Оценка локализации субпохондриального белка в почковых дрожжах Saccharomyces cerevisiae

Резюме

Несмотря на недавние достижения, многие дрожжевые митохондриальные белки по-прежнему остаются со своими функциями совершенно неизвестными. Этот протокол обеспечивает простой и надежный метод определения субтохондриальной локализации белков, который был основополагающим для выяснения их молекулярных функций.

Аннотация

Несмотря на недавние успехи в характеристике митохондриального протеома дрожжей, субпохондриальная локализация значительного числа белков остается неуловимой. Здесь мы описываем надежный и эффективный метод определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков, который считается фундаментальным шагом при выяснении функции митохондриального белка. Этот метод включает в себя начальный этап, который заключается в получении высокочистых интактных митохондрий. Эти митохондриальные препараты затем подвергают протоколу субфракционации, состоящему из гипотонического шока (отека) и инкубации с протеиназой К (протеазой). Во время отека внешняя митохондриальная мембрана избирательно нарушается, позволяя протеиназе К переваривать белки межмембранного космического отсека. Параллельно для получения информации о топологии мембранных белков митохондриальные препараты сначала обрабатывают ультразвуком, а затем подвергают щелочной экстракции карбонатом натрия. Наконец, после центрифугирования фракции гранул и супернатантов из этих различных обработок анализируются с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Постохондриальная локализация, а также мембранная топология интересующего белка получены путем сравнения его западного блот-профиля с известными стандартами.

Введение

Митохондрии являются важнейшими органеллами эукариотических клеток, которые играют решающую роль в биоэнергетике, клеточном метаболизме и сигнальных путях1. Для правильного выполнения этих задач митохондрии полагаются на уникальный набор белков и липидов, отвечающих за их структуру и функцию. Почковые дрожжи Saccharomyces cerevisiae широко используются в качестве модельной системы для исследований митохондриальных процессов, а также для других ^{органелл2}. Митохондриальный геном кодирует только восемь белков в дрожжах; подавляющее большинство митохондриальных белков (~99%) кодируются ядерными генами, которые транслируются на цитозольных рибосомах, а затем импортируются в их правильные притохондриальные компартменты сложными механизмами импорта ^{белка3,4,5}. Таким образом, митохондриальный биогенез зависит от скоординированной экспрессии как ядерного, так и митохондриального ^{геномов6,7}. Генетические мутации, вызывающие дефекты митохондриального биогенеза, связаны с заболеваниями человека8,9,10.

За последние два десятилетия высокопроизводительные протеомные исследования, нацеленные на высокоочищенные митохондрии, привели к всесторонней характеристике дрожжевого митохондриального протеома, который, по оценкам, состоит из не менее 900 белков11,12,13,14. Хотя эти исследования предоставили ценную информацию, суборганелларная локализация каждого белка в четырех митохондриальных подкомпартментах, а именно внешней мембране (OM), межмембранном пространстве (IMS), внутренней мембране (IM) и матрице, все еще требуется. Этот вопрос был частично решен с помощью протеомных исследований двух меньших митохондриальных подкомпартментов (OM и IMS)^15,16. Совсем недавно Vögtle и его коллеги сделали большой шаг вперед, создав высококачественную глобальную карту распределения субтохондриального белка в дрожжах. Используя комплексный подход, сочетающий количественную масс-спектрометрию на основе SILAC, различные протоколы фракционирования постохондрий и набор данных из протеомов OM и IMS, авторы выделили 818 белков в четыре митохондриальных подкомпартмента13.

Несмотря на успехи, достигнутые этими высокопроизводительными протеомными исследованиями, наши знания о составе протеома постохондрий далеко не полны. Действительно, среди 986 белков, о которых Vögtle и его коллеги сообщили как локализованные в дрожжевых митохондриях, 168 не могли быть отнесены ни к одному из четырех подсоландохондриальных компартментов13. Более того, авторы не предоставили информацию о мембранной топологии белков, которые, как прогнозировалось, будут периферически прикреплены к периферии митохондриальных мембран. Например, невозможно узнать, обращен ли белок, который был назначен периферически прикрепленным к внутренней мембране, к матрице или межмембранному пространству. Помимо этих недостающих данных из общепротеомных исследований, есть противоречивая информация о суборганелларной локализации значительного числа митохондриальных белков. Одним из примеров является протеаза Prd1, которая была назначена в качестве межмембранного космического белка в общих базах данных, таких как Saccharomyces Genome Database (SGD) и Uniprot. Удивительно, но используя протокол субфракционации, подобный описанному здесь, Фёгтле и его коллеги ясно показали, что Prd1 является подлинным матричным ^{белком13}. Как упоминалось выше, необходимо прояснить или переоценить субтохондриальную локализацию многих митохондриальных белков. Здесь мы предоставляем простой и надежный протокол для определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков. Этот протокол был разработан и оптимизирован различными исследовательскими группами и регулярно используется для определения локализации постохондрий, а также мембранной топологии многих митохондриальных белков.

протокол

1. Рост дрожжевых клеток

1. Изолируйте отдельные колонии интересующего штамма, переместив небольшую часть клеток из запаса глицерина -80 ° C на агаровую пластину YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы). Инкубировать пластину при 30 °C в течение 2-3 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм S. cerevisiae, используемый в настоящем протоколе, получен из BY4741 (MATα; его3Δ1; лей2Δ0; мет15Δ0; ura3Δ0). За исключением генов ауксотрофных маркеров, этот штамм не содержит ни одного удаленного гена и не несет никакой плазмиды. Таким образом, его можно успешно культивировать в богатой среде, стимулируя энергичный рост клеток. При работе со штаммами, трансформируемыми плазмидами, используют соответствующую минимальную среду для отбора плазмид.
2. Подготовьте закваску путем инокуляции 2-3 отдельных колоний из агаровой пластины YPD в 10-20 мл среды YPGal (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% галактозы) в колбе Эрленмейера объемом 100 мл. Инкубировать при 30 °C в течение 24 ч с энергичным встряхиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор питательной среды зависит от штамма дрожжей, используемого в протоколе. Как YPD, так и YPGal содержат ферментируемые источники углерода, которые позволяют расти штаммам, которые не выполняют митохондриальное дыхание. Однако, поскольку глюкоза подавляет экспрессию многих митохондриальных генов, не рекомендуется использовать этот источник углерода, поскольку он будет производить меньшее количество митохондрий. При работе с респираторными компетентными штаммами, которые могут дыхнуть, также можно использовать источники углерода, такие как глицерин и этанол, в попытке получить более высокий выход митохондрий.
3. Разбавьте закваску в 1 л свежей среды YPGal до _OD600 менее 0,1. Культивируют клетки при 30 °C с энергичным встряхиванием до тех пор, пока _OD600 не достигнет 1-1,5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определите скорость роста (время удвоения) для каждого штамма дрожжей перед выполнением эксперимента. Это позволит получить точную оценку времени инкубации, необходимого для того, чтобы культура достигла _OD600 1-1,5.

2. Выделение высокоочищенных митохондрий

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован ^с17, с незначительными изменениями.

1. Собирают клетки методом центрифугирования при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Промыть ячейки дистиллированной водой и собрать их центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Определите влажный вес клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Самый простой способ измерить вес гранулы ячейки на этапе 2.2 - это определить вес пустой трубки центрифуги непосредственно перед сбором ячеек. После центрифугирования отбросьте супернатант и измерьте массу той же трубки с клетками. Вес клеток — это разница между двумя измерениями.
4. Повторное суспендирование клеток в буфере DTT (2 мл на 1 г клеток) с помощью пипетки Пастера или наконечника P5000. В таблице 1 приведена информация о составе буфера ДДТ.
5. Инкубируйте клетки при 30 °C в течение 20 мин с легким встряхиванием (~70 об/мин).
6. Центрифуга при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для гранулирования ячеек.
7. Промыть клетки с помощью зимолиазного буфера без фермента (около 7 мл на 1 г клеток).
   См. таблицу 1 для буферной композиции зимолиазы.
8. Центрифуга при 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для гранулирования ячеек.
9. Повторное суспендирование клеток в буфере без зимолиазы (7 мл на 1 г клеток).
10. Переложите клеточную суспензию в колбу Эрленмейера объемом 250 мл и добавьте Зимолязу-20Т (3 мг на г живого веса).
11. Инкубировать клетки при 30 °C в течение 30-40 мин с легким встряхиванием (~70 об/мин). Проверьте эффективность этого процесса, сравнив мутность клеточной суспензии до и после лечения зимолиазой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки будут преобразованы в сферопласты из-за переваривания клеточной стенки зимолиазой.
    1. Для этого добавляют по 50 мкл каждой клеточной суспензии в отдельные стеклянные трубки, содержащие 2 мл воды. После энергичного перемешивания мутность клеточной суспензии, обработанной зимолязой, должна быстро уменьшаться из-за осмотического нарушения сферопластов. С другой стороны, мутность необработанной клеточной суспензии должна оставаться неизменной.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эффекты мутности также можно контролировать с помощью простого визуального осмотра или путем измерения _OD600 обоих образцов. Во втором случае _OD600 образца, обработанного зимолиазой, должен составлять 10-20% от необработанного образца. Альтернативный метод включает подсчет клеток в обоих образцах с помощью световой микроскопии.
    2. Если выход образования сферопластов низкий, добавляют больше зимолязы и инкубируют в течение еще 15 мин интервала.
12. Собирают сферопласты центрифугированием при 2500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все дальнейшие шаги следует проводить быстро и на льду или при 4 °C, чтобы избежать деградации белка гидролитическими ферментами.
13. Дважды промыть сферопласты ледяным буфером гомогенизации (около 6,5 мл на 1 г клеток) и гранулированием центрифугированием при 2 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. См. таблицу 1 для буферного состава гомогенизации.
14. Повторно суспендируют сферопласты в буфере гомогенизации ледяного холода (6,5 мл на 1 г клеток) и переносят его в предварительно охлажденный стеклянный гомогенизатор Dounce. Используйте большой гомогенизатор стекла примерно 30 мл.
15. Гомогенизируйте сферопласты 15 ударами с помощью пестика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ударов должно быть отрегулировано в зависимости от посадки пестика. Для тугого пестика достаточно 15 ударов. С другой стороны, при использовании рыхлого пестика рекомендуется выполнять до 25 ударов.
16. Переложите гомогенат в трубку центрифуги объемом 50 мл и добавьте 1 объем буфера гомогенизации ледяного холода.
17. Центрифугируйте гомогенат на низкой скорости, 1,500 x g в течение 5 мин при 4 °C к ядрам гранул, клеточному мусору и неразрывным клеткам.
18. Перенесите супернатант в новую центрифужную трубку объемом 50 мл с помощью пипетки Пастера или наконечника P5000, позаботившись о том, чтобы избежать разрушения гранулы.
19. Центрифуга при 4 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
20. Переложите супернатант в высокоскоростную центрифужную трубку и центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C в гранулу сырой фракции митохондрий.
21. Отбросьте надосадочный материал и аккуратно промыть сырую митохондриальную гранулу в буфере гомогенизации ледяного холода объемом 20-30 мл путем бережного пипетирования с использованием наконечника P5000.
22. Переложите суспензию в центрифужную трубку объемом 50 мл и центрифугу при 4000 х г в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать оставшийся клеточный мусор.
23. Переложите супернатант в высокоскоростную центрифужную трубку и центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C в гранулу сырой фракции митохондрий.
24. Выбросьте супернатант и осторожно повторно суспендируйте сырую митохондриальную гранулу в небольшом объеме (обычно 1000 мкл) ледяного буфера SEM путем мягкого пипетирования с использованием наконечника P1000. См. таблицу 1 для состава буфера SEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя эта сырая митохондриальная фракция может быть использована непосредственно в некоторых приложениях, таких как импортные анализы белка органелло , она содержит значительное количество других клеточных компонентов. Эти загрязнения могут привести к неправильной интерпретации результатов при определении субтохондриальной локализации белка. Поэтому для получения высокоочищенного митохондриального препарата требуются дальнейшие этапы очистки, как описано ниже.
25. Готовят растворы сахарозы в ЭМ-буфере в концентрациях 60%, 32%, 23% и 15% (мас./об.). Эти растворы стабильны до 1 месяца при 4 °C. См. таблицу 1 состава эм-буфера.
26. Подготовьте 4-ступенчатый градиент сахарозы в ультрацентрифужной трубке следующим образом: Поместите 1,5 мл 60% (мас./об.) сахарозы на дно трубки центрифуги. Далее пипетку осторожно ступенчато: 4 мл 32%, 1,5 мл 23% и 1,5 мл 15% сахарозы (мас./об.). Позаботьтесь о том, чтобы не нарушить фазы.
27. Осторожно загрузите сырую митохондриальную фракцию поверх градиента сахарозы.
28. Центрифуга в течение 1 ч при 134 000 х г при 4 °C в качающемся роторе ковша.
29. Осторожно продолжайте удалять раствор сахарозы до тех пор, пока не будет достигнута высокоочищенная фракция митохондрий, которая представлена коричневой полосой на границе раздела сахарозы 60%/32%.
30. Извлеките очищенные митохондрии с помощью режущего наконечника P1000 и поместите его в предварительно охлажденную высокоскоростную центрифужную трубку.
31. Разбавляют восстановленные митохондрии 5-10 объемами ледяного SEM-буфера.
32. Центрифуга в течение 30 мин при 12 000 х г при 4 °C.
33. Повторное суспендирование чистых митохондрий в 500 мкл ледяного буфера SEM путем бережной пипетки с использованием режущего наконечника P1000.
34. Определить концентрацию белка высокоочищенного митохондриального препарата с помощью процедуры Брэдфорда в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте концентрацию белка до 10 мг белка/мл с помощью ледяного SEM-буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для протокола фракционирования эссетохондрий, описанного ниже, рекомендуется использовать свежеприготовленные митохондрии. Тем не менее, Vögtle и его коллеги провели подробный анализ контроля качества митохондриальной интактности и показали, что замороженные органеллы также могут быть использованы в этом ^{протоколе13}. Для этого делают аликвоты по 40 мкл и замораживают их в жидком азоте. Хранить при температуре -80 °C.

3. Протокол индохондриального фракционирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из ^{ссылки18} и состоит из двух этапов: (1) гипотонический отек в присутствии или отсутствии протеиназы К и (2) обработка ультразвуком с последующей экстракцией карбоната. Выполняйте все этапы обоих протоколов на льду или при 4 °C, чтобы избежать деградации белка.

1. Гипотонический отек в присутствии протеиназы К
   1. Перенесите 40 мкл высокоочищенных митохондрий по 10 мг/мл (400 мкг) в четыре предварительно охлажденные меченые микроцентрифужные трубки по 1,5 мл.
   2. Добавьте 360 мкл SEM-буфера в пробирки 1 и 2.
   3. Добавьте 360 мкл ЭМ-буфера в пробирки 3 и 4.
   4. Добавьте 4 мкл протеиназы К (10 мг/мл) в пробирки 2 и 4. Используйте схему пипетирования, приведенную в таблице 2 , чтобы избежать ошибок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 10 мг/мл раствора протеиназы К в воде непосредственно перед использованием. Конечная концентрация протеиназы К в эксперименте должна составлять около 50-100 мкг/мл. Пожалуйста, смотрите раздел Обсуждение для получения более подробной информации.
   5. Аккуратно перемешайте все пробирки и высиживайте на льду в течение 30 минут с периодическим перемешиванием.
   6. Добавьте 4 мкл 200 мМ PMSF во все четыре пробирки, чтобы остановить активность протеиназы K.
      ВНИМАНИЕ: PMSF очень токсичен. Надевайте перчатки при работе с растворами, содержащими PMSF.
   7. Центрифуга при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
   8. Соберите супернатант и переложите его в новую 1,5 мл предварительно охлажденную меченую микроцентрифужную трубку. Позаботьтесь о том, чтобы не нарушить гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть непосредственно повторно использована в буфере образца для дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Однако следы протеиназы K могут оставаться активными даже после обработки PMSF и в конечном итоге могут переваривать некоторые белки после того, как гранула была растворена в SDS-содержащем буфере образца. Чтобы избежать этой проблемы, протеиназа К может быть полностью инактивирована путем обработки образцов трихлоруксусной кислотой (ТЦА), как описано ниже.
      ВНИМАНИЕ: ТЦА очень токсичен. Надевайте перчатки при работе с растворами, содержащими ТЦА.
   9. Повторное суспендирование гранулы со стадии 3.1.8 в 400 мкл ледяного SEM-буфера.
   10. Осаждение супернатанта (со стадии 3.1.8) и повторно суспендированной гранулы (со стадии 3.1.9) с TCA до конечной концентрации 10% (мас./об.).
   11. Высиживать все тюбики на льду в течение 10 мин.
   12. Центрифугируйте образцы, обработанные TCA, в течение 10 мин при 12 000 х г при 4 °C.
   13. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл буфера образца.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что индикатор рН бромфенола синего становится желтым из-за кислотной обработки. Если это произойдет, добавьте небольшие аликвоты (1-5 мкл) основания 1 M Tris до тех пор, пока оно не станет синим.
   14. Добавьте 4 мкл 200 мМ PMSF во все пробирки.
   15. Храните все образцы при -80 °C до дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттингом.
2. Обработка ультразвуком и карбонатная экстракция
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе нет необходимости использовать свежеприготовленные митохондрии после того, как обработка ультразвуком вызывает разрыв митохондриальных мембран.
   1. Перенесите 200 мкл высокоочищенных митохондрий при 10 мг/мл (2 мг белка) в предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
   2. Разбавьте митохондрии в один раз ледяным буфером SEM.
   3. Ультразвуковые митохондрии в течение 3 х 30 с на льду. Используйте ультразвуковой аппарат, совместимый с небольшими объемами.
   4. Центрифугируйте образец в течение 30 мин при 100 000 х г при 4 °C.
   5. Соберите супернатант и перенесите его в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите его на льду. Этот образец будет называться растворимой белковой фракцией (S).
   6. Повторное суспендирование гранулы со стадии 3.2.4 в 400 мкл ледяного SEM-буфера.
   7. Возьмите 100 мкл повторно суспендированной гранулы со стадии 3.2.6 и переложите ее в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите его на льду. Этот образец будет называться фракцией постохондриальных частиц (SMP).
   8. Оставшиеся 300 мкл со стадии 3.2.6 разбавить свежеприготовленным карбонатом натрия 200 мМ.
   9. Инкубируйте образец с этапа 3.2.8 на льду в течение 30 мин.
   10. Центрифугируйте образец в течение 30 мин при 100 000 х г при 4 °C.
   11. Соберите супернатант и перенесите его в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Держите его на льду. Этот образец будет называться карбонатной фракцией супернатанта (CS).
   12. Повторное суспендирование гранулы со стадии 3.2.10 в 400 мкл ледяного SEM-буфера. Этот образец будет называться карбонатной осажденной фракцией (CP).
   13. Осаждение всех образцов (S, SMP, CS и CP) с TCA до конечной концентрации 10% (мас./об.).
   14. Высиживать все тюбики на льду в течение 10 мин.
   15. Центрифугируйте образцы, обработанные TCA, в течение 10 мин при 12 000 х г при 4 °C.
   16. Удалите супернатант и повторно суспендируйте каждую гранулу в буфере образца. Если буфер образца становится желтым, добавьте небольшие аликвоты (1-5 мкл) основания 1 M Tris, пока оно не станет синим.
   17. Добавьте 1 мкл 200 мМ PMSF во все пробирки.
   18. Храните все образцы при -80 °C до дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттингом.

Результаты

Успех протокола субтохондриального фракционирования зависит от получения высокоочищенных интактных митохондрий. Для этого важно, чтобы во время лизиса дрожжевых клеток целостность органелл оставалась почти полностью сохраненной. Это достигается с помощью протокола лизиса клеток, к...

Обсуждение

Представленный здесь протокол успешно используется и непрерывно оптимизируется в течение длительного времени для определения локализации белка в притохондриальных компартментах13,14,18,21,22,23.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast extract	BD	212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)	Sigma-Aldrich	A7030	Component of Homogenization buffer
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815	Component of DDT buffer
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used to inactivate proteinase K
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Proteinase K	Sigma-Aldrich
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma-Aldrich	T6399
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus	MP Biomedicals, Irvine, CA	320921	Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast