Évaluation de la localisation des protéines submitochondriales dans la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae

Résumé

Malgré les progrès récents, de nombreuses protéines mitochondriales de levure restent encore avec leurs fonctions complètement inconnues. Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour déterminer la localisation de la soumissionochondriale des protéines, ce qui a été fondamental pour l’élucidation de leurs fonctions moléculaires.

Résumé

Malgré les progrès récents dans la caractérisation du protéome mitochondrial de levure, la localisation subjectochondriale d’un nombre important de protéines reste insaisissable. Ici, nous décrivons une méthode robuste et efficace pour déterminer la localisation sous-organique des protéines mitochondriales de levure, qui est considérée comme une étape fondamentale lors de l’élucidation de la fonction protéique mitochondriale. Cette méthode implique une première étape qui consiste à obtenir des mitochondries intactes très pures. Ces préparations mitochondriales sont ensuite soumises à un protocole de sous-fractionnement consistant en un choc hypotonique (gonflement) et une incubation avec la protéinase K (protéase). Pendant le gonflement, la membrane mitochondriale externe est perturbée sélectivement, ce qui permet à la protéinase K de digérer les protéines du compartiment de l’espace intermembranaire. En parallèle, pour obtenir des informations sur la topologie des protéines membranaires, les préparations mitochondriales sont d’abord soniquées, puis soumises à une extraction alcaline avec du carbonate de sodium. Enfin, après centrifugation, les fractions granulées et surnageantes de ces différents traitements sont analysées par SDS-PAGE et western blot. La localisation de la soumissionochondrie ainsi que la topologie membranaire de la protéine d’intérêt sont obtenues en comparant son profil de transfert de Western avec des étalons connus.

Introduction

Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes qui jouent un rôle crucial dans la bioénergétique, le métabolisme cellulaire et les voies de ^{signalisation1}. Pour exécuter correctement ces tâches, les mitochondries s’appuient sur un ensemble unique de protéines et de lipides responsables de leur structure et de leur fonction. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae a été largement utilisée comme système modèle pour les recherches sur les processus mitochondriaux, ainsi que pour d’autres ^organites2. Le génome mitochondrial ne code que pour huit protéines dans la levure; la grande majorité des protéines mitochondriales (~99%) sont codées par des gènes nucléaires, qui sont traduits sur des ribosomes cytosoliques, puis importés dans leurs compartiments soumisochondriaux corrects par des machines sophistiquées d’importation de protéines3,4,5. Ainsi, la biogenèse mitochondriale dépend de l’expression coordonnée des génomes nucléaire et ^{mitochondrial6,7}. Les mutations génétiques causant des défauts dans la biogenèse mitochondriale sont associées à des maladies humaines8,9,10.

Au cours des deux dernières décennies, des études protéomiques à haut débit ciblant des mitochondries hautement purifiées ont abouti à une caractérisation complète du protéome mitochondrial de levure, qui a été estimé être composé d’au moins 900 protéines11,12,13,14. Bien que ces études aient fourni des informations précieuses, la localisation sous-organique de chaque protéine dans les quatre sous-compartiments mitochondriaux, à savoir la membrane externe (OM), l’espace intermembranaire (IMS), la membrane interne (IM) et la matrice, est toujours nécessaire. Cette question a été partiellement abordée par des études protéomiques des deux sous-compartiments mitochondriaux plus petits (OM et IMS)^15,16. Plus récemment, Vögtle et ses collaborateurs ont fait un grand pas en avant en générant une carte mondiale de haute qualité de la distribution des protéines de submitochondrial dans la levure. En utilisant une approche intégrée combinant la spectrométrie de masse quantitative basée sur SILAC, différents protocoles de fractionnement de la soumission et l’ensemble de données des protéomes OM et IMS, les auteurs ont attribué 818 protéines dans les quatre sous-compartiments ^{mitochondriaux13}.

Malgré les progrès réalisés par ces études protéomiques à haut débit, nos connaissances sur la composition du protéome soumettochondrial sont loin d’être complètes. En effet, parmi les 986 protéines rapportées par Vögtle et ses collaborateurs comme étant localisées dans les mitochondries de levure, 168 n’ont pu être attribuées dans aucun des quatre compartiments de la submitochondrie13. De plus, les auteurs n’ont pas fourni d’informations sur la topologie membranaire des protéines qui devaient être attachées périphériquement à la périphérie des membranes mitochondriales. Par exemple, il n’est pas possible de savoir si une protéine qui a été assignée comme périphériquement attachée à la membrane interne fait face à la matrice ou à l’espace intermembranaire. Outre ces données manquantes des études à l’échelle du protéome, il existe des informations contradictoires sur la localisation sous-organique d’un nombre important de protéines mitochondriales. Un exemple est la protéase Prd1, qui a été assignée comme protéine de l’espace intermembranaire dans les bases de données courantes telles que Saccharomyces Genome Database (SGD) et Uniprot. Étonnamment, en utilisant un protocole de sous-fractionnement similaire à celui décrit ici, Vögtle et ses collaborateurs ont clairement montré que Prd1 est une véritable protéine ^{matricielle13}. Comme mentionné ci-dessus, la localisation de la submitochondrie de nombreuses protéines mitochondriales doit être élucidée ou réévaluée. Ici, nous fournissons un protocole simple et fiable pour déterminer la localisation sous-organique des protéines mitochondriales de levure. Ce protocole a été développé et optimisé par divers groupes de recherche et a été couramment utilisé pour déterminer la localisation des substances soumises, ainsi que la topologie membranaire de nombreuses protéines mitochondriales.

Protocole

1. Croissance des cellules de levure

1. Isoler des colonies uniques de la souche d’intérêt en striant une petite partie des cellules d’un stock de glycérol à -80 °C sur une plaque de gélose YPD (1 % d’extrait de levure, 2 % de peptone, 2 % de glucose). Incuber la plaque à 30 °C pendant 2-3 jours.
   REMARQUE : La souche de S. cerevisiae utilisée dans le présent protocole est dérivée de BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). À l’exception des gènes marqueurs auxotrophes, cette souche ne contient aucun gène supprimé et ne porte aucun plasmide. Ainsi, il peut être cultivé avec succès dans un milieu riche, stimulant une croissance cellulaire vigoureuse. Lorsque vous travaillez avec des souches transformées en plasmides, utilisez le milieu minimal approprié pour la sélection des plasmides.
2. Préparer une culture de démarrage en inoculant 2-3 colonies individuelles de plaque de gélose YPD dans 10-20 mL de milieu YPGal (1% d’extrait de levure, 2% de peptone, 2% de galactose) dans une fiole d’Erlenmeyer de 100 mL. Incuber à 30 °C pendant 24 h en agitant vigoureusement.
   REMARQUE: Le choix du milieu de croissance dépend de la souche de levure utilisée dans le protocole. YPD et YPGal contiennent des sources de carbone fermentescibles, qui permettent la croissance de souches qui n’effectuent pas de respiration mitochondriale. Cependant, puisque le glucose réprime l’expression de nombreux gènes mitochondriaux, il n’est pas recommandé d’utiliser cette source de carbone car elle produira des quantités plus faibles de mitochondries. Lorsque vous travaillez avec des souches respiratoires compétentes qui peuvent respirer, il est également possible d’utiliser des sources de carbone telles que le glycérol et l’éthanol pour tenter d’obtenir un rendement plus élevé en mitochondries.
3. Diluer la culture de démarrage dans 1 L de milieu YPGal frais à un _OD600 inférieur à 0,1. Cultivez les cellules à 30 °C en agitant vigoureusement jusqu’à ce que _l’OD600 atteigne 1-1,5.
   REMARQUE: Déterminez le taux de croissance (temps de doublement) pour chaque souche de levure avant d’effectuer l’expérience. Cela fournira une estimation précise du temps d’incubation nécessaire pour que la culture atteigne un _OD600 de 1 à 1,5.

2. Isolement des mitochondries hautement purifiées

REMARQUE: Ce protocole est adapté à partir ^de17, avec des modifications mineures.

1. Récolter les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
2. Lavez les cellules avec de l’eau distillée et collectez-les par centrifugation à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
3. Déterminez le poids humide des cellules.
   REMARQUE: Le moyen le plus simple de mesurer le poids de la pastille de cellule à partir de l’étape 2.2 consiste à déterminer le poids du tube de centrifugeuse vide juste avant la collecte des cellules. Après centrifugation, jeter le surnageant et mesurer le poids du même tube avec les cellules. Le poids des cellules est la différence entre les deux mesures.
4. Remettre les cellules en tampon TNT (2 mL pour 1 g de cellules) à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’une pointe P5000. Voir le tableau 1 pour la composition du tampon DDT.
5. Incuber les cellules à 30 °C pendant 20 min en secouant doucement (~70 tr/min).
6. Centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules.
7. Lavez les cellules avec un tampon zymolyase sans l’enzyme (environ 7 mL pour 1 g de cellules).
   Voir le tableau 1 pour la composition du tampon zymolyase.
8. Centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules.
9. Remettre en suspension les cellules dans le tampon sans zymolyase (7 mL pour 1 g de cellules).
10. Transférer la suspension cellulaire dans une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL et ajouter zymolyase-20T (3 mg par g de poids humide).
11. Incuber les cellules à 30 °C pendant 30-40 min en secouant doucement (~70 tr/min). Vérifiez l’efficacité de ce processus en comparant la turbidité de la suspension cellulaire avant et après le traitement par Zymolyase.
    REMARQUE: Dans cette étape, les cellules seront converties en sphéroplastes en raison de la digestion de la paroi cellulaire par zymolyase.
    1. Pour cela, ajouter 50 μL de chaque suspension cellulaire pour séparer les tubes de verre contenant 2 mL d’eau. Après mélange vigoureux, la turbidité de la suspension cellulaire traitée avec Zymolyase devrait diminuer rapidement en raison de la perturbation osmotique des sphéroplastes. D’autre part, la turbidité de la suspension cellulaire non traitée doit rester inchangée.
       REMARQUE: Les effets de la turbidité peuvent également être surveillés par une simple inspection visuelle ou en mesurant _l’OD600 des deux échantillons. Dans le second cas, _l’OD600 de l’échantillon traité par Zymolyase doit représenter 10 % à 20 % de l’échantillon non traité. Une autre méthode consiste à compter les cellules des deux échantillons à l’aide de la microscopie optique.
    2. Si le rendement de la formation de sphéroplastes est faible, ajoutez plus de zymolyase et incubez pendant un intervalle supplémentaire de 15 minutes.
12. Récolter les sphéroplastes par centrifugation à 2500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE: Toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées rapidement et sur de la glace ou à 4 ° C pour éviter la dégradation des protéines par les enzymes hydrolytiques.
13. Laver les sphéroplastes deux fois avec un tampon d’homogénéisation glacé (environ 6,5 mL pour 1 g de cellules) et des granulés par centrifugation à 2 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Voir le tableau 1 pour la composition du tampon d’homogénéisation.
14. Remettre en suspension les sphéroplastes dans un tampon d’homogénéisation glacé (6,5 mL pour 1 g de cellules) et les transférer dans un homogénéisateur Dounce en verre prérefroidis. Utilisez un grand homogénéisateur en verre d’environ 30 mL.
15. Homogénéiser les sphéroplastes à 15 coups à l’aide d’un pilon.
    REMARQUE: Le nombre de coups doit être ajusté en fonction de l’ajustement du pilon. Pour un pilon serré, 15 coups suffisent. D’autre part, si vous utilisez un pilon lâche, il est recommandé d’effectuer jusqu’à 25 coups.
16. Transférer l’homogénat dans un tube centrifuge de 50 mL et ajouter 1 volume de tampon d’homogénéisation glacé.
17. Centrifuger l’homogénat à basse vitesse, 1 500 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les noyaux, les débris cellulaires et les cellules ininterrompues.
18. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 mL à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’une pointe P5000 en prenant soin d’éviter de perturber la pastille.
19. Centrifuger à 4 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
20. Transférer le surnageant dans un tube de centrifugeuse à grande vitesse et centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler la fraction mitochondriale brute.
21. Jetez le surnageant et lavez doucement la pastille mitochondriale brute dans un tampon d’homogénéisation glacé de 20 à 30 mL par pipetage doux à l’aide d’une pointe P5000.
22. Transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 50 mL et centrifuger à 4 000 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les débris cellulaires restants.
23. Transférer le surnageant dans un tube de centrifugeuse à grande vitesse et centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler la fraction mitochondriale brute.
24. Jetez le surnageant et remettez doucement en suspension la pastille mitochondriale brute dans un petit volume (généralement 1000 μL) de tampon SEM glacé par pipetage doux à l’aide d’une pointe P1000. Voir le tableau 1 pour la composition du tampon SEM.
    REMARQUE: Bien que cette fraction mitochondriale brute puisse être utilisée directement dans certaines applications telles que les tests d’importation de protéines organello , elle contient des quantités substantielles d’autres composants cellulaires. Ces contaminations peuvent conduire à des interprétations erronées des résultats lors de la détermination de la localisation submitochondrial d’une protéine. Par conséquent, d’autres étapes de purification sont nécessaires pour obtenir une préparation mitochondriale hautement purifiée, comme décrit ci-dessous.
25. Préparer des solutions de saccharose dans le tampon EM à des concentrations de 60 %, 32 %, 23 % et 15 % (p/v). Ces solutions sont stables jusqu’à 1 mois à 4 °C. Voir le tableau 1 pour la composition du tampon EM.
26. Préparer un gradient de saccharose en 4 étapes dans un tube ultracentrifuge comme suit : Placer 1,5 mL de saccharose à 60 % (p/v) sur le fond du tube de centrifugeuse. Ensuite, pipettez soigneusement par étapes : 4 mL de 32 %, 1,5 mL de 23 % et 1,5 mL de saccharose à 15 % (p/v). Veillez à ne pas perturber les phases.
27. Chargez soigneusement la fraction mitochondriale brute au-dessus du gradient de saccharose.
28. Centrifuger pendant 1 h à 134 000 x g à 4 °C dans un rotor à godet oscillant.
29. Continuez soigneusement à retirer la solution de saccharose jusqu’à ce que la fraction mitochondriale hautement purifiée soit atteinte, représentée par une bande brune à l’interface 60% / 32% de saccharose.
30. Récupérez les mitochondries purifiées à l’aide d’une pointe de coupe P1000 et placez-la dans un tube de centrifugeuse à grande vitesse pré-refroidi.
31. Diluer les mitochondries récupérées avec 5 à 10 volumes de tampon SEM glacé.
32. Centrifuger pendant 30 min à 12 000 x g à 4 °C.
33. Remettre en suspension les mitochondries pures dans 500 μL de tampon SEM glacé par pipetage doux à l’aide d’une pointe de coupe P1000.
34. Déterminez la concentration en protéines de la préparation mitochondriale hautement purifiée en utilisant la procédure Bradford en suivant les instructions du fabricant. Ajuster la concentration en protéines à 10 mg de protéines/mL avec un tampon SEM glacé.
    REMARQUE: Pour le protocole de fractionnement submitochondrial décrit ci-dessous, il est recommandé d’utiliser des mitochondries fraîchement préparées. Cependant, Vögtle et ses collaborateurs ont effectué une analyse détaillée du contrôle de la qualité de l’intégrité mitochondriale et ont montré que les organites congelés peuvent également être utilisés dans ce ^protocole13. Pour cela, faites des aliquotes de 40 μL et congelez-les dans de l’azote liquide. Conserver à -80 °C.

3. Protocole de fractionnement de la submitochondrie

NOTE : Ce protocole est adapté de la référence ¹⁸ et se compose de deux étapes : (1) gonflement hypotonique en présence ou absence de protéinase K, et (2) sonication suivie d’une extraction carbonatée. Effectuer toutes les étapes des deux protocoles sur glace ou à 4 °C pour éviter la dégradation des protéines.

1. Gonflement hypotonique en présence de protéinase K
   1. Transférer 40 μL de mitochondries hautement purifiées à 10 mg/mL (400 μg) dans quatre tubes de microcentrifuge marqués prérefroidis de 1,5 mL.
   2. Ajouter 360 μL de tampon SEM dans les tubes 1 et 2.
   3. Ajouter 360 μL de tampon EM dans les tubes 3 et 4.
   4. Ajouter 4 μL de protéinase K (10 mg/mL) dans les tubes 2 et 4. Utilisez le schéma de pipetage indiqué dans le tableau 2 pour éviter les erreurs.
      REMARQUE: Préparer une solution de 10 mg / mL de protéinase K dans l’eau immédiatement avant utilisation. La concentration finale de protéinase K dans l’expérience devrait être d’environ 50-100 μg / mL. Veuillez consulter la section Discussion pour plus de détails.
   5. Mélanger doucement tous les tubes et incuber sur de la glace pendant 30 min avec un mélange occasionnel.
   6. Ajouter 4 μL de PMSF de 200 mM aux quatre tubes pour arrêter l’activité de la protéinase K.
      ATTENTION : Le PMSF est très toxique. Portez des gants lorsque vous travaillez avec des solutions contenant du PMSF.
   7. Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
   8. Recueillir le surnageant et le transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation étiqueté prérefroidi de 1,5 mL. Prenez soin d’éviter de perturber la pastille.
      REMARQUE: La pastille peut être directement remise en suspension dans le tampon d’échantillon pour une analyse SDS-PAGE et Western Blot ultérieure. Cependant, les traces de protéinase K peuvent rester actives même après le traitement par PMSF et peuvent éventuellement digérer certaines protéines après la dissolution de la pastille dans le tampon d’échantillon contenant du SDS. Pour éviter ce problème, la protéinase K pourrait être complètement inactivée par le traitement des échantillons avec de l’acide trichloroacétique (TCA) comme décrit ci-dessous.
      ATTENTION : Le TCA est très toxique. Portez des gants lorsque vous travaillez avec des solutions contenant du TCA.
   9. Remettre la pastille de l’étape 3.1.8 dans 400 μL de tampon SEM glacé.
   10. Précipiter le surnageant (à partir de l’étape 3.1.8) et la pastille remise en suspension (à partir de l’étape 3.1.9) avec du TCA jusqu’à une concentration finale de 10 % (p/v).
   11. Incuber tous les tubes sur de la glace pendant 10 min.
   12. Centrifuger les échantillons traités au TCA pendant 10 min à 12 000 x g à 4 °C.
   13. Retirez le surnageant et remettez la pastille dans 200 μL de tampon d’échantillon.
       REMARQUE: Il est possible que l’indicateur de pH bleu de bromophénol jaunisse en raison du traitement à l’acide. Si cela se produit, ajoutez de petites aliquotes (1-5 μL) de base Tris de 1 M jusqu’à ce qu’elle devienne bleue.
   14. Ajouter 4 μL de PMSF de 200 mM à tous les tubes.
   15. Conservez tous les échantillons à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie par SDS-PAGE et Western Blot.
2. Sonication et extraction de carbonate
   REMARQUE: Dans ce protocole, il n’est pas nécessaire d’utiliser des mitochondries fraîchement préparées une fois que la sonication provoque la rupture des membranes mitochondriales.
   1. Transférer 200 μL de mitochondries hautement purifiées à 10 mg/mL (2 mg de protéines) dans un tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 mL.
   2. Diluez les mitochondries d’un seul fois avec un tampon SEM glacé.
   3. Sonicate mitochondria pendant 3 x 30 s sur glace. Utilisez un sonicator compatible pour les petits volumes.
   4. Centrifuger l’échantillon pendant 30 min à 100 000 x g à 4 °C.
   5. Collectez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 mL. Gardez-le sur la glace. Cet échantillon sera nommé fraction protéique soluble (S).
   6. Remettre la pastille de l’étape 3.2.4 dans 400 μL de tampon SEM glacé.
   7. Prenez 100 μL de la pastille remise en suspension de l’étape 3.2.6 et transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 mL. Gardez-le sur la glace. Cet échantillon sera nommé fraction de particules de submitochondrial (SMP).
   8. Diluer les 300 μL restants de l’étape 3.2.6 d’une fois avec du carbonate de sodium de 200 mM fraîchement préparé.
   9. Incuber l’échantillon de l’étape 3.2.8 sur de la glace pendant 30 min.
   10. Centrifuger l’échantillon pendant 30 min à 100 000 x g à 4 °C.
   11. Collectez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 mL. Gardez-le sur la glace. Cet échantillon sera appelé fraction surnageante carbonatée (CS).
   12. Remettre en suspension la pastille de l’étape 3.2.10 dans 400 μL de tampon SEM glacé. Cet échantillon sera appelé fraction précipitée de carbonate (CP).
   13. Précipiter tous les échantillons (S, SMP, CS et CP) avec du TCA à une concentration finale de 10 % (p/v).
   14. Incuber tous les tubes sur de la glace pendant 10 min.
   15. Centrifuger les échantillons traités au TCA pendant 10 min à 12 000 x g à 4 °C.
   16. Retirez le surnageant et remettez en suspension chaque pastille dans le tampon de l’échantillon. Si le tampon de l’échantillon devient jaune, ajouter de petites aliquotes (1-5 μL) de 1 M de base Tris jusqu’à ce qu’il devienne bleu.
   17. Ajouter 1 μL de PMSF de 200 mM à tous les tubes.
   18. Conservez tous les échantillons à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie par SDS-PAGE et Western Blot.

Résultats

Le succès du protocole de fractionnement des submitochondries dépend de l’obtention de mitochondries intactes hautement purifiées. Pour cela, il est essentiel que lors de la lyse des cellules de levure, l’intégrité des organites reste presque totalement préservée. Ceci est réalisé en utilisant un protocole de lyse cellulaire qui combine la digestion enzymatique de la paroi cellulaire suivie d’une perturbation physique de la membrane plasmique à l’aide d’un homogénéisateur Dounce. Le contenu mitochon...

Discussion

Le protocole présenté ici a été utilisé avec succès et optimisé en permanence pendant une longue période pour déterminer la localisation des protéines dans les compartiments soumis13,14,18,21,22,23. La fiabilité et la reproductibilité de ce protocole dépendent fortement de la pureté et de l’intégrité des pr?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast extract	BD	212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A7030	Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815	Component of DDT buffer
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Proteinase K	Sigma-Aldrich
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma-Aldrich	T6399
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus	MP Biomedicals, Irvine, CA	320921	Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast