Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

Resumen

A pesar de los avances recientes, muchas proteínas mitocondriales de levadura aún permanecen con sus funciones completamente desconocidas. Este protocolo proporciona un método sencillo y fiable para determinar la localización submitocondrial de proteínas, que ha sido fundamental para la elucidación de sus funciones moleculares.

Resumen

A pesar de los recientes avances en la caracterización del proteoma mitocondrial de levadura, la localización submitocondrial de un número significativo de proteínas sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí, describimos un método robusto y efectivo para determinar la localización suborganeular de las proteínas mitocondriales de levadura, que se considera un paso fundamental durante la elucidación de la función de la proteína mitocondrial. Este método implica un paso inicial que consiste en obtener mitocondrias intactas altamente puras. Estas preparaciones mitocondriales se someten a un protocolo de subacccionamiento que consiste en shock hipotónico (hinchazón) e incubación con proteinasa K (proteasa). Durante la hinchazón, la membrana mitocondrial externa se interrumpe selectivamente, lo que permite que la proteinasa K digiera las proteínas del compartimento espacial intermembrana. Paralelamente, para obtener información sobre la topología de las proteínas de membrana, las preparaciones mitocondriales se sonican inicialmente y luego se someten a extracción alcalina con carbonato de sodio. Finalmente, después de la centrifugación, las fracciones de pellets y sobrenadantes de estos diferentes tratamientos son analizadas por SDS-PAGE y western blot. La localización submitocondrial así como la topología de membrana de la proteína de interés se obtiene comparando su perfil de western blot con estándares conocidos.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos esenciales de las células eucariotas que desempeñan un papel crucial en la bioenergética, el metabolismo celular y las vías de ^{señalización1}. Para ejecutar adecuadamente estas tareas, las mitocondrias dependen de un conjunto único de proteínas y lípidos responsables de su estructura y función. La levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada como sistema modelo para investigaciones sobre procesos mitocondriales, así como para otros orgánulos2. El genoma mitocondrial codifica solo ocho proteínas en la levadura; la gran mayoría de las proteínas mitocondriales (~99%) están codificadas por genes nucleares, que se traducen en ribosomas citosólicos, y posteriormente se importan a sus compartimentos electorales correctos mediante sofisticadas maquinarias de importación de proteínas3,4,5. Así, la biogénesis mitocondrial depende de la expresión coordinada de los genomas nuclear y ^{mitocondrial6,7}. Las mutaciones genéticas que causan defectos en la biogénesis mitocondrial están asociadas con enfermedades ^{humanas8,9,10}.

En las últimas dos décadas, los estudios proteómicos de alto rendimiento dirigidos a mitocondrias altamente purificadas dieron como resultado una caracterización integral del proteoma mitocondrial de levadura, que se ha estimado que está compuesto por al menos 900 proteínas11,12,13,14. Aunque estos estudios proporcionaron información valiosa, la localización suborganular de cada proteína en los cuatro subcompartimentos mitocondriales, a saber, la membrana externa (OM), el espacio intermembrana (IMS), la membrana interna (IM) y la matriz, todavía es necesaria. Esta cuestión se abordó parcialmente con estudios proteómicos de los dos subcompartimentos mitocondriales más pequeños (OM e IMS)^15,16. Más recientemente, Vögtle y sus colaboradores dieron un gran paso adelante al generar un mapa global de alta calidad de la distribución de proteínas submitochondrial en levadura. Utilizando un enfoque integrado que combina espectrometría de masas cuantitativa basada en SILAC, diferentes protocolos de fraccionamiento submitocondrial y el conjunto de datos de los proteomas OM e IMS, los autores asignaron 818 proteínas a los cuatro subcompartimentos ^{mitocondriales13}.

A pesar de los avances logrados por estos estudios proteómicos de alto rendimiento, nuestro conocimiento sobre la composición del proteoma submitochondrial está lejos de ser completo. De hecho, entre las 986 proteínas reportadas por Vögtle y colaboradores como localizadas en mitocondrias de levadura, 168 no pudieron ser asignadas en ninguno de los cuatro compartimentos submitocondriales13. Además, los autores no proporcionaron información sobre la topología de membrana de las proteínas que se predijo que estaban unidas periféricamente a la periferia de las membranas mitocondriales. Por ejemplo, no es posible saber si una proteína que fue asignada como periféricamente unida a la membrana interna está frente a la matriz o al espacio intermembrana. Aparte de estos datos faltantes de los estudios de todo el proteoma, hay información contradictoria sobre la localización suborganular de un número significativo de proteínas mitocondriales. Un ejemplo es la proteasa Prd1, que ha sido asignada como una proteína espacial intermembrana en las bases de datos comunes como Saccharomyces Genome Database (SGD) y Uniprot. Sorprendentemente, utilizando un protocolo de subfraccionamiento similar al aquí descrito, Vögtle y colaboradores demostraron claramente que Prd1 es una proteína genuina de la ^matriz13. Como se mencionó anteriormente, la localización submitocondrial de muchas proteínas mitocondriales necesita ser dilucidada o reevaluada. Aquí, proporcionamos un protocolo simple y confiable para determinar la localización suborganular de las proteínas mitocondriales de levadura. Este protocolo fue desarrollado y optimizado por diversos grupos de investigación y se ha utilizado de forma rutinaria para determinar la localización submitocondrial, así como la topología de membrana de muchas proteínas mitocondriales.

Protocolo

1. Crecimiento de células de levadura

1. Aísle colonias individuales de la cepa de interés rayando una pequeña porción de las células de una cepa de glicerol de -80 ° C en una placa de agar YPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa). Incubar la placa a 30 °C durante 2-3 días.
   NOTA: La cepa de S. cerevisiae utilizada en este protocolo se deriva de BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Con la excepción de los genes marcadores auxotróficos, esta cepa no contiene ningún gen eliminado y no lleva ningún plásmido. Por lo tanto, se puede cultivar con éxito en un medio rico, estimulando el crecimiento celular vigoroso. Cuando trabaje con cepas transformadas con plásmidos, utilice el medio mínimo apropiado para la selección de plásmidos.
2. Prepare un cultivo iniciador inoculando 2-3 colonias individuales de placa de agar YPD en 10-20 ml de medio YPGal (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de galactosa) en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Incubar a 30 °C durante 24 h con agitación vigorosa.
   NOTA: La elección del medio de crecimiento depende de la cepa de levadura utilizada en el protocolo. Tanto YPD como YPGal contienen fuentes de carbono fermentables, que permiten el crecimiento de cepas que no realizan la respiración mitocondrial. Sin embargo, dado que la glucosa reprime la expresión de muchos genes mitocondriales, no se recomienda utilizar esta fuente de carbono, ya que producirá menores cantidades de mitocondrias. Cuando se trabaja con cepas respiratorias competentes que pueden respirar, también es posible utilizar fuentes de carbono como el glicerol y el etanol en un intento de obtener un mayor rendimiento de mitocondrias.
3. Diluya el cultivo iniciador en 1 L de medio YPGal fresco a un _OD600 inferior a 0.1. Cultive las células a 30 °C con agitación vigorosa hasta que _OD600 alcance 1-1.5.
   NOTA: Determine la tasa de crecimiento (tiempo de duplicación) para cada cepa de levadura antes de realizar el experimento. Esto proporcionará una estimación precisa del tiempo de incubación requerido para que el cultivo alcance un _OD600 de 1-1.5.

2. Aislamiento de mitocondrias altamente purificadas

NOTA: Este protocolo está adaptado ^de17, con modificaciones menores.

1. Cosecha las células por centrifugación a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
2. Lavar las células con agua destilada y recogerlas por centrifugación a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
3. Determinar el peso húmedo de las células.
   NOTA: La forma más fácil de medir el peso del pellet celular a partir del paso 2.2 es determinar el peso del tubo de centrífuga vacío justo antes de la recolección de las celdas. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y mida el peso del mismo tubo con las células. El peso de las células es la diferencia entre las dos medidas.
4. Resuspend las células en tampón de TDT (2 ml por 1 g de células) utilizando una pipeta Pasteur o una punta P5000. Consulte la Tabla 1 para la composición del búfer de DDT.
5. Incubar las células a 30 °C durante 20 min con agitación suave (~70 rpm).
6. Centrifugar a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las células.
7. Lave las células con tampón de zymolyase sin la enzima (aproximadamente 7 ml por 1 g de células).
   Consulte la Tabla 1 para la composición del tampón de la cimoliasa.
8. Centrifugar a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las células.
9. Resuspend las células en el tampón sin Zymolyase (7 mL por 1 g de células).
10. Transfiera la suspensión celular a un matraz Erlenmeyer de 250 ml y agregue Zymolyase-20T (3 mg por g de peso húmedo).
11. Incubar las células a 30 °C durante 30-40 min con agitación suave (~70 rpm). Compruebe la eficiencia de este proceso comparando la turbidez de la suspensión celular antes y después del tratamiento con zymolyase.
    NOTA: En este paso, las células se convertirán en esferoplastos debido a la digestión de la pared celular por la cimoliasa.
    1. Para esto, agregue 50 μL de cada suspensión celular para separar los tubos de vidrio que contienen 2 ml de agua. Después de mezclar vigorosamente, la turbidez de la suspensión celular tratada con Zymolyase debe disminuir rápidamente debido a la interrupción osmótica de los esferoplastos. Por otro lado, la turbidez de la suspensión celular no tratada debe permanecer sin cambios.
       NOTA: Los efectos de la turbidez también se pueden monitorear mediante una simple inspección visual o midiendo el _OD600 de ambas muestras. En el segundo caso, el _OD600 de la muestra tratada con Zymolyase debe ser del 10% al 20% de la muestra no tratada. Un método alternativo consiste en contar las células en ambas muestras mediante el uso de microscopía de luz.
    2. Si el rendimiento de la formación de esferoplastos es bajo, agregue más Zymolyase e incube durante un intervalo adicional de 15 minutos.
12. Cosecha los esferoplastos por centrifugación a 2500 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: Todos los pasos adicionales deben llevarse a cabo rápidamente y en hielo o a 4 ° C para evitar la degradación de proteínas por enzimas hidrolíticas.
13. Lavar los esferoplastos dos veces con tampón de homogeneización en frío helado (aproximadamente 6,5 ml por 1 g de células) y pellet centrifugando a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C. Consulte la Tabla 1 para la composición del tampón de homogeneización.
14. Resuspend los esferoplastos en tampón de homogeneización helado -frío (6,5 ml por 1 g de células) y transfiéralo a un homogeneizador Dounce de vidrio preenfriado. Utilice un homogeneizador de vidrio grande de aproximadamente 30 ml.
15. Homogeneizar los esferoplastos con 15 golpes usando un mortero.
    NOTA: El número de golpes debe ajustarse dependiendo del ajuste del mortero. Para el mortero apretado, 15 golpes son suficientes. Por otro lado, si se utiliza un mortero suelto, se recomienda realizar hasta 25 golpes.
16. Transfiera el homogeneizado a un tubo centrífugo de 50 ml y agregue 1 volumen de tampón de homogeneización en frío helado.
17. Centrifugar el homogeneizado a baja velocidad, 1.500 x g durante 5 min a 4 °C para granular núcleos, restos celulares y células intactas.
18. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una pipeta Pasteur o una punta P5000 teniendo cuidado de evitar que se interrumpa el pellet.
19. Centrifugadora a 4.000 x g durante 5 min a 4 °C.
20. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de alta velocidad y centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C para granular la fracción cruda de mitocondrias.
21. Deseche el sobrenadante y lave suavemente el gránulo mitocondrial crudo en un tampón de homogeneización helada de 20-30 ml mediante un pipeteo suave con una punta P5000.
22. Transfiera la suspensión a un tubo centrífugo de 50 ml y centrífuga a 4.000 x g durante 5 min a 4 °C para granular los restos celulares.
23. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de alta velocidad y centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C para granular la fracción cruda de mitocondrias.
24. Deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet mitocondrial crudo en un pequeño volumen (típicamente 1000 μL) de tampón SEM helado mediante pipeteo suave con una punta P1000. Consulte la Tabla 1 para la composición del búfer SEM.
    NOTA: Aunque esta fracción mitocondrial cruda se puede utilizar directamente en algunas aplicaciones, como en ensayos de importación de proteínas organello , contiene cantidades sustanciales de otros componentes celulares. Estas contaminaciones pueden dar lugar a interpretaciones erróneas de los resultados al determinar la localización clientelar de una proteína. Por lo tanto, se requieren más pasos de purificación para obtener una preparación mitocondrial altamente purificada, como se describe a continuación.
25. Preparar soluciones de sacarosa en el tampón EM a concentraciones de 60%, 32%, 23% y 15% (p/v). Estas soluciones son estables hasta por 1 mes a 4 °C. Consulte la Tabla 1 para la composición del búfer EM.
26. Prepare un gradiente de sacarosa de 4 pasos en un tubo de ultracentrífuga de la siguiente manera: Coloque 1.5 ml de sacarosa al 60% (p/ v) en la parte inferior del tubo de centrífuga. A continuación, pipetee cuidadosamente paso a paso: 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23% y 1,5 ml de sacarosa al 15% (p/v). Tenga cuidado de no interrumpir las fases.
27. Cargue cuidadosamente la fracción mitocondrial cruda sobre el gradiente de sacarosa.
28. Centrífuga durante 1 h a 134.000 x g a 4 °C en un rotor de cucharón oscilante.
29. Mantenga cuidadosamente la eliminación de la solución de sacarosa hasta que se alcance la fracción mitocondrial altamente purificada, que está representada por una banda marrón en la interfaz de sacarosa al 60% / 32%.
30. Recupere las mitocondrias purificadas con una punta cortada P1000 y colóquela en un tubo de centrífuga de alta velocidad preenfriado.
31. Diluya las mitocondrias recuperadas con 5-10 volúmenes de tampón SEM helado.
32. Centrifugadora durante 30 min a 12.000 x g a 4 °C.
33. Resuspend las mitocondrias puras en 500 μL de tampón SEM helado mediante pipeteo suave con una punta cortada P1000.
34. Determine la concentración de proteínas de la preparación mitocondrial altamente purificada utilizando el procedimiento de Bradford siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajuste la concentración de proteína a 10 mg de proteína/ml con tampón SEM helado.
    NOTA: Para el protocolo de fraccionamiento submitochondrial que se describe a continuación, se recomienda utilizar mitocondrias recién preparadas. Sin embargo, Vögtle y colaboradores realizaron un detallado análisis de control de calidad de la integridad mitocondrial y demostraron que los orgánulos congelados también pueden ser utilizados en este ^protocolo13. Para ello, hacer alícuotas de 40 μL y congelarlas en nitrógeno líquido. Conservar a -80 °C.

3. Protocolo de fraccionamiento Submitochondrial

NOTA: Este protocolo está adaptado de la ^referencia18 y se compone de dos pasos: (1) hinchazón hipotónica en presencia o ausencia de proteinasa K, y (2) sonicación seguida de extracción de carbonato. Realice todos los pasos de ambos protocolos en hielo o a 4 °C para evitar la degradación de proteínas.

1. Hinchazón hipotónica en presencia de proteinasa K
   1. Transfiera 40 μL de mitocondrias altamente purificadas a 10 mg/mL (400 μg) en cuatro tubos de microcentrífuga etiquetados preenfriados de 1,5 ml.
   2. Añadir 360 μL de tampón SEM en los tubos 1 y 2.
   3. Añadir 360 μL de tampón EM en los tubos 3 y 4.
   4. Añadir 4 μL de proteinasa K (10 mg/ml) en los tubos 2 y 4. Utilice el esquema de pipeteo que aparece en la Tabla 2 para evitar errores.
      NOTA: Prepare una solución de 10 mg/ml de proteinasa K en agua inmediatamente antes de su uso. La concentración final de proteinasa K en el experimento debe ser de alrededor de 50-100 μg/mL. Consulte la sección Discusión para obtener más detalles.
   5. Mezclar todos los tubos suavemente e incubar en hielo durante 30 min con mezcla ocasional.
   6. Agregue 4 μL de PMSF de 200 mM a los cuatro tubos para detener la actividad de la proteinasa K.
      PRECAUCIÓN: El PMSF es altamente tóxico. Use guantes cuando trabaje con soluciones que contengan PMSF.
   7. Centrifugadora a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C.
   8. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga etiquetado preenfriado de 1,5 ml. Tenga cuidado de evitar la interrupción del pellet.
      NOTA: El pellet se puede resuspendir directamente en el búfer de muestra para un análisis adicional de SDS-PAGE y western blot. Sin embargo, los rastros de proteinasa K pueden permanecer activos incluso después del tratamiento con PMSF y, finalmente, pueden digerir algunas proteínas después de que el pellet se haya disuelto en el tampón de muestra que contiene SDS. Para evitar este problema, la proteinasa K podría ser completamente inactivada por el tratamiento de las muestras con ácido tricloroacético (TCA) como se describe a continuación.
      PRECAUCIÓN: El TCA es altamente tóxico. Use guantes cuando trabaje con soluciones que contengan TCA.
   9. Resuspend el pellet desde el paso 3.1.8 en 400 μL de tampón SEM helado.
   10. Precipitar el sobrenadante (a partir del paso 3.1.8) y el pellet resuspendido (a partir del paso 3.1.9) con TCA a una concentración final del 10% (p/v).
   11. Incubar todos los tubos en hielo durante 10 min.
   12. Centrifugar las muestras tratadas con TCA durante 10 min a 12.000 x g a 4 °C.
   13. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 200 μL de tampón de muestra.
       NOTA: Es posible que el indicador de pH azul de bromofenol se vuelva amarillo debido al tratamiento ácido. Si esto sucede, agregue pequeñas alícuotas (1-5 μL) de 1 M de base Tris hasta que se vuelva azul.
   14. Añadir 4 μL de PMSF de 200 mM a todos los tubos.
   15. Almacene todas las muestras a -80 °C hasta su posterior análisis por SDS-PAGE y western blot.
2. Sonicación y extracción de carbonato
   NOTA: En este protocolo, no es necesario utilizar mitocondrias recién preparadas una vez que la sonicación provoca la ruptura de las membranas mitocondriales.
   1. Transfiera 200 μL de mitocondrias altamente purificadas a 10 mg/ml (2 mg de proteína) a un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml.
   2. Diluya las mitocondrias una sola vez con un tampón SEM helado.
   3. Sonicar mitocondrias durante 3 x 30 s sobre hielo. Utilice un sonicador compatible para pequeños volúmenes.
   4. Centrifugar la muestra durante 30 min a 100.000 x g a 4 °C.
   5. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Manténgalo en hielo. Esta muestra se denominará fracción de proteína soluble (S).
   6. Resuspenda el pellet del paso 3.2.4 en 400 μL de tampón SEM helado.
   7. Tome 100 μL del pellet resuspendido del paso 3.2.6 y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Manténgalo en hielo. Esta muestra se denominará fracción de partículas submitochondrial (SMP).
   8. Diluya los 300 μL restantes del paso 3.2.6 una vez con carbonato de sodio de 200 mM recién preparado.
   9. Incubar la muestra a partir del paso 3.2.8 en hielo durante 30 min.
   10. Centrifugar la muestra durante 30 min a 100.000 x g a 4 °C.
   11. Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml. Manténgalo en hielo. Esta muestra se denominará fracción sobrenadante de carbonato (CS).
   12. Resuspender el pellet del paso 3.2.10 en 400 μL de tampón SEM helado. Esta muestra se denominará fracción precipitada de carbonato (CP).
   13. Precipitar todas las muestras (S, SMP, CS y CP) con TCA a una concentración final del 10% (p/v).
   14. Incubar todos los tubos en hielo durante 10 min.
   15. Centrifugar las muestras tratadas con TCA durante 10 min a 12.000 x g a 4 °C.
   16. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo en el tampón de muestra. Si el tampón de la muestra se vuelve amarillo, agregue pequeñas alícuotas (1-5 μL) de 1 M de base Tris hasta que se vuelva azul.
   17. Añadir 1 μL de 200 mM PMSF a todos los tubos.
   18. Almacene todas las muestras a -80 °C hasta su posterior análisis por SDS-PAGE y western blot.

Resultados

El éxito del protocolo de fraccionamiento submitochondrial depende de la obtención de mitocondrias intactas altamente purificadas. Para ello, es fundamental que durante la lisis celular de levadura, la integridad de los orgánulos permanezca casi totalmente conservada. Esto se logra mediante el uso de un protocolo de lisis celular que combina la digestión enzimática de la pared celular seguida de la interrupción física de la membrana plasmática mediante el uso de un homogeneizador Dounce. El contenido mitocondrial...

Discusión

El protocolo aquí presentado ha sido utilizado con éxito y optimizado continuamente durante mucho tiempo para determinar la localización de proteínas en los compartimentos peticionarios13,14,18,21,22,23. La fiabilidad y reproducibilidad de este protocolo dependen en gran medida de la pureza e integridad de los preparados ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast extract	BD	212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A7030	Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815	Component of DDT buffer
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Proteinase K	Sigma-Aldrich
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma-Aldrich	T6399
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus	MP Biomedicals, Irvine, CA	320921	Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast