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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) wird verwendet, um die typische Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und Exosomen auf der Nanometerskala zu betrachten. Es kann sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen eingesetzt werden, um Exosomen zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden von allen Zelltypen freigesetzt und spielen eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung und Homöostase. Die Visualisierung von EVs erfordert aufgrund ihres geringen Durchmessers (40-250 nm), der unterhalb der Beugungsgrenze der typischen Lichtmikroskopie liegt, oft indirekte Methoden. Wir haben eine hochauflösende mikroskopiebasierte Visualisierung von Elektrofahrzeugen entwickelt, um die Beugungsgrenze sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen zu umgehen. Mit diesem Ansatz können wir die dreidimensionale Form von Elektrofahrzeugen auf eine Auflösung von +/- 20 nm auf der XY-Achse und eine Auflösung von +/- 50 nm entlang der Z-Achse auflösen. Zusammenfassend schlagen wir vor, dass die hochauflösende Mikroskopie als Charakterisierungsmethode für EVs, einschließlich Exosomen, sowie von behüllten Viren betrachtet wird.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membrangebundene Vesikel, die von allen Zelltypen freigesetzt werden. Sie enthalten Lipide, Proteine, Metaboliten und Nukleinsäuren und übertragen diese Materialien lokal zwischen Zellen und distal zwischen Geweben und Organen. Es gibt drei primäre Subtypen von EVs: apoptotische Körper, Mikrovesikel und Exosomen1,2. Hier konzentrieren wir unsere Diskussion auf Exosomen und ihre assoziierten Proteine.

Exosomen sind sezernierte Vesikel, die aus dem nach innen gerichteten Austrieb früher Endosomen in den multivesikulären Körper (MVB) stammen. Das MVB verschmilzt dann mit der Plasmamembran und setzt die Exosomen in den extrazellulären Raum frei, um zu anderen Zellen zu gelangen3,4. Exosomen existieren in einem Spektrum von Größen von 40 bis 150 nm und sind angereichert mit endosomalen Transmembranproteinen, die als Tetraspanine (CD9, CD63, CD81), membrangebundener endosomaler Sortierkomplex, der für den Transport erforderlich ist (ESCRT), und Lipid-Raft-assoziierten Proteinen1,2,5,6,7.

Die Charakterisierung der biochemischen Zusammensetzung von Exosomen ist zu einem beliebten Feld für Forscher geworden, um ihre funktionelle Natur besser zu verstehen. Es gibt viele Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung von Exosomen, einschließlich nanoskaliger Durchflusszytometrie, Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Oberflächenplasmonresonanz, resistiver Pulserfassung und traditioneller Lichtmikroskopie, von denen jede intrinsische Vor- und Nachteileenthält 8,9. TEM und Kryo-EM können eine nanometerbasierte Auflösung erreichen, erfordern jedoch häufig Dehydratisierungs- und Gefrierbruchschritte, wodurch EVs10,11geschrumpft oder lysiert werden. NTA beruht auf Lichtstreuung, die die Charakterisierung von Hunderten von EVs gleichzeitig ermöglicht, ist aber eine indirekte Messung der Partikelgröße und kann nicht leicht zwischen EVs, Viren und Proteinaggregatenunterscheiden 12,13,14,15,16. Die nanoskalige Durchflusszytometrie verwendet Lichtstreuung aus einem Anregungspfad, der dann in Größenmessungen übersetzt werden kann, ist aber eine aufkommende Technologie, und es gibt wenig Konsens darüber, welche Größe der Partikel innerhalb des linearen Detektionsbereichs für verschiedene Instrumente12,17,18 liegt.

Die traditionelle Lichtmikroskopie mit fluoreszierenden Proteinen oder Farbstoffen war eine der am häufigsten eingesetzten Techniken zur Visualisierung subzellulärer Kompartimente, Proteinkomplexe und Signalmaschinen innerhalb einer Zelle. Während sich diese Technik bei der Visualisierung der Lokalisation von Komplexen als nützlich erweist, verhindert die Beugungsgrenze der traditionellen Lichtmikroskopie (etwa 250-400 nm) die klare Auflösung von Proteinen oder Strukturen im typischen Größenbereich eines Exosoms (40-150 nm)12,19,20.

Die hochauflösende Mikroskopie, nämlich die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM), unterscheidet sich von der konventionellen Lichtmikroskopie dadurch, dass sie die photoschaltbaren Eigenschaften bestimmter Fluorophore nutzt und diese blinkenden Ereignisse detektiert, um Bilder bis zu einer Nanometergenauigkeit zu rekonstruieren21. Photoswitching-Ereignisse werden mit einer Kamera mit hoher Bildrate im Verlauf von Zehntausenden von Einzelbelichtungen gesammelt, und eine Punktspreizfunktion wird verwendet, um den genauen Standort des photoswitching Fluorophors19,20 , 22mithoher Sicherheitabzubilden. Dadurch kann dSTORM die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie umgehen. Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von hochauflösenden Techniken zur Visualisierung und Verfolgung von Exosomen und ihren assoziierten Proteinen berichtet22,23,24,25. Die endgültige Auflösung hängt von den biophysikalischen Eigenschaften des Fluorophors ab, liegt aber oft zwischen +/-10-100 nm entlang der XY-Achse, was eine Einzelmolekülauflösung ermöglicht.

Die Fähigkeit, einzelne Fluorophore in dieser Größenordnung auf der XY-Achse aufzulösen, hat die Mikroskopie revolutioniert. Es gibt jedoch nur wenige Daten über den dreidimensionalen (3-D) dSTORM eines Exosoms. Daher haben wir versucht, eine Standardarbeitsanweisung (SOP) für die dSTORM-basierte Visualisierung und Charakterisierung von gereinigten Elektrofahrzeugen, einschließlich Exosomen mit Nanometer-Genauigkeit in 3-D, zu etablieren.

Protokoll

1 Vermehrung und Erhaltung von Zelllinien

  1. Erwerben Sie humane Osteosarkomzellen (U2OS) und legen Sie die Zellen in das Wachstumsmedium, ergänzt mit 10% exosomenfreiem fetalem Rinderserum und 1x Penicillin / Streptomycin-Lösung.
    HINWEIS: Exosomenfreies fetales Rinderserum wurde nach dem in McNamara et. al.26.
  2. Halten Sie die U2OS-Zellen in einem kupferbeschichteten Inkubator bei 37 °C in 5% CO2 und Passagezellen in T175-Kolben26,27. Die Zellen müssen in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase gehalten werden, um zu verhindern, dass Subpopulationen entstehen oder sich während der stationären Phase apoptotische Trümmer ansammeln.

2 Exosomenisolierung und -reinigung

  1. Die U2OS-Zelllinien werden in 10 separaten T175-Kolben mit 50 ml Medien pro Kolben bis zum vollen Konfluenz gezüchtet. Entfernen Sie den Zellüberstand und passieren Sie ihn nacheinander durch eine 0,45 μm und 0,22 μm Vakuumfiltrationsapparatur.
  2. Der Überstand wird einer Querstromfiltration (auch als tangentiale Strömungsfiltration bezeichnet) auf einem mit der 750 kDa Hohlfaserkartusche ausgestatteten Filtrationssystem unterzogen, um kleinere Proteine oder Metaboliten zu entfernen28.
    1. Führen Sie den Überstand durch den tangentialen Strömungsfiltrationsoperator mit einem konstanten Vorwärtsdruck von 30 psi, während Sie einen Rückhaltedruck von <20 psi beibehalten, um einen Δ-Druck von 10 oder mehr psi zu erzeugen. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in den Retentattank und stellen Sie ihn auf 150 U / min26.
    2. Halten Sie die Vorschubgeschwindigkeit bei 40 ml/min oder höher. Sammeln Sie das Permeat in einem Reservoir und entsorgen Sie es.
  3. Konzentrieren Sie den Überstand auf 30 ml und gleichen Sie ihn dann mit vier Volumina von 1x PBS aus. Sammeln Sie die querstromgefilterte und gleichgewichtete Lösung in einem konischen 50-ml-Rohr.
  4. Die EVs werden bei 4 °C über Nacht in einer Endkonzentration von 40 mg/ml Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 8.000 Da ausgefällt. Die EVs bei 1.200 x g bei 4 °C für 1 h zentrifugieren und in 500 μL 1x PBS resuspenieren.
  5. Inkubieren Sie die EVs mit 50 μg/ml photoschaltbarem rotem Membran-Interkalationsfarbstoff und 50 μg/ml RNase A in 1x PBS bei 4 °C für 1 h.
  6. Entfernen Sie überschüssigen Farbstoff durch eine Säule auf einem Proteinreinigungssystem, das an einem Fraktionssammler befestigt ist. Identifizieren Sie EV-Fraktionen durch UV-Absorption und bündeln Sie sie in einem Mikrozentrifugenrohr26.
  7. Affinität wählt insgesamt 200 μL EVs mit Anti-CD81-Magnetperlen aus, die in 1x PBS äquilibriert sind.
    1. Verdünnen Sie 100 μL der Anti-CD81-Magnetperlen in 1x PBS auf ein Gesamtvolumen von 1 mL und lassen Sie sie bei 4 °C für 2 h in einem 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit kontinuierlichem Schaukeln binden.
  8. Waschen Sie die Anti-CD81-Perlen und ev dreimal mit 1x PBS. Elute CD81+ EV aus der Lösung mit 100 mM Glycin bei pH 2,0 für 30 min bei 37 °C.
  9. Pipettieren Sie den gereinigten CD81+ EV in ein gleiches Volumen von 100 mM Tris-HCl bei pH 7,5 in 1x PBS.
    HINWEIS: Ein Aliquot aus gereinigter CD81+ EV-Lösung kann für die Nanopartikel-Tracking-Analyse oder Elektronenmikroskopie reserviert werden, um die Reinheit der Lösung und das Vorhandensein von EVs26zu bestätigen.

3 Fixierung und Zubereitung

  1. Platzieren Sie affinitätsgereinigte EVs auf Glasboden-μ-Objektträger-8-Well-Platten in einem Gesamtvolumen von 200 μL (kann EV-Probe in 100 mM Tris-HCl bei pH 7,5 in 1x PBS verdünnen) und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C an der Oberfläche haften.
  2. Ohne die vorhandene Lösung von der 8-Well-Platte zu entfernen, befestigen Sie EVs auf den Platten, indem Sie 200 μL 4% Paraformaldehyd in 1x PBS in die EV-haltige Lösung in jeder Vertiefung geben und 30 minuten bei Raumtemperatur21inkubieren lassen.
  3. Entfernen Sie vorsichtig Paraformaldehyd und überschüssige Lösung mit einer Mikropipette, um die EVs nicht zu stören. Waschen Sie das EV mit 1x PBS, um überschüssiges Paraformaldehyd zu entfernen. Führen Sie den Waschvorgang dreimal durch. Entfernen Sie überschüssige 1x PBS.
  4. Bereiten Sie 250 μL dSTORM B-cubed Buffer Solution pro Probe vor, indem Sie eine Lösung aus 5 mM Protocatechuat-Dioxygenase (Teil A) erzeugen, die in Imaging-Puffer (Teil B) gemäß Herstellerprotokoll verdünnt ist.
    ANMERKUNG: Die Konzentration des Enzyms im Puffer kann auf 10 mM verdoppelt werden, wenn photobleichnet wird.
    1. Fügen Sie 250 μL des vorbereiteten Puffers zu jedem Bohrloch pro Herstellerprotokoll für 20 minuten bei Raumtemperatur hinzu, bevor Sie eine Bildgebung durchführen, um oxidierende Moleküle abzufangen.
      HINWEIS: Das EV kann dann entweder sofort betrachtet oder bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. Ersetzen Sie den Puffer nach dem Speicher vor jeder Visualisierung.

4 Direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie Kalibrierung

  1. Bereiten Sie die für die Kalibrierung des hochauflösenden Mikroskops erforderlichen Perlen vor, indem Sie 100 nm Mikrokugeln auf eine Konzentration von 0,5% in molekularbiologischem Wasser verdünnen und 200 μL in jede Vertiefung einer Glasbodenplatte μ 8-Well-Platten pipettieren.
    1. Lassen Sie die Perlen bei Raumtemperatur 1 h in den Vertiefungen absetzen.
  2. Ohne die vorhandene Lösung zu entfernen, geben Sie 200 μL 4% Paraformaldehyd in PBS zu jeder Vertiefung in die Kalibrierperlenlösung und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Entfernen Sie das Paraformaldehyd vorsichtig mit einer Mikropipette, um die Perlen nicht zu stören, und waschen Sie die Perlen dreimal mit 1x PBS. Bereiten Sie den Puffer gemäß Schritt 3.4 vor.
  4. Entfernen Sie 1x PBS und geben Sie 250 μL des vorbereiteten Puffers zu jeder Vertiefung hinzu. Lassen Sie den Puffer vor der Visualisierung 20 Minuten ruhen.
  5. Bevor Sie etwas auf die Bühne stellen, schließen Sie es mit der Taste Mikroskop anschließen an das 3D-Mikroskop an. Fügen Sie dem Objektiv 100x Öl hinzu und platzieren Sie die Mitte des Bohrlochs auf dem Objektiv. Schalten Sie in der Einstellung Erfassen die Anregungslaser 473 und 640 nm ein und klicken Sie auf Ansicht.
    1. Wenn das 3D-Objektiv aktiviert ist, können Sie die Perlen unter der Einstellung für die Photonensättigung anzeigen, indem Sie in den Bildanzeigeoptionen auf Photonenanzahl klicken. Stellen Sie die anfänglichen Laserleistungen für den 473-nm-Laser auf 8,4 mW und für den 640-nm-Laser auf 11,6 mW ein.
    2. Verringern Sie den Fokus des Lasers auf etwa -300 nm oder die Brennebene der Kalibrierperlen, um eine klare Auflösung der einzelnen Perlen zu erzeugen. Sobald die Z-Ebene fokussiert ist, passen Sie die Laserleistungspegel weiter an, um die Variation in jedem Sichtfeld zu berücksichtigen.
  6. Führen Sie unter den Gerätefunktionen die 3D-Mapping-Kalibrierung und die Kanal-Mapping-Kalibrierung durch, um die Fehler auf der X-, Y- und Z-Achse zu erhalten. Legen Sie die maximale Anzahl der FOVs auf 20, die Zielanzahl der Punkte auf 4.000, den maximalen Abstand zwischen den Kanälen auf 5,0 Pixel und den Ausschlussradius zwischen den Kanälen auf 10,0 Pixel während der Kanalzuordnungskalibrierung fest.
  7. Stellen Sie sicher, dass die Kalibrierung eine Punktabdeckung von >90% und eine gute Mapping-Qualität liefert. Speichern Sie die angegebenen Kalibrierdaten für zukünftige Bildaufnahmen.

5 Visualisierung von EV in drei Dimensionen

  1. Fügen Sie 100x Öl auf das Objektiv und legen Sie die vorbereiteten EVs in das Mikroskop. Schalten Sie den 640-nm-Anregungslaser ein, ohne dass die 3D-Linse aktiviert ist, und erhöhen Sie ihn je nach Intensität des Signals und des Sichtfelds zunächst auf 1,2 mW bis 12,5 mW, um die roten Membran-Interkalationsfarbstoff-gefärbten EVs anzuregen.
    1. Wechseln Sie unter den Optionen für die Bildanzeige die Anzeigemethode von photonensättigung zu Perzentilen, um die EVs besser zu visualisieren. Passen Sie die Laserleistung an, um das Rauschen zu minimieren und gleichzeitig das Signal zu maximieren. Behalten Sie alle anderen Parameter bei.
    2. Passen Sie den Fokus der Z-Ebene an, indem Sie auf das Aufwärts- oder Abwärtssymbol auf der Z-Achse klicken.
      HINWEIS: Die Z-Ebene sollte zwischen -200 und -350 nm fokussiert sein, variiert jedoch je nach Sichtfeld.
  2. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 ms, die Bildaufnahme auf 10.000 Bilder und die anfängliche Laserleistung auf 1,2 mW bis 12,5 mW oder die in Schritt 5.1 ermittelte Laserleistung ein, abhängig von der Intensität des Signals und des Sichtfelds.
    1. Aktivieren Sie das 3D-Objektiv über das Symbol und starten Sie die Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche Erfassen klicken.
  3. Erhöhen Sie während der gesamten Bildaufnahme die Laserleistung um 3 Schritte von 10 alle 1000 Frames oder genug, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufrechtzuerhalten. Stellen Sie die Z-Ebene während der Erfassung nicht ein.
    HINWEIS: Der Laser darf auf maximal 90 mW Laserleistung angehoben werden.

6 Modifikation nach der Erfassung und EV-Tracing

  1. Wechseln Sie nach der Bildaufnahme zum Anzeigefenster Analysieren. Führen Sie eine Driftkorrektur für das ungefilterte Bild durch, und aktivieren Sie dann Filter. Passen Sie photonenzahl, Lokalisierungsgenauigkeit, Sigmas und Rahmenindex gemäß Tabelle 1 an.
  2. Überlagern Sie ein XYZ-Ebenenansichtswerkzeug entlang der X-Achse einzelner EVs aus dem Sichtfeld und exportieren . CSV-Dateien von Photoswitching-Ereignissen.
  3. Halbieren Sie einzelne EVs auf der XY-Achse in einem X by Y-Sichtfeld mit einem Linienhistogramm-Werkzeug, das Fotoumschaltereignisse in festgelegte Entfernungsgruppen einteilt.
  4. Nehmen Sie Bilder von einzelnen Elektrofahrzeugen auf und speichern Sie sie als .tiff Dateien.
  5. Erstellen Sie 3D-Videos von einzelnen Elektrofahrzeugen mit einem 3D-Visualisierungstool und Farbe entsprechend der Platzierung entlang der Z-Achse.

Ergebnisse

Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit der hochauflösenden Mikroskopie bei der Visualisierung einzelner EVs mit Nanometerauflösung in drei Dimensionen (3-D) zu bewerten. Um die Form und Größe einzelner EVs zu analysieren, verwendeten wir photosschaltbaren Farbstoff und inkubierten die EVs mit einem fernroten, membraninterkalierenden Farbstoff und entfernten überschüssigen Farbstoff durch Chromatographie29. Die affinitätsgefangenen Anti-CD81- und rotgefärbten EVs wurden dann im hochaufl...

Diskussion

EVs sind aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei vielen intrazellulären Prozessen und der Zell-zu-Zell-Signalgebung zueinembeliebten Untersuchungsgebiet geworden 1,30. Ihre Visualisierung erweist sich jedoch als schwierig, da ihre geringe Größe unter die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie fällt. Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) ist eine direkte Visualisierungsmethode, die die Beugungsgrenze umgeht, indem sie Photoschaltereigni...

Offenlegungen

M.G.C. hat keine Interessenkonflikte zu erklären. R.P.M und D.P.D. erhalten materielle Unterstützung von Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. und Cytiva Inc. (ehemals GE Healthcare). R.P.M. und D.P.D. erklären konkurrierende Interessen für die mögliche Kommerzialisierung einiger der präsentierten Informationen. Diese werden von der University of North Carolina verwaltet. Die Finanzierungsquellen waren nicht an den Interpretationen oder dem Schreiben dieses Manuskripts beteiligt.

Danksagungen

Wir danken Oxford Nanoimaging für das konstruktive Feedback und die Anleitung. Diese Arbeit wurde durch die 5UM1CA121947-10 an R.P.M. und die 1R01DA040394 an D.P.D. finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
15 µ-Slide 8 well platesIbidi80827
1X PBSGibco14190-144
1X Penicillin Streptomycin solutionGibco15140-122
50 mL conical tubeThermo Fisher339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatusGenesee25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filterCytiva29-0142-95
AKTA Flux SCytiva29-0384-37
AKTA StartCytiva29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beadsThermo Fisher10616D
B-cubed bufferONI BCA0017
CellMask RedThermo FisherC10046
Dubelco's Modified Eagle MediumThermo Fisher10566016
Fetal Bovine SerumVWR97068-085
Frac 30 Fraction collectorCytiva29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0Thermo FisherBP381-5
HiTrap CaptoCore 700 ColumnCytiva17548151
Molecular Biology Grade WaterCorning9820003
NanoimagerOxford NanoimagingCustom
ParaformaldehhydeElectron Microscopy Sciences15710
Polyethylene glycolThermo FisherBP233-1
RNase APromegaA797C
T175 FlasksGenesee25-211
Tetraspek microspheresInvitrogenT7279
Tris- HCl pH=7.5Thermo FisherBP153-1
Unicorn VCytiva29022094-ECOMINSSW

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