laser initiales à 8,4 mW pour le laser 473 nm et à 11,6 mW pour le laser 640 nm.
    2. Diminuez la mise au point du laser à environ -300 nm ou le plan focal des perles d’étalonnage pour produire une résolution claire des perles individuelles. Une fois le plan Z mis au point, ajustez davantage les niveaux de puissance du laser pour tenir compte de la variation dans chaque champ de vision.
  6. Sous les fonctions de l’instrument, effectuez l’étalonnage de la cartographie 3D et l’étalonnage de la cartographie des canaux pour obtenir les erreurs sur les axes X, Y et Z. Définissez le nombre maximal de FOV sur 20, le nombre cible de points sur 4 000, la distance maximale entre les canaux sur 5,0 pixels et le rayon d’exclusion entre les canaux sur 10,0 pixels lors de l’étalonnage du mappage des canaux.
  7. Assurez-vous que l’étalonnage produit une couverture ponctuelle de >90 % et une qualité de cartographie bonne. Enregistrez les données d’étalonnage données pour de futures acquisitions d’images.

5 Visualisation du VE en trois dimensions

  1. Ajoutez 100x d’huile sur l’objectif et placez les véhicules électriques préparés dans le microscope. Sans la lentille 3D activée, allumez le laser d’excitation de 640 nm et augmentez-le initialement entre 1,2 mW et 12,5 mW en fonction de l’intensité du signal et du champ de vision pour exciter les véhicules électriques colorés par colorant intercalé de membrane rouge.
    1. Sous les options d’affichage de l’image, basculez la méthode de visualisation de la saturation des photons aux percentiles pour mieux visualiser les véhicules électriques. Ajustez la puissance du laser pour minimiser le bruit, tout en maximisant le signal. Conservez tous les autres paramètres.
    2. Ajustez la mise au point du plan Z en cliquant sur l’icône haut ou bas sur l’axe Z.
      REMARQUE: Le plan Z doit être focalisé entre -200 et -350 nm, mais varie en fonction du champ de vision.
  2. Réglez le temps d’exposition à 20 ms, la capture d’image à 10 000 images et la puissance laser initiale entre 1,2 mW et 12,5 mW, ou la puissance laser déterminée à l’étape 5.1, en fonction de l’intensité du signal et du champ de vision.
    1. Activez l’objectif 3D à l’aide de l’icône et démarrez l’acquisition en cliquant sur le bouton Acquérir.
  3. Tout au long de l’acquisition d’images, augmentez la puissance du laser de 3 incréments de 10 toutes les 1000 images, soit suffisamment pour maintenir un rapport signal/bruit élevé. N’ajustez pas le plan Z pendant l’acquisition.
    REMARQUE: Le laser peut être porté à une puissance laser maximale de 90 mW.

6 Modification post-acquisition et traçage EV

  1. Après l’acquisition de l’image, basculez vers la fenêtre d’affichage Analyser. Effectuez une correction de dérive sur l’image non filtrée, puis activez les filtres. Ajustez le nombre de photons, la précision de localisation, les sigmas et l’indice de trame conformémentau tableau 1 .
  2. Superposer un outil de vue plane XYZ le long de l’axe X de véhicules électriques individuels à partir du champ de vision et exporter . Fichiers CSV d’événements de commutation de photos.
  3. Coupez en deux des véhicules électriques individuels sur l’axe XY dans un champ de vision X par Y à l’aide d’un outil d’histogramme de ligne, qui regroupe les événements de commutation de photos dans des groupes de distance définis.
  4. Prenez des images de véhicules électriques individuels et enregistrez-les en tant que fichiers .tiff.
  5. Créez des vidéos 3D de véhicules électriques individuels à l’aide d’un outil de visualisation 3D et colorez en fonction de leur emplacement le long de l’axe Z.

Résultats

L’objectif de cette étude était d’évaluer l’efficacité de la microscopie à super-résolution dans la visualisation de véhicules électriques individuels avec une résolution nanométrique en trois dimensions (3D). Pour analyser la forme et la taille des véhicules électriques individuels, nous avons utilisé un colorant photoscommutable et incubé les véhicules électriques avec un colorant intercalant membranaire rouge lointain et éliminé l’excès de colorant par chromatographie29

Discussion

Les VE sont devenus un domaine d’étude populaire en raison de leur rôle important dans de nombreux processus intracellulaires et la signalisation de cellule à cellule1,30. Cependant, leur visualisation s’avère difficile car leur petite taille tombe en dessous de la limite de diffraction de la microscopie optique. La microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) est une méthode directe de visualisation qui contourne la limite de diff...

Déclarations de divulgation

M.G.C. n’a aucun conflit d’intérêts à déclarer. R.P.M et D.P.D. reçoivent un soutien matériel d’Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. et de Cytiva Inc. (anciennement GE Healthcare). R.P.M. et D.P.D. déclarent des intérêts concurrents pour la commercialisation éventuelle de certaines des informations présentées. Ceux-ci sont gérés par l’Université de Caroline du Nord. Les sources de financement n’ont pas participé à l’interprétation ou à la rédaction de ce manuscrit.

Remerciements

Nous tenons à remercier Oxford Nanoimaging pour ses commentaires constructifs et ses conseils. Ce travail a été financé par le 5UM1CA121947-10 à R.P.M. et le 1R01DA040394 à D.P.D.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
15 µ-Slide 8 well platesIbidi80827
1X PBSGibco14190-144
1X Penicillin Streptomycin solutionGibco15140-122
50 mL conical tubeThermo Fisher339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatusGenesee25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filterCytiva29-0142-95
AKTA Flux SCytiva29-0384-37
AKTA StartCytiva29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beadsThermo Fisher10616D
B-cubed bufferONI BCA0017
CellMask RedThermo FisherC10046
Dubelco's Modified Eagle MediumThermo Fisher10566016
Fetal Bovine SerumVWR97068-085
Frac 30 Fraction collectorCytiva29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0Thermo FisherBP381-5
HiTrap CaptoCore 700 ColumnCytiva17548151
Molecular Biology Grade WaterCorning9820003
NanoimagerOxford NanoimagingCustom
ParaformaldehhydeElectron Microscopy Sciences15710
Polyethylene glycolThermo FisherBP233-1
RNase APromegaA797C
T175 FlasksGenesee25-211
Tetraspek microspheresInvitrogenT7279
Tris- HCl pH=7.5Thermo FisherBP153-1
Unicorn VCytiva29022094-ECOMINSSW

Références

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