Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Zusammenfassung

Trotz der jüngsten Fortschritte bleiben viele mitochondriale Hefeproteine mit ihren Funktionen völlig unbekannt. Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung der submitochondrialen Lokalisation von Proteinen, die für die Aufklärung ihrer molekularen Funktionen von grundlegender Bedeutung war.

Zusammenfassung

Trotz der jüngsten Fortschritte bei der Charakterisierung des mitochondrialen Proteoms von Hefe bleibt die submitochondriale Lokalisation einer signifikanten Anzahl von Proteinen schwer fassbar. Hier beschreiben wir eine robuste und effektive Methode zur Bestimmung der suborganellaren Lokalisation von hefigen mitochondrialen Proteinen, die als grundlegender Schritt bei der mitochondrialen Proteinfunktionsaufklärung angesehen wird. Diese Methode beinhaltet einen ersten Schritt, der darin besteht, hochreine intakte Mitochondrien zu erhalten. Diese mitochondrialen Präparate werden dann einem Subfraktionierungsprotokoll unterzogen, das aus hypotonem Schock (Schwellung) und Inkubation mit Proteinase K (Protease) besteht. Während der Schwellung wird die äußere mitochondriale Membran selektiv gestört, so dass die Proteinase K Proteine des Intermembranraumkompartiments verdauen kann. Parallel dazu werden die mitochondrialen Präparate, um Informationen über die Topologie von Membranproteinen zu erhalten, zunächst beschallt und dann einer alkalischen Extraktion mit Natriumcarbonat unterzogen. Schließlich werden nach der Zentrifugation die Pellet- und Überstandfraktionen aus diesen verschiedenen Behandlungen mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. Die submitochondriale Lokalisation sowie die Membrantopologie des interessierenden Proteins wird durch den Vergleich seines Western-Blot-Profils mit bekannten Standards erhalten.

Einleitung

Mitochondrien sind essentielle Organellen eukaryotischer Zellen, die eine entscheidende Rolle in der Bioenergetik, im Zellstoffwechsel und in Signalwegen ^spielen1. Um diese Aufgaben richtig auszuführen, verlassen sich Die Mitochondrien auf einen einzigartigen Satz von Proteinen und Lipiden, die für ihre Struktur und Funktion verantwortlich sind. Die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde häufig als Modellsystem für Untersuchungen an mitochondrialen Prozessen sowie für andere Organellen ^verwendet2. Das mitochondriale Genom kodiert für nur acht Proteine in Hefe; Die überwiegende Mehrheit der mitochondrialen Proteine (~99%) wird von Kerngenen kodiert, die auf zytosolische Ribosomen übersetzt und anschließend von hochentwickelten Proteinimportmaschinen in ihre korrekten submitochondrialen Kompartimente importiert ^werden3,4,5. Somit hängt die mitochondriale Biogenese von der koordinierten Expression sowohl des kernigen als auch des mitochondrialen Genoms ^ab6,7. Genetische Mutationen, die Defekte in der mitochondrialen Biogenese verursachen, sind mit menschlichen Krankheiten assoziiert8,9,10.

In den letzten zwei Jahrzehnten führten Hochdurchsatz-Proteomstudien, die auf hochreine Mitochondrien abzielten, zu einer umfassenden Charakterisierung des hefe-mitochondrialen Proteoms, das schätzungsweise aus mindestens 900 Proteinen besteht11,12,13,14. Obwohl diese Studien wertvolle Informationen lieferten, ist die suborganellare Lokalisation jedes Proteins in den vier mitochondrialen Unterkompartimenten, nämlich der äußeren Membran (OM), dem Intermembranraum (IMS), der inneren Membran (IM) und der Matrix, immer noch erforderlich. Diese Frage wurde teilweise mit proteomweiten Studien der beiden kleineren mitochondrialen Unterkompartimente (OM und IMS)^{15,16 beantwortet}. In jüngerer Zeit haben Vögtle und seine Mitarbeiter einen großen Schritt nach vorne gemacht, indem sie eine qualitativ hochwertige globale Karte der submitochondrialen Proteinverteilung in Hefe erstellt haben. Unter Verwendung eines integrierten Ansatzes, der SILAC-basierte quantitative Massenspektrometrie, verschiedene submitochondriale Fraktionierungsprotokolle und den Datensatz aus den OM- und IMS-Proteomen kombiniert, ordneten die Autoren den vier mitochondrialen Unterkompartimenten 818 Proteine ^zu13 zu.

Trotz der Fortschritte, die durch diese Hochdurchsatz-Proteomstudien erzielt wurden, ist unser Wissen über die Zusammensetzung des submitochondrialen Proteoms noch lange nicht vollständig. Tatsächlich konnten von den 986 Proteinen, von denen Vögtle und Mitarbeiter berichteten, dass sie in Hefemitochondrien lokalisiert sind, 168 keinem der vier submitochondrialen Kompartimente zugeordnet ^werden13. Darüber hinaus lieferten die Autoren keine Informationen über die Membrantopologie von Proteinen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie peripher an die Peripherie mitochondrialer Membranen gebunden sind. Zum Beispiel ist es nicht möglich zu wissen, ob ein Protein, das als peripher an die innere Membran gebunden zugeordnet wurde, der Matrix oder dem Intermembranraum zugewandt ist. Abgesehen von diesen fehlenden Daten aus den proteomweiten Studien gibt es widersprüchliche Informationen über die suborganellare Lokalisation einer signifikanten Anzahl von mitochondrialen Proteinen. Ein Beispiel ist die Protease Prd1, die in den gängigen Datenbanken wie Saccharomyces Genome Database (SGD) und Uniprot als Intermembranraumprotein zugeordnet wurde. Überraschenderweise zeigten Vögtle und seine Mitarbeiter mit einem Subfraktionierungsprotokoll ähnlich dem hier beschriebenen deutlich, dass Prd1 ein echtes Matrixprotein ^ist13. Wie oben erwähnt, muss die submitochondriale Lokalisation vieler mitochondrialer Proteine aufgeklärt oder neu bewertet werden. Hier stellen wir ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zur Verfügung, um die suborganellare Lokalisation von hefigen mitochondrialen Proteinen zu bestimmen. Dieses Protokoll wurde von verschiedenen Forschungsgruppen entwickelt und optimiert und wurde routinemäßig verwendet, um die submitochondriale Lokalisation sowie die Membrantopologie vieler mitochondrialer Proteine zu bestimmen.

Protokoll

1. Wachstum von Hefezellen

1. Isolieren Sie einzelne Kolonien des interessierenden Stammes, indem Sie einen kleinen Teil der Zellen aus einem -80 °C Glycerinvorrat auf eine YPD-Agarplatte (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose) streifen. Die Platte bei 30 °C für 2-3 Tage inkubieren.
   HINWEIS: Der in diesem Protokoll verwendete Stamm S. cerevisiae ist von BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Mit Ausnahme der auxotrophen Markergene enthält dieser Stamm kein gelöschtes Gen und trägt kein Plasmid. So kann es erfolgreich in einem reichen Medium kultiviert werden und stimuliert kräftiges Zellwachstum. Wenn Sie mit Stämmen arbeiten, die mit Plasmiden transformiert wurden, verwenden Sie das geeignete minimale Medium für die Plasmidauswahl.
2. Bereiten Sie eine Starterkultur vor, indem Sie 2-3 einzelne Kolonien aus YPD-Agarplatte in 10-20 ml YPGal-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Galaktose) in einem 100 ml Erlenmeyerkolben impfen. Bei 30 °C 24 h mit kräftigem Schütteln inkubieren.
   HINWEIS: Die Wahl des Wachstumsmediums hängt von dem im Protokoll verwendeten Hefestamm ab. Sowohl YPD als auch YPGal enthalten fermentierbare Kohlenstoffquellen, die das Wachstum von Stämmen ermöglichen, die keine mitochondriale Atmung durchführen. Da Glukose jedoch die Expression vieler mitochondrialer Gene unterdrückt, wird nicht empfohlen, diese Kohlenstoffquelle zu verwenden, da sie geringere Mengen an Mitochondrien produziert. Bei der Arbeit mit atemaktiven Atemwegsstämmen ist es auch möglich, Kohlenstoffquellen wie Glycerin und Ethanol zu verwenden, um eine höhere Ausbeute an Mitochondrien zu erzielen.
3. Verdünnen Sie die Starterkultur in 1 l frisches YPGal-Medium auf ein _OD600 kleiner als 0,1. Kultivieren Sie die Zellen bei 30 °C mit kräftigem Schütteln, bis _OD600 1-1,5 erreicht.
   HINWEIS: Bestimmen Sie die Wachstumsrate (Verdopplungszeit) für jeden Hefestamm, bevor Sie den Versuch durchführen. Dies liefert eine genaue Schätzung der Inkubationszeit, die erforderlich ist, damit die Kultur einen _OD600 von 1-1,5 erreicht.

2. Isolierung hochreiner Mitochondrien

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von ¹⁷ mit geringfügigen Änderungen angepasst.

1. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
2. Waschen Sie die Zellen mit destilliertem Wasser und sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Bestimmen Sie das Nassgewicht der Zellen.
   HINWEIS: Der einfachste Weg, das Gewicht des Zellpellets aus Schritt 2.2 zu messen, besteht darin, das Gewicht des leeren Zentrifugenröhrchens kurz vor der Sammlung der Zellen zu bestimmen. Verwerfen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und messen Sie das Gewicht desselben Röhrchens mit den Zellen. Das Gewicht der Zellen ist die Differenz zwischen den beiden Messungen.
4. Resuspendieren Sie die Zellen in DTT-Puffer (2 ml pro 1 g Zellen) mit einer Pasteur-Pipette oder P5000-Spitze. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des DDT-Puffers.
5. Inkubieren Sie die Zellen bei 30 °C für 20 min mit sanftem Schütteln (~70 U/min).
6. Zentrifugiere bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
7. Waschen Sie die Zellen mit Zymolyase-Puffer ohne das Enzym (ca. 7 ml pro 1 g Zellen).
   Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des Zymolyasepuffers.
8. Zentrifugiere bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
9. Resuspendieren Sie die Zellen im Puffer ohne Zymolyase (7 ml pro 1 g Zellen).
10. Die Zellsuspension wird in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und mit Zymolyase-20T (3 mg pro g Nassgewicht) versetzt.
11. Inkubieren Sie die Zellen bei 30 °C für 30-40 min mit sanftem Schütteln (~70 U/min). Überprüfen Sie die Wirksamkeit dieses Prozesses, indem Sie die Trübung der Zellsuspension vor und nach der Zymolyase-Behandlung vergleichen.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden die Zellen aufgrund der Zellwandverdauung durch Zymolyase in Spheroplasten umgewandelt.
    1. Dazu werden 50 μL jeder Zellsuspension in separate Glasröhrchen mit 2 mL Wasser gegeben. Nach kräftigem Mischen sollte die Trübung der mit Zymolyase behandelten Zellsuspension aufgrund der osmotischen Störung von Spheroplasten schnell abnehmen. Andererseits sollte die Trübung der unbehandelten Zellsuspension unverändert bleiben.
       HINWEIS: Die Auswirkungen der Trübung können auch durch einfache Sichtprüfung oder durch Messung des _OD600 beider Proben überwacht werden. Im zweiten Fall sollte die _OD600 der mit Zymolyase behandelten Probe 10% -20% der nicht behandelten Probe betragen. Eine alternative Methode besteht darin, die Zellen in beiden Proben mit Hilfe der Lichtmikroskopie zu zählen.
    2. Wenn die Ausbeute der Spheroplastenbildung gering ist, fügen Sie mehr Zymolyase hinzu und inkubieren Sie für weitere 15 Minuten.
12. Ernten Sie die Spheroplasten durch Zentrifugation bei 2500 x g für 5 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Alle weiteren Schritte sollten schnell und auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt werden, um den Proteinabbau durch hydrolytische Enzyme zu vermeiden.
13. Waschen Sie die Spheroplasten zweimal mit eiskaltem Homogenisierungspuffer (ca. 6,5 ml pro 1 g Zellen) und Pellet durch Zentrifugieren bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C. Siehe Tabelle 1 zur Zusammensetzung des Homogenisierungspuffers.
14. Resuspendieren Sie die Spheroplasten in eiskaltem Homogenisierungspuffer (6,5 ml pro 1 g Zellen) und übertragen Sie sie in einen vorgekühlten Glas-Dounce-Homogenisator. Verwenden Sie einen großen Glashomogenisator von ca. 30 ml.
15. Homogenisieren Sie die Sphäroplasten mit 15 Schlägen mit einem Stößel.
    HINWEIS: Die Anzahl der Hübe sollte in Abhängigkeit von der Stößelanpassung angepasst werden. Für einen dichten Stößel reichen 15 Schläge aus. Auf der anderen Seite, wenn Sie einen losen Stößel verwenden, wird empfohlen, bis zu 25 Schläge durchzuführen.
16. Das Homogenat in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben und 1 Volumen eiskalten Homogenisierungspuffer hinzufügen.
17. Zentrifugieren Sie das Homogenat mit niedriger Geschwindigkeit, 1.500 x g für 5 min bei 4 °C, um Kerne, Zelltrümmer und ungebrochene Zellen zu pelletieren.
18. Überführen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette oder einer P5000-Spitze auf ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass das Pellet nicht gestört wird.
19. Zentrifuge bei 4.000 x g für 5 min bei 4 °C.
20. Den Überstand in ein Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um die rohe Mitochondrienfraktion zu pelletieren.
21. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das rohe mitochondriale Pellet vorsichtig in 20-30 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer durch sanftes Pipettieren mit einer P5000-Spitze.
22. Die Suspension wird in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 4.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, um die verbleibenden Zelltrümmer zu pelletieren.
23. Den Überstand in ein Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um die rohe Mitochondrienfraktion zu pelletieren.
24. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das rohe mitochondriale Pellet vorsichtig in einem kleinen Volumen (typischerweise 1000 μL) eiskaltem REM-Puffer durch sanftes Pipettieren mit einer P1000-Spitze. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des REM-Puffers.
    HINWEIS: Obwohl diese rohe mitochondriale Fraktion in einigen Anwendungen direkt verwendet werden kann, z. B. in Organello-Protein-Import-Assays, enthält sie erhebliche Mengen anderer zellulärer Komponenten. Diese Kontaminationen können zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse bei der Bestimmung der submitochondrialen Lokalisation eines Proteins führen. Daher sind weitere Reinigungsschritte erforderlich, um eine hochreine mitochondriale Zubereitung zu erhalten, wie unten beschrieben.
25. Saccharoselösungen im EM-Puffer in Konzentrationen von 60%, 32%, 23% und 15% (w/v) herstellen. Diese Lösungen sind bis zu 1 Monat bei 4 °C stabil. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des EM-Puffers.
26. Bereiten Sie einen 4-stufigen Saccharosegradienten in einem Ultrazentrifugenröhrchen wie folgt vor: Geben Sie 1,5 ml 60% (w/v) Saccharose auf den Boden des Zentrifugenröhrchens. Als nächstes vorsichtig schrittweise pipettieren: 4 ml von 32%, 1,5 ml von 23% und 1,5 ml von 15% Saccharose (w / v). Achten Sie darauf, die Phasen nicht zu stören.
27. Laden Sie vorsichtig die rohe mitochondriale Fraktion auf den Saccharosegradienten.
28. Zentrifuge für 1 h bei 134.000 x g bei 4 °C in einem schwingenden Schaufelrotor.
29. Entfernen Sie die Saccharoselösung vorsichtig, bis die hochgereinigte Mitochondrienfraktion erreicht ist, die durch ein braunes Band an der 60% / 32% Saccharose-Grenzfläche dargestellt wird.
30. Gewinnen Sie die gereinigten Mitochondrien mit einer P1000-Schnittspitze zurück und legen Sie sie in ein vorgekühltes Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenrohr.
31. Verdünnen Sie die wiederhergestellten Mitochondrien mit 5-10 Volumen eiskaltem REM-Puffer.
32. Zentrifuge für 30 min bei 12.000 x g bei 4 °C.
33. Resuspendieren Sie die reinen Mitochondrien in 500 μL eiskaltem REM-Puffer durch sanftes Pipettieren mit einer P1000-Schnittspitze.
34. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des hochgereinigten mitochondrialen Präparats mit dem Bradford-Verfahren nach den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie die Proteinkonzentration mit eiskaltem REM-Puffer auf 10 mg Protein/ml ein.
    HINWEIS: Für das unten beschriebene submitochondriale Fraktionierungsprotokoll wird empfohlen, frisch zubereitete Mitochondrien zu verwenden. Vögtle und seine Mitarbeiter führten jedoch eine detaillierte Qualitätskontrollanalyse der mitochondrialen Unversehrtheit durch und zeigten, dass gefrorene Organellen auch in diesem Protokoll verwendet werden ^können13. Machen Sie dazu Aliquots von 40 μL und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein. Bei -80 °C lagern.

3. Submitochondriales Fraktionierungsprotokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von ^Referenz18 adaptiert und besteht aus zwei Schritten: (1) hypotonische Schwellung in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinase K und (2) Beschallung, gefolgt von einer Karbonatextraktion. Führen Sie alle Schritte beider Protokolle auf Eis oder bei 4 ° C durch, um den Proteinabbau zu vermeiden.

1. Hypotonische Schwellung in Gegenwart von Proteinase K
   1. Transfer von 40 μL hochreinen Mitochondrien bei 10 mg/ml (400 μg) in vier 1,5 ml vorgekühlte markierte Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. 360 μL REM-Puffer in die Röhrchen 1 und 2 geben.
   3. 360 μL EM-Puffer in die Röhrchen 3 und 4 geben.
   4. 4 μL Proteinase K (10 mg/ml) werden in die Röhrchen 2 und 4 gegeben. Verwenden Sie das in Tabelle 2 aufgeführte Pipettierschema, um Fehler zu vermeiden.
      HINWEIS: Bereiten Sie unmittelbar vor Gebrauch eine 10 mg/ml-Lösung der Proteinase K in Wasser vor. Die Endkonzentration der Proteinase K im Experiment sollte bei etwa 50-100 μg/ml liegen. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Diskussion .
   5. Mischen Sie alle Röhrchen vorsichtig und inkubieren Sie auf Eis für 30 min mit gelegentlichem Mischen.
   6. Fügen Sie 4 μL 200 mM PMSF zu allen vier Röhrchen hinzu, um die Proteinase-K-Aktivität zu stoppen.
      VORSICHT: PMSF ist hochgiftig. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit Lösungen arbeiten, die PMSF enthalten.
   7. Zentrifuge bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C.
   8. Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein neues 1,5 ml vorgekühltes markiertes Mikrozentrifugenröhrchen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
      HINWEIS: Das Pellet kann direkt im Probenpuffer für weitere SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen resuspendiert werden. Spuren von Proteinase K können jedoch auch nach der PMSF-Behandlung aktiv bleiben und schließlich einige Proteine verdauen, nachdem das Pellet im SDS-haltigen Probenpuffer gelöst wurde. Um dieses Problem zu vermeiden, könnte die Proteinase K durch die Behandlung der Proben mit Trichloressigsäure (TCA) wie unten beschrieben vollständig inaktiviert werden.
      VORSICHT: TCA ist hochgiftig. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit Lösungen arbeiten, die TCA enthalten.
   9. Resuspendieren Sie das Pellet aus Schritt 3.1.8 in 400 μL eiskaltem REM-Puffer.
   10. Den Überstand (ab Schritt 3.1.8) und das resuspendierte Pellet (ab Schritt 3.1.9) mit TCA auf eine Endkonzentration von 10 % (w/v) auszubringen.
   11. Alle Röhrchen 10 Minuten auf Eis inkubieren.
   12. Zentrifugieren Sie die TCA-behandelten Proben für 10 min bei 12.000 x g bei 4 °C.
   13. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Pellet in 200 μL Probenpuffer.
       HINWEIS: Es ist möglich, dass der Bromphenolblau-pH-Indikator aufgrund der Säurebehandlung gelb wird. Wenn dies geschieht, fügen Sie kleine Aliquots (1-5 μL) von 1 M Tris Base hinzu, bis sie blau wird.
   14. Fügen Sie 4 μL 200 mM PMSF zu allen Röhrchen hinzu.
   15. Alle Proben bis zur weiteren Analyse durch SDS-PAGE und Western Blot bei -80 °C lagern.
2. Beschallung und Karbonatextraktion
   HINWEIS: In diesem Protokoll ist es nicht notwendig, frisch zubereitete Mitochondrien zu verwenden, sobald die Beschallung den Bruch der mitochondrialen Membranen verursacht.
   1. Übertragen Sie 200 μL hochgereinigte Mitochondrien mit 10 mg/ml (2 mg Protein) in ein 1,5 ml vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Verdünnen Sie die Mitochondrien einfach mit eiskaltem REM-Puffer.
   3. Beschallung der Mitochondrien für 3 x 30 s auf Eis. Verwenden Sie einen Ultraschallgerät, das für kleine Volumina kompatibel ist.
   4. Zentrifugieren Sie die Probe für 30 min bei 100.000 x g bei 4 °C.
   5. Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein neues 1,5 ml vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie es auf Eis. Diese Probe wird als lösliche Proteinfraktion (S) bezeichnet.
   6. Resuspendieren Sie das Pellet aus Schritt 3.2.4 in 400 μL eiskaltem REM-Puffer.
   7. Nehmen Sie 100 μL des resuspendierten Pellets aus Schritt 3.2.6 und geben Sie es in ein neues 1,5 ml vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie es auf Eis. Diese Probe wird als Submitochondriale Partikelfraktion (SMP) bezeichnet.
   8. Die restlichen 300 μL aus Schritt 3.2.6 werden einfach mit frisch zubereitetem 200 mM Natriumcarbonat verdünnt.
   9. Die Probe aus Schritt 3.2.8 wird 30 min auf Eis inkubiert.
   10. Zentrifugieren Sie die Probe für 30 min bei 100.000 x g bei 4 °C.
   11. Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein neues 1,5 ml vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie es auf Eis. Diese Probe wird als Carbonat-Überstandsfraktion (CS) bezeichnet.
   12. Resuspendieren Sie das Pellet aus Schritt 3.2.10 in 400 μL eiskaltem REM-Puffer. Diese Probe wird als Carbonate Precipitated Fraction (CP) bezeichnet.
   13. Alle Proben (S, SMP, CS und CP) mit TCA auf eine Endkonzentration von 10% (w/v) niederschlagen.
   14. Alle Röhrchen 10 Minuten auf Eis inkubieren.
   15. Zentrifugieren Sie die TCA-behandelten Proben für 10 min bei 12.000 x g bei 4 °C.
   16. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet im Probenpuffer. Wenn der Probenpuffer gelb wird, fügen Sie kleine Aliquots (1-5 μL) von 1 M Tris Base hinzu, bis er blau wird.
   17. Geben Sie 1 μL 200 mM PMSF zu allen Röhrchen hinzu.
   18. Alle Proben bis zur weiteren Analyse durch SDS-PAGE und Western Blot bei -80 °C lagern.

Ergebnisse

Der Erfolg des submitochondrialen Fraktionierungsprotokolls hängt von der Gewinnung hochgereinigter intakter Mitochondrien ab. Dazu ist es wichtig, dass während der Hefezelllyse die Unversehrtheit der Organellen nahezu vollständig erhalten bleibt. Dies wird durch die Verwendung eines Zelllyseprotokolls erreicht, das den enzymatischen Aufschluss der Zellwand mit anschließender physikalischer Störung der Plasmamembran unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators kombiniert. Die mitochondrialen Inhalte werden dann durc...

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll wird seit langem erfolgreich eingesetzt und kontinuierlich optimiert, um die Proteinlokalisation in den submitochondrialen Kompartimenten zu bestimmen13,14,18,21,22,23. Die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit dieses Protokolls hängen stark von der Reinheit und Integrität der mitochondrial...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast extract	BD	212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A7030	Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815	Component of DDT buffer
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Proteinase K	Sigma-Aldrich
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma-Aldrich	T6399
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus	MP Biomedicals, Irvine, CA	320921	Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast