Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

على الرغم من التقدم الأخير، العديد من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة لا تزال مع وظائفها غير معروف تماما. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لتحديد توطين البروتينات في الخلايا الراسية، والتي كانت أساسية لتوضيح وظائفها الجزيئية.

Abstract

على الرغم من التقدم الأخير في توصيف بروتيوم الميتوكوندريا الخميرة، وتوطين submitochondrial لعدد كبير من البروتينات لا يزال بعيد المنال. هنا، ونحن نصف طريقة قوية وفعالة لتحديد توطين suborganellar من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة، والتي تعتبر خطوة أساسية خلال توضيح وظيفة البروتين الميتوكوندريا. هذه الطريقة تنطوي على خطوة الأولية التي تتكون من الحصول على الميتوكوندريا سليمة نقية للغاية. ثم تخضع هذه الاستعدادات الميتوكوندريا لبروتوكول الانكسار الذي يتكون من صدمة نقصوتونية (تورم) والحضانة مع البروتين K (بروتياز). أثناء التورم ، يتم تعطيل غشاء الميتوكوندريا الخارجي بشكل انتقائي ، مما يسمح للبروتيناز K بهضم بروتينات مقصورة الفضاء بين الميمبران. في موازاة ذلك، للحصول على معلومات حول طوبولوجيا بروتينات الأغشية، يتم في البداية سونيكاتيد الاستعدادات الميتوكوندريا، ومن ثم تتعرض لاستخراج القلوية مع كربونات الصوديوم. وأخيرا ، بعد الطرد المركزي ، يتم تحليل الكسور الحبيبية والناسخة من هذه العلاجات المختلفة من قبل SDS-PAGE ولطخة غربية. يتم الحصول على توطين submitochondrial وكذلك طوبولوجيا الغشاء من البروتين من الفائدة من خلال مقارنة ملفها الشخصي وصمة عار الغربية مع المعايير المعروفة.

Introduction

الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية للخلايا eukaryotic التي تلعب أدوارا حاسمة في الجيوجيستيك الحيوية، والتمثيل الغذائي الخلوي، ومسارات الإشارات1. لتنفيذ هذه المهام بشكل صحيح، تعتمد الميتوكوندريا على مجموعة فريدة من البروتينات والدهون المسؤولة عن بنيتها ووظيفتها. وقد استخدمت الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae على نطاق واسع كنظام نموذجي للتحقيقات في عمليات الميتوكوندريا، وكذلك ل organelles2 أخرى. رموز الجينوم الميتوكوندريا لثمانية بروتينات فقط في الخميرة. يتم ترميز الغالبية العظمى من بروتينات الميتوكوندريا (~99٪) بواسطة الجينات النووية، والتي تترجم على الريبوسومات السيتوسولية، ويتم استيرادها بعد ذلك إلى مقصوراتها ال submitochondrial الصحيحة بواسطة آلات استيراد البروتين المتطورة3،4،5. وهكذا، يعتمد التكوين الحيوي الميتوكوندريا على التعبير المنسق لكل من الجينوم النووي والميتوكوندريا6,7. ترتبط الطفرات الوراثية المسببة لعيوب في التكوين الحيوي الميتوكوندريا بالأمراض البشرية8,9,10.

في العقدين الماضيين، أسفرت الدراسات البروتيومية عالية الإنتاجية التي تستهدف الميتوكوندريا عالية النقاء عن توصيف شامل للبروتيوم الميتوكوندريا الخميرة، والتي قدرت أن تتكون من ما لا يقل عن 900 البروتينات11،12،13،14. على الرغم من أن هذه الدراسات قدمت معلومات قيمة، فإن توطين شبه العضوية لكل بروتين في الأقسام الفرعية الأربعة للميتوكوندريا، وهي الغشاء الخارجي (OM)، والفضاء بين الميمبران (IMS)، والغشاء الداخلي (IM)، والمصفوفة، لا يزال مطلوبا. وقد عولجت هذه المسألة جزئيا مع دراسات على نطاق بروتيوميك من اثنين من أصغر الإدارات الفرعية الميتوكوندريا (OM وIMS)15,16. وفي الآونة الأخيرة، خطت شركة Vögtle والمتعاونون معها خطوة كبيرة إلى الأمام من خلال إنشاء خريطة عالمية عالية الجودة لتوزيع البروتين البروبوسوندري في الخميرة. باستخدام نهج متكامل يجمع بين قياس الطيف الكتلي الكمي القائم على SILAC ، وبروتوكولات الكسر الإرسالي المختلفة ، ومجموعة البيانات من OM وIMS proteomes ، خصص المؤلفون 818 بروتينا في الأقسام الفرعية الأربعة للميتوكوندريا13.

على الرغم من التقدم الذي حققته هذه الدراسات البروتيومية عالية الإنتاجية ، فإن معرفتنا حول تكوين البروتيوم البروتيومي البروتيدري أبعد ما تكون عن الاكتمال. في الواقع، من بين 986 البروتينات التي ذكرت من قبل Vögtle والمتعاونين بأنها مترجمة في الميتوكوندريا الخميرة، لا يمكن تعيين 168 في أي من المقصورات submitochondrial الأربعة13. وعلاوة على ذلك، لم يقدم المؤلفون معلومات حول طوبولوجيا الأغشية من البروتينات التي كان من المتوقع أن تكون مرتبطة هامشيا إلى محيط الأغشية الميتوكوندريا. على سبيل المثال، لا يمكن معرفة ما إذا كان البروتين الذي تم تعيينه كبروتين متصل بشكل هامشي بالغشاء الداخلي يواجه المصفوفة أو الفضاء بين الغشاء. وبصرف النظر عن هذه البيانات المفقودة من الدراسات على نطاق البروتيوم، هناك معلومات متضاربة حول توطين شبه العضوية لعدد كبير من بروتينات الميتوكوندريا. ومن الأمثلة على ذلك البروتياز Prd1، الذي تم تعيينه كبروتين فضائي بين الميمبران في قواعد البيانات المشتركة مثل قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces (SGD) وUniprot. من المستغرب ، وذلك باستخدام بروتوكول الانكسار مماثلة لتلك الموصوفة هنا ، Vögtle والمتعاونين أظهرت بوضوح أن Prd1 هو بروتين مصفوفة حقيقية13. كما ذكر أعلاه، يجب توضيح توطين العديد من بروتينات الميتوكوندريا أو إعادة تقييمه. هنا، ونحن نقدم بروتوكول بسيط وموثوق بها لتحديد توطين suborganellar من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة. تم تطوير هذا البروتوكول وتحسينه من قبل مجموعات بحثية مختلفة وتم استخدامه بشكل روتيني لتحديد توطين ال submitochondrial ، وكذلك طوبولوجيا الغشاء للعديد من بروتينات الميتوكوندريا.

Protocol

1. نمو خلايا الخميرة

  1. عزل مستعمرات واحدة من سلالة من الاهتمام عن طريق streaking جزء صغير من الخلايا من الأسهم -80 درجة مئوية الجلسرين على YPD (1٪ استخراج الخميرة، 2٪ بيبتون، 2٪ الجلوكوز) لوحة أجار. احتضان لوحة في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
    ملاحظة: مشتق سلالة S. cerevisiae المستخدمة في هذا البروتوكول من BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). وباستثناء جينات العلامة المقوسة، لا تحتوي هذه السلالة على أي جين محذوف ولا تحمل أي بلازميد. وبالتالي، يمكن زراعته بنجاح في وسط غني، وتحفيز نمو الخلايا القوية. عند العمل مع سلالات تحولت مع البلازميدات، استخدم المتوسطة الحد الأدنى المناسب لاختيار البلازميد.
  2. إعداد ثقافة بداية عن طريق تلقيح 2-3 المستعمرات الفردية من لوحة أجار YPD في 10-20 مل من المتوسط YPGal (1٪ استخراج الخميرة، 2٪ بيبتون، 2٪ galactose) في قارورة Erlenmeyer 100 مل. احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة مع اهتزاز قوي.
    ملاحظة: اختيار متوسط النمو يعتمد على سلالة الخميرة المستخدمة في البروتوكول. يحتوي كل من YPD و YPGal على مصادر كربون قابلة للتخمير ، والتي تسمح بنمو السلالات التي لا تؤدي تنفس الميتوكوندريا. ومع ذلك ، لأن الجلوكوز يقمع التعبير عن العديد من جينات الميتوكوندريا ، فمن غير المستحسن استخدام مصدر الكربون هذا لأنه سينتج كميات أقل من الميتوكوندريا. عند العمل مع سلالات الجهاز التنفسي المختصة التي يمكن أن تنفس، فمن الممكن أيضا لاستخدام مصادر الكربون مثل الجلسرين والإيثانول في محاولة للحصول على عائد أعلى من الميتوكوندريا.
  3. تمييع ثقافة المبتدئين إلى 1 لتر من متوسط YPGal الطازج إلى OD600 أقل من 0.1. زراعة الخلايا في 30 درجة مئوية مع اهتزاز قوية حتى OD600 تصل إلى 1-1.5.
    ملاحظة: تحديد معدل النمو (مضاعفة الوقت) لكل سلالة الخميرة قبل إجراء التجربة. وسيوفر ذلك تقديرا دقيقا لوقت الحضانة اللازم للثقافة للوصول إلى OD600 من 1-1.5.

2. عزل الميتوكوندريا عالية النقاء

ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من17 مع تعديلات طفيفة.

  1. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. غسل الخلايا بالماء المقطر وجمعها عن طريق الطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحديد الوزن الرطب للخلايا.
    ملاحظة: أسهل طريقة لقياس وزن بيليه الخلية من الخطوة 2.2 هي تحديد وزن أنبوب الطرد المركزي الفارغ قبل جمع الخلايا مباشرة. بعد الطرد المركزي، تجاهل supernatant وقياس وزن نفس الأنبوب مع الخلايا. وزن الخلايا هو الفرق بين القياسين.
  4. إعادة إنفاق الخلايا في المخزن المؤقت DTT (2 مل لكل 1 غرام من الخلايا) باستخدام ماصة باستور أو تلميح P5000. راجع الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت DDT.
  5. احتضان الخلايا في 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز لطيف (~ 70 دورة في الدقيقة).
  6. جهاز الطرد المركزي في 3000 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه الخلايا.
  7. غسل الخلايا مع العازلة Zymolyase دون انزيم (حوالي 7 مل لكل 1 غرام من الخلايا).
    راجع الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت Zymolyase.
  8. جهاز الطرد المركزي في 3000 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه الخلايا.
  9. إعادة إنفاق الخلايا في المخزن المؤقت دون Zymolyase (7 مل لكل 1 غرام من الخلايا).
  10. نقل تعليق الخلية إلى قارورة Erlenmeyer 250 مل وإضافة Zymolyase-20T (3 ملغ لكل غرام الوزن الرطب).
  11. احتضان الخلايا في 30 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة مع اهتزاز لطيف (~ 70 دورة في الدقيقة). تحقق من كفاءة هذه العملية من خلال مقارنة عكر تعليق الخلية قبل وبعد علاج Zymolyase.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، سيتم تحويل الخلايا إلى spheroplasts بسبب الهضم جدار الخلية بواسطة Zymolyase.
    1. لهذا، إضافة 50 ميكرولتر من كل تعليق الخلية لفصل أنابيب زجاجية تحتوي على 2 مل من الماء. بعد الاختلاط بقوة ، يجب أن ينخفض عكر تعليق الخلية المعالج ب Zymolyase بسرعة بسبب اضطراب التناضح في السفيروبلاستات. من ناحية أخرى، يجب أن يظل عكر تعليق الخلية غير المعالجة دون تغيير.
      ملاحظة: يمكن أيضا رصد آثار العكر عن طريق الفحص البصري البسيط أو عن طريق قياس OD600 من كلتا العينتين. في الحالة الثانية، يجب أن يكون OD600 من عينة Zymolyase المعالجة 10٪ -20٪ من العينة غير المعالجة. تتضمن الطريقة البديلة عد الخلايا في كلتا العينتين باستخدام المجهر الخفيف.
    2. إذا كانت غلة تشكيل spheroplasts منخفضة، إضافة المزيد من Zymolyase واحتضان لفترة إضافية 15 دقيقة.
  12. حصاد spheroplasts عن طريق الطرد المركزي في 2500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات الأخرى بسرعة وعلى الجليد أو عند 4 درجات مئوية لتجنب تدهور البروتين بواسطة الإنزيمات الهيدرولية.
  13. غسل spheroplasts مرتين مع الجليد الباردة تجانس العازلة (حوالي 6.5 مل لكل 1 غرام من الخلايا) والكريه عن طريق الطرد المركزي في 2500 س غ لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. راجع الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت للتجانس.
  14. إعادة إنفاق spheroplasts في الجليد الباردة تجانس العازلة (6.5 مل لكل 1 غرام من الخلايا) ونقله إلى التجانس الزجاج المبردة مسبقا Dounce. استخدام التجانس الزجاج كبيرة من حوالي 30 مل.
  15. تجانس spheroplasts مع 15 السكتات الدماغية باستخدام الآفات.
    ملاحظة: يجب تعديل عدد السكتات الدماغية اعتمادا على تركيب الحشرات. بالنسبة للحشرات الضيقة ، تكفي 15 ضربة. من ناحية أخرى ، إذا كنت تستخدم حشرات فضفاضة ، فمن المستحسن إجراء ما يصل إلى 25 ضربة.
  16. نقل المتجانسة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل وإضافة 1 حجم من الجليد الباردة تجانس العازلة.
  17. طرد مركزي المتجانسة في سرعة منخفضة، 1500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية إلى بيليه نويات، حطام الخلية، والخلايا غير المنقطعة.
  18. نقل supernatant إلى أنبوب طرد مركزي 50 مل جديدة باستخدام ماصة باستور أو P5000 تلميح مع الحرص على تجنب تعطيل بيليه.
  19. جهاز طرد مركزي عند 4000 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  20. نقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة، والطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية بيليه كسر الميتوكوندريا الخام.
  21. تجاهل supernatant وغسل بلطف بيليه الميتوكوندريا الخام في 20-30 مل الجليد الباردة تجانس العازلة عن طريق pipetting لطيف باستخدام طرف P5000.
  22. نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل والطرد المركزي في 4000 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية بيليه حطام الخلية المتبقية.
  23. نقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة، والطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية بيليه كسر الميتوكوندريا الخام.
  24. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بلطف بيليه الميتوكوندريا الخام في حجم صغير (عادة 1000 ميكرولتر) من العازلة SEM الجليد الباردة عن طريق pipetting لطيف باستخدام طرف P1000. راجع الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت SEM.
    ملاحظة: على الرغم من أن هذا الكسر الميتوكوندريا الخام يمكن استخدامها مباشرة في بعض التطبيقات مثل في المقايسات استيراد البروتين organello , أنه يحتوي على كميات كبيرة من المكونات الخلوية الأخرى. قد تؤدي هذه التلوثات إلى تفسيرات خاطئة للنتائج عند تحديد توطين البروتين. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من خطوات التطهير للحصول على إعداد الميتوكوندريا عالي النقاء ، كما هو موضح أدناه.
  25. إعداد حلول السكروز في العازلة EM بتركيزات 60٪, 32٪, 23٪, و 15٪ (ث/v). هذه الحلول مستقرة لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجة مئوية. راجع الجدول 1 لتكوين المخزن المؤقت EM.
  26. إعداد تدرج السكروز من 4 خطوات في أنبوب الطرد المركزي للغاية على النحو التالي: ضع 1.5 مل من 60٪ (ث / v) السكروز على الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. المقبل, ماصة تدريجيا بعناية: 4 مل من 32٪, 1.5 مل من 23٪, و 1.5 مل من 15٪ السكروز (ث/v). الحرص على تجنب تعطيل المراحل.
  27. تحميل بعناية كسر الميتوكوندريا الخام على رأس التدرج السكروز.
  28. جهاز الطرد المركزي لمدة ساعة واحدة عند 134,000 × ز عند 4 درجات مئوية في دوار دلو متأرجح.
  29. الحفاظ بعناية إزالة محلول السكروز حتى يتم التوصل إلى كسر الميتوكوندريا تنقية عالية والتي تمثلها الفرقة البني في واجهة السكروز 60٪/32٪.
  30. استعادة الميتوكوندريا المنقى باستخدام طرف قطع P1000 ووضعه في أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة المبردة مسبقا.
  31. تمييع الميتوكوندريا المستردة مع 5-10 مجلدات من عازلة SEM الباردة الجليد.
  32. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 12,000 × غرام عند 4 درجات مئوية.
  33. Resuspend الميتوكوندريا نقية في 500 ميكرولتر من الجليد الباردة SEM العازلة عن طريق pipetting لطيف باستخدام تلميح قطع P1000.
  34. تحديد تركيز البروتين من إعداد الميتوكوندريا تنقية عالية باستخدام إجراء برادفورد باتباع تعليمات الشركة المصنعة. ضبط تركيز البروتين إلى 10 ملغ من البروتين / مل مع الجليد الباردة SEM العازلة.
    ملاحظة: بالنسبة لبروتوكول الكسر التقدي الوارد وصفه أدناه، يوصى باستخدام الميتوكوندريا الطازجة. ومع ذلك ، أجرى Vögtle والمتعاونين تحليلا مفصلا لمراقبة الجودة لمراقبة الميتوكوندريا وأظهروا أنه يمكن أيضا استخدام العضيات المجمدة في هذا البروتوكول13. لهذا، وجعل aliquots من 40 ميكرولتر وتجميدها في النيتروجين السائل. يخزن عند -80 درجة مئوية.

3. بروتوكول الكسر التقدي

ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من reference18 ويتكون من خطوتين: (1) تورم هيبوتونيك في وجود أو غياب البروتين K، و (2) سونيكيشن تليها استخراج الكربونات. تنفيذ جميع الخطوات من كل من البروتوكولات على الجليد أو في 4 درجة مئوية لتجنب تدهور البروتين.

  1. تورم تحت الطنين في وجود بروتيناز K
    1. نقل 40 ميكرولتر من الميتوكوندريا عالية النقاء في 10 ملغم / مل (400 ميكروغرام) إلى أربعة أنابيب 1.5 مل قبل المبردة المسمى أجهزة الطرد المركزي الدقيق.
    2. إضافة 360 ميكرولتر من المخزن المؤقت SEM في أنابيب 1 و 2.
    3. إضافة 360 ميكرولتر من العازلة EM في أنابيب 3 و 4.
    4. أضف 4 ميكرولتر من البروتين K (10 ملغم/مل) في الأنبوبين 2 و4. استخدم نظام الأنابيب المسرود في الجدول 2 لتجنب الأخطاء.
      ملاحظة: إعداد محلول 10 ملغم/مل من البروتين K في الماء مباشرة قبل الاستخدام. يجب أن يكون التركيز النهائي للبروتيناز K في التجربة حوالي 50-100 ميكروغرام / مل. يرجى الاطلاع على قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل.
    5. تخلط جميع الأنابيب برفق وتحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة مع خلط عرضي.
    6. إضافة 4 ميكرولتر من 200 م م PMSF لجميع الأنابيب الأربعة لوقف نشاط البروتين K.
      تنبيه: PMSF شديد السمية. ارتداء قفازات عند العمل مع الحلول التي تحتوي على PMSF.
    7. جهاز طرد مركزي عند 20,000 x g لمدة 30 دقيقة عند 4°C.
    8. جمع supernatant ونقله إلى أنبوب جديد 1.5 مل المبردة مسبقا المسمى microcentrifuge. الحرص على تجنب تعطيل بيليه.
      ملاحظة: يمكن إعادة إنفاق بيليه مباشرة في المخزن المؤقت العينة لمزيد من تحليل SDS-PAGE ولطخة الغربية. ومع ذلك، يمكن أن تبقى آثار البروتين K نشطة حتى بعد علاج PMSF ويمكن في نهاية المطاف هضم بعض البروتينات بعد أن تم إذابة بيليه في المخزن المؤقت للعينة المحتوية على SDS. لتجنب هذه المشكلة، يمكن تعطيل البروتين K تماما عن طريق علاج العينات مع حمض ثلاثي الكلور (TCA) على النحو المبين أدناه.
      تحذير: TCA شديدة السمية. ارتداء قفازات عند العمل مع الحلول التي تحتوي على TCA.
    9. Resuspend بيليه من الخطوة 3.1.8 في 400 ميكرولتر من الجليد الباردة SEM العازلة.
    10. عجلت الناموسية الفائقة (من الخطوة 3.1.8) والكريهة التي أعيد إنفاقها (من الخطوة 3.1.9) مع TCA إلى تركيز نهائي قدره 10٪ (ث / v).
    11. احتضان جميع الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    12. الطرد المركزي العينات المعالجة TCA لمدة 10 دقيقة في 12000 x ز في 4 درجة مئوية.
    13. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 200 ميكرولتر من عينة العازلة.
      ملاحظة: من الممكن أن يتحول مؤشر درجة الحموضة الأزرق بروموفينول الأصفر بسبب العلاج الحمضي. إذا حدث هذا، إضافة aliquots صغيرة (1-5 ميكرولتر) من قاعدة 1 M تريس حتى يتحول الأزرق.
    14. أضف 4 ميكرولتر من 200 م م PMSF إلى جميع الأنابيب.
    15. تخزين جميع العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل من قبل SDS-PAGE ولطخة الغربية.
  2. سونيكيشن واستخراج الكربونات
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، فإنه ليس من الضروري استخدام الميتوكوندريا الطازجة بمجرد أن يسبب سونيكيشن تمزق الأغشية الميتوكوندريا.
    1. نقل 200 ميكرولتر من الميتوكوندريا عالية النقاء في 10 ملغم / مل (2 ملغ بروتين) في أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق المبردة مسبقا.
    2. تمييع الميتوكوندريا مرة واحدة مع عازلة SEM الباردة الجليد.
    3. سونيكاتي الميتوكوندريا لمدة 3 × 30 ق على الجليد. استخدام sonicator متوافقة لأحجام صغيرة.
    4. طرد مركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 100،000 × ز في 4 درجة مئوية.
    5. جمع supernatant ونقله إلى أنبوب جديد 1.5 مل قبل المبردة microcentrife. أبقه على الثلج سيتم تسمية هذه العينة كسر البروتين القابل للذوبان (S).
    6. Resuspend بيليه من الخطوة 3.2.4 في 400 ميكرولتر من الجليد الباردة SEM العازلة.
    7. خذ 100 ميكرولتر من بيليه إعادة الإنفاق من الخطوة 3.2.6 ونقله إلى أنبوب جديد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق المبردة مسبقا. أبقه على الثلج سيتم تسمية هذه العينة كسر الجسيمات submitochondrial (SMP).
    8. تمييع المتبقية 300 ميكرولتر من الخطوة 3.2.6 مرة واحدة مع كربونات الصوديوم الطازجة 200 mM.
    9. احتضان العينة من الخطوة 3.2.8 على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    10. طرد مركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 100،000 × ز في 4 درجة مئوية.
    11. جمع supernatant ونقله إلى أنبوب جديد 1.5 مل قبل المبردة microcentrife. أبقه على الثلج سيتم تسمية هذه العينة كسر كربونات فائقة (CS).
    12. Resuspend بيليه من الخطوة 3.2.10 في 400 ميكرولتر من الجليد الباردة SEM العازلة. سيتم تسمية هذه العينة كسر الكربونات عجلت (CP).
    13. تسريع جميع العينات (S، SMP، CS، وCP) مع TCA إلى تركيز نهائي من 10٪ (ث / v).
    14. احتضان جميع الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    15. الطرد المركزي العينات المعالجة TCA لمدة 10 دقيقة في 12000 x ز في 4 درجة مئوية.
    16. إزالة supernatant وإعادة إنفاق كل بيليه في المخزن المؤقت عينة. إذا أصبح المخزن المؤقت عينة صفراء، إضافة aliquots صغيرة (1-5 ميكرولتر) من قاعدة 1 M تريس حتى يتحول الأزرق.
    17. أضف 1 ميكرولتر من 200 م م PMSF إلى جميع الأنابيب.
    18. تخزين جميع العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل من قبل SDS-PAGE ولطخة الغربية.

النتائج

نجاح بروتوكول الكسر submitochondrial يعتمد على الحصول على الميتوكوندريا سليمة تنقية عالية. لهذا، فمن الضروري أنه خلال تحلل الخلية الخميرة، والحفاظ على سلامة العضيات تقريبا تماما. ويتحقق ذلك باستخدام بروتوكول تحلل الخلية الذي يجمع بين الهضم الأنزيمي لجدار الخلية يليه اضطراب مادي في غشاء البلازم...

Discussion

وقد تم استخدام البروتوكول المعروض هنا بنجاح وتحسينه باستمرار لفترة طويلة لتحديد توطين البروتين في مقصورات الخضوع للشهية13,14,18,21,22,23. تعتمد موثوقية هذا البروتوكول وقابليته لإعادة ا?...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور أ. تزاغولوف (جامعة كولومبيا) على توفير الأجسام المضادة التي أثيرت ضد بروتينات علامة submitochondrial Cyt. b2، αKGD، وسكو1. ونشكر أيضا الدكتور ماريو هنريك دي باروس (جامعة ساو باولو) على المناقشات والتعليقات المفيدة أثناء وضع هذا البروتوكول.

وقد دعم هذا العمل منح بحثية من مؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado de São Paulo (منحة 2013/07937-8).

فرناندو غوميز وهيلينا تورانو مدعومان أيضا من قبل FAPESP، المنح 2017/09443-3 و 2017/23839-7 على التوالي. كما تحظى أنجيليكا راموس بدعم من كورديناساو دي أبيرفيسوامنتو دي بيسوال دي نيفل سوبيريور (CAPES).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacto PeptoneBD211677
Bacto Yeast extractBD212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mmBeckman Coulter344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)Sigma-AldrichA7030Component of Homogenization buffer
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43815Component of DDT buffer
D-SorbitolSigma-AldrichS1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE9884
GalactoseSigma-AldrichG0625
GlucoseSigma-AldrichG7021
MOPSSigma-AldrichM1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasicSigma-AldrichP3786
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP0662
Proteinase KSigma-Aldrich
SucroseSigma-AldrichS8501
Trichloroacetic acid (TCA)Sigma-AldrichT6399
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, Irvine, CA320921Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast

References

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
  3. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
  4. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
  5. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
  6. Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
  7. Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
  8. Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
  9. Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
  10. Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
  11. Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
  12. Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
  13. Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).
  14. Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
  15. Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
  16. Vögtle, F. -. N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
  17. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
  18. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
  19. Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
  20. Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
  21. Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
  22. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
  23. Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
  24. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
  25. Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).
  26. Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
  27. Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
  28. Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
  29. Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
  30. Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173 Saccharomyces cerevisiae submitochondrial submitochondrial submitochondrial

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved