JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تساهم المحادثات المتقاطعة بين الخلايا الظهارية الثديية والخلايا البطانية بشكل كبير في تطور سرطان الثدي ونمو الورم والانبثاث. في هذه الدراسة، تم صنع كرويدات من خلايا سرطان الثدي جنبا إلى جنب مع الخلايا البطانية الوعائية و / أو اللمفاوية وإثبات قابليتها للتطبيق كنظام في المختبر لأبحاث سرطان الثدي.

Abstract

سرطان الثدي هو السبب الرئيسي للوفيات بين النساء. نمو خلايا سرطان الثدي ونقائلها اللاحقة هو عامل رئيسي لتطورها. على الرغم من أن الآليات المشاركة في تعزيز نمو سرطان الثدي قد درست بشكل مكثف باستخدام الثقافات الأحادية لخلايا سرطان الثدي مثل خلايا MCF-7 ، إلا أنه لم يتم التحقيق بعمق في مساهمة أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية الوعائية واللمفاوية التي تشارك بشكل وثيق في نمو الورم. التفاعل بين الخلية والخلية يلعب دورا رئيسيا في نمو الورم وتطوره. تكوين النيوانجيوجينيسيس، أو تطور الأوعية، أمر ضروري لنمو الورم، في حين أن الجهاز اللمفاوي بمثابة بوابة لهجرة الخلايا السرطانية والانبثاث اللاحق. تقدم الدراسات الحديثة أدلة على أن الخلايا البطانية الوعائية واللمفاوية يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نمو الخلايا السرطانية. هذه الملاحظات تعني الحاجة إلى تطوير نماذج في المختبر من شأنها أن تعكس بشكل أكثر واقعية عمليات نمو سرطان الثدي في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، تتطلب القيود المفروضة على البحوث الحيوانية تطوير نماذج الجسم الحي السابق لتوضيح أفضل للآليات المعنية.

توضح هذه المقالة تطور كرويات سرطان الثدي المكونة من كل من خلايا سرطان الثدي (خلايا MCF-7 الإيجابية لمستقبلات هرمون الاستروجين) والخلايا البطانية الوعائية و / أو اللمفاوية. يصف البروتوكول نهجا مفصلا خطوة بخطوة في إنشاء كرويات ثنائية الخلية باستخدام نهجين مختلفين ، إسقاط معلق (معيار الذهب ورخيصة) ولوحات U-bottom 96 جيدا (مكلفة). يتم توفير تعليمات متعمقة لكيفية التقاط بدقة كرويات شكلت لرصد النمو عن طريق التحجيم المجهري وتقييم الجدوى باستخدام تلطيخ الخلايا الميتة والحية. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد إجراءات لإصلاح كرويدات للتقسم وتلطيخ مع الأجسام المضادة الخاصة بالنمو للتمييز بين أنماط النمو في كرويدات. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير تفاصيل لإعداد كرويدات مع الخلايا المصابة وأساليب لاستخراج الحمض النووي الريبي للتحليل الجزيئي. في الختام، توفر هذه المقالة تعليمات متعمقة لإعداد كرويات متعددة الخلايا لأبحاث سرطان الثدي.

Introduction

استخدام الحيوانات للتجارب له حدود. لا يمكن للدراسات الحيوانية أن تحاكي بدقة تطور المرض لدى البشر، وليس لدى الحيوانات والبشر استجابات متطابقة لمسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، القيود المفروضة على التجارب على الحيوانات بسبب المخاوف من معاناة الحيوانات والمشاكل الأخلاقية1,2 تقييد برامج البحث بشكل متزايد. In vitro وقد وضعت نظم على نطاق واسع للتحايل على استخدام الحيوانات؛ وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا البشرية جعلت in vitro نماذج أكثر ملاءمة للتحقيق المرضي والعلاجي. تستخدم ثقافات الخلايا أحادية الطبقة التقليدية (2D) على نطاق واسع لأنها تحاكي الأنسجة البشرية إلى حد ما. ومع ذلك ، تفشل الثقافات الأحادية 2D في محاكاة الأعضاء البشرية ، ولا تستطيع الثقافات الأحادية 2D محاكاة البيئة الدقيقة المعقدة للأعضاء الأصلية وتقليد in vivo موقف3,4,5,6. بالإضافة إلى ذلك ، في ثقافات الخلايا أحادية الطبقة ، يمكن أن تدمر العلاجات الدوائية / تلحق الضرر بكل الخلايا بسهولة. الأهم من ذلك ، يمكن التغلب على بعض هذه القيود عن طريق التحول إلى متعدد الطبقات ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافات الخلية7,8. في الواقع، أظهرت نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد أنها تعكس بشكل أفضل البنية الخلوية والتخطيط ووظيفة الخلايا في الأنسجة الأولية. يمكن تشكيل هذه الثقافات ثلاثية الأبعاد باستخدام مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا ، على غرار الجهاز الوظيفي. في الواقع ، هناك نموذجان من الثقافات ثلاثية الأبعاد. نموذج واحد ينتج كرويدات من الخلايا المجمعة التي تشكل مجموعات وإعادة تنظيمها في المجالات (نماذج خالية من السقالات). والثاني ينتج organoids ، التي لديها بنية أكثر تعقيدا وتتألف من مجموعات من خلايا متعددة خاصة بالأعضاء ، والتي تعتبر نسخة مصغرة من الأعضاء9,10. ونتيجة لهذا، تمثل أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد تقنية مبتكرة مع العديد من التطبيقات البيولوجية والسريرية. وهكذا ، فإن كرويدات و organoids لديها العديد من التطبيقات لنمذجة الأمراض والدراسات المتعلقة الطب التجديدي ، وفحص الأدوية ، والدراسات السمية6,11,12,13,14,15. كرويات مسرطنة، مستمدة من التكنولوجيا ثلاثية الأبعاد، إعادة مورفولوجيا والنمط الظاهري لأنواع الخلايا ذات الصلة، تحاكي in vivo البيئة الدقيقة الورم، ونموذج الاتصالات الخلية ومسارات الإشارات التي تعمل أثناء تطور الورم16,17,18. بالإضافة إلى ذلك ، لتحسين فهم بيولوجيا السرطان ، يمكن أيضا استخدام كرويدات / عضويات الورم لتحديد علاج محتمل مضاد للسرطان خاص بالمرضى (شخصي) وتقييم فعاليته وسمية وآثاره على المدى الطويل19,20,21,22. وقد فتحت Spheroids فرصا بارزة للتحقيق في علم وظائف الأعضاء المرضية ، والنمذجة المرض وفحص المخدرات بسبب قدرتها على الحفاظ على بنية الأنسجة الخلوية وثلاثية الأبعاد ، والقدرة على تقليد in vivo الوضع ، والتفاعلات الخلية الخلية. ومع ذلك ، يجب على المرء أيضا أن يكون على بينة من القيود المفروضة على هذا النظام ، مثل عدم وجود مكون الأوعية الدموية / الجهاز الجهازي ، والجهاز المناعي الوظيفي أو العصبي ، ويمثل النظام نهجا اختزاليا بالمقارنة مع النماذج الحيوانية. في الواقع ، على النقيض من النماذج الحيوانية ، لا توفر الهياكل ثلاثية الأبعاد سوى تقريب البيولوجيا داخل جسم الإنسان. قد يساعد فهم قيود الطريقة ثلاثية الأبعاد الباحثين على تصميم عمليات أكثر دقة وصالحة لإنتاج كرويدات تمثل جهازا بشكل أفضل على نطاق أوسع23,24,25.

السرطان هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم، وسرطان الثدي هو السرطان الأكثر شيوعا لدى النساء26،27،28. لمحاكاة البيئة الدقيقة المعقدة لسرطان الثدي، يجب استزراع كرويات سرطان الثدي باستخدام الخلايا التي تلعب دورا بارزا في أورام الثدي، أي الخلايا الظهارية والخلايا البطانية والخلايا الليفية و/أو الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للكفرويد الذي يمثل سرطان الثدي، ينبغي أيضا النظر في التعبير عن مستقبلات الهرمونات الأنثوية (مستقبلات هرمون الاستروجين/البروجسترون)، والقدرة على الحفاظ على الحالة النسيجية للورم المريض، والقدرة على محاكاة الاستجابة للعلاج. وقد أظهرت الدراسات أن أنظمة 3D المشاركة في الثقافة لديها تنظيم الخلوية مماثلة لتلك التي من الأنسجة الأولية في الجسم الحي,لديها القدرة على التفاعل في الوقت الحقيقي للمحفزات, ولها مستقبلات الاندروجين وظيفية29,30,31,32. وبالتالي ، يمكن أن يكون نهجا مماثلا مفيدا لمحاكاة ورم الثدي في المختبر. الغرض من البروتوكول الحالي هو إنشاء طريقة جديدة لتوليد كرويدات سرطان الثدي. تستخدم هذه الطريقة خلايا MCF-7 الإيجابية لمستقبلات الإستروجين (خط خلايا بشرية خالدة من الخلايا الظهارية) والخلايا البطانية الوعائية (HUVECs) أو الخلايا البطانية اللمفاوية (HMVEC-DNeo) لإنشاء نموذج يحاكي أو يعكس عن كثب التفاعلات بين هذه الخلايا داخل الورم. على الرغم من أن MCF-7 (الإستروجين استجابة) والخلايا البطانية قد استخدمت لتطوير كرويدات في هذه الدراسة, خلايا أخرى مثل الخلايا الليفية التي تمثل ~ 80٪ من كتلة ورم الثدي, ويمكن أيضا أن تكون مجتمعة في المستقبل لتمثيل أفضل وتقليد ورم الثدي.

هناك عدة طرق لتشكيل كرويدات، مثل: 1) طريقة القطيرات المعلقة التي تستخدم الجاذبية33،34؛ 2) طريقة الارتفاع المغناطيسي الذي يستخدم الجسيمات النانوية المغناطيسية يتعرض لمغناطيس خارجي35، و 3) طريقة لوحة كروية الدقيقة التي يتم تنفيذها من قبل خلايا البذر على لوحات منخفضة المرفق36،37. على أساس الأساليب الموجودة، والتي تستخدم نوع خلية واحدة فقط، وقد تم الأمثل البروتوكول الحالي باستخدام الخلايا الظهارية والظهارية لمحاكاة أفضل لظروف نمو أورام سرطان الثدي في الجسم الحي38،39،40،41. ويمكن تحقيق هذه الطريقة بسهولة في المختبر بتكلفة منخفضة وبأقل قدر من الاحتياجات من المعدات. وبناء على حاجة/أهداف المختبر، استخدمت نهج مختلفة لتشكيل كرويدات والحصول على المواد الخلوية ذات الصلة من هذه الكرويات. في هذا السياق ، بالنسبة لتحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين ، يتم إنتاج كرويدات ثلاثية الأبعاد عن طريق الخلايا البطانية والظهارية المشتركة مع طريقة الإسقاط المعلق. ومع ذلك ، للدراسات الوظيفية ، على سبيل المثال ، لمراقبة نمو الخلايا بعد التدخل القصير (siRNA) العدوى و / أو العلاج الهرموني ، يتم إنشاء كرويدات باستخدام لوحات U-bottom.

الغرض من هذا البروتوكول التقني هو تقديم وصف مفصل خطوة بخطوة ل1) تشكيل سرطان الثدي كرويدات متعددة الخلايا، 2) إعداد عينات لتلطيخ الخلايا النسيجية، و 3) جمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، والبروتينات. يتم استخدام كل من طريقة إسقاط شنقا غير مكلفة ولوحات U-أسفل أكثر تكلفة لتشكيل كرويدات. هنا، يتم توفير بروتوكول لإعداد (تحديد) كرويات للقسم والتلوي المناعي اللاحق مع علامات لتقييم انتشار الخلايا، وموت الخلايا المبرمج، وتوزيع الخلايا الظهارية والظهارية داخل كروية. بالإضافة إلى ذلك، يعرض هذا البروتوكول تحليلا كاملا خطوة بخطوة للبيانات النسيجية باستخدام برنامج ImageJ. يختلف تفسير البيانات البيولوجية حسب نوع التجربة والأجسام المضادة المستخدمة. تم إجراء تقسيم كرويات ثابتة وتلطيخ لاحق للأقسام من قبل مختبر علم الأمراض الروتيني (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. ثقافة الخلية

ملاحظة: إجراء التعامل مع الخلايا في ظل ظروف معقمة.

  1. زراعة الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVECs)
    1. معطف 75 سم2 قوارير مع الكولاجين (5 ميكروغرام / سم2)(ذيل الفئران) بين عشية وضحاها (ON) في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 2-3 ساعة في 37 درجة مئوية، وشطف بالماء، والسماح للقارورة لتجف.
    2. تنمو HUVECs في المتوسط النمو (EBM-2, بطانة البازل المتوسطة-2) تستكمل مع الجلوتامين (1x = 2 mM), المضادات الحيوية المضادة للميكويك (AA; 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين, 100 ميكروغرام/مل من البنسلين و0.025 ميكروغرام/مل من الأمفوتريسين B)، LSGS (2٪ v/v FCS، 1 ميكروغرام/مل من الهيدروكورتيزون، 10 نانوغرام/مل من عامل نمو البشرة البشري، 3 نانوغرام/مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية البشرية، 10 ميكروغرام/مل من الهيبارين) و10٪ FCS (مصل العجل الجنيني) في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). تغيير المتوسطة كل يومين حتى تصل الخلايا التقاء 70٪-80٪.
    3. غسل الثقافات الفرعية التقاء مع 5 مل من HBSS (دون Ca2 + و Mg2 +) وإضافة 3 مل من التريبسين (0.25٪ مخففة في HBSS (بدون Ca2 + و Mg2 +)).
      ملاحظة: HBSS يمكن أيضا استبدال برنامج تلفزيوني.
    4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (فحص مجهري ما إذا كانت الخلايا منفصلة وتقريبها) ووقف رد فعل فصل بإضافة 6 مل من 10٪ FCS المتوسطة (DMEM-F12 أو EBM-2، 10٪ FCS).
    5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 250 × ز لمدة 5 دقائق في RT والتخلص من supernatant.
    6. تعليق الخلايا في متوسط النمو والبذور في 75 سم2 قوارير أو أطباق الثقافة.
  2. ميشيغان مؤسسة السرطان-7 (MCF-7, خلايا الورم الغدي الثدي البشري) ثقافة فرعية
    1. تنمو خطوط خلايا سرطان الثدي البشري في 75 سم2 قوارير في المتوسط النمو (DMEM/F12 المتوسطة تكملها الجلوتامين التجارية (1x), مضاد للمضادات الحيوية المضادة للميكويك (AA; 100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين، و100 ميكروغرام/مل من البنسلين و0.025 ميكروغرام/مل من الأمفوتريسين B)، و10 في المائة FCS في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية (37 درجة مئوية، 5 في المائة CO2). تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
    2. غسل ثقافات الخلايا تحت السائل (70٪ -80٪ التقاء) مع 5 مل من HBSS (بدون Ca2 + و Mg2+) وإضافة 3 مل من التريبسين (0.5٪ مخففة في HBSS (بدون Ca2 + و Mg2 +) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (تحقق مجهريا من أن الخلايا منفصلة).
      ملاحظة: HBSS يمكن أيضا استبدال برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 8 مل من 10٪ FCS المتوسطة لوقف رد فعل فصل، والطرد المركزي في 250 × ز لمدة 5 دقائق في RT والتخلص من supernatant.
    4. تعليق بيليه في المتوسط النمو ولوحة في 75 سم2 قوارير أو أطباق الثقافة.

2. تشكيل كروي

  1. لوحة 5 × 105 خلايا / مل (HUVECs وMCF-7) في طبق مستدير 3.5 سم والثقافة لمدة 48 ساعة.
  2. علاج أو إعادة إصابة الخلايا المطلية لمدة 24 ساعة أو حسب الرغبة.
  3. خطوة اختيارية أجريت في 96 جيدا U-أسفل لوحة: غسل الخلايا مع 1 مل من HBSS (Ca2 + و Mg2+) وصمة عار HUVECs باستخدام صبغة زرقاء (0.5 ميكروغرام / مL) وخلايا MCF-7 باستخدام صبغة خضراء (0.5 ميكرومتر) مخففة في متوسط النمو المعنية ومكان في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30-40 دقيقة.
  4. غسل الخلايا مع 1 مل من HBSS (دون Ca2 + و Mg2 +)، إضافة 1 مل من كاشف مفرزة الأنزيمية (0.25٪ تريبسين لHUVEC و 0.5٪ تريبسين لMCF-7) إلى كل طبق جولة باستخدام ماصة P1000، ومن ثم احتضان لمدة 2-5 دقائق حتى يتم فصل الخلايا.
  5. جمع كل نوع الخلية بشكل منفصل في 5 مل جولة أسفل أنبوب البوليسترين وإضافة 1 مل من 10٪ FCS المتوسطة باستخدام ماصة P1000 لوقف رد الفعل الأنزيمي. الطرد المركزي تعليق الخلية في 250 × ز لمدة 5 دقائق.
  6. يستنشق بعناية supernatant وتعليق الخلايا في 1 مل من المتوسطة خالية من الستيرويد (EBM-2, الجلوتامين , مضاد حيوي مضاد للميكون, 0.4٪ FCS SF (الفحم جردت)).
    ملاحظة: يمكن استبدال المتوسطة الخالية من الستيرويد مع متوسط النمو العادي.
  7. استخدام 100 ميكرولتر من كل تعليق الخلية المخفف مع 10 مل من Diluent II (انظر جدول المواد)لتحديد إجمالي عدد الخلايا وحساب كمية المعالجة المتوسطة (EBM-2، الجلوتامين، مضاد المضادات الحيوية، 0.4٪ FCS SF، السيارة / العلاج) اللازمة للحصول على تعليق الخلية من 5 × 103 خلايا / مل أو 3.4 × 105 خلايا / مل لكل نوع الخلية.
    1. عدد الخلايا
      1. قم بتشغيل الجهاز وامسحه بالضغط على زري Function and Start (إعداد S3)، مع حل Diluent II في قارورة عداد الخلية.
      2. استخدم إعداد S4 واضغط على البدء لقياس الفراغ باستخدام حل Diluent II الطازج.
      3. تغيير قارورة التلألؤ مع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في 10 مل من محلول Diluent II وقياس العينات: إعداد S4 واضغط ابدأ.
      4. لاحظ عدد الخلايا لكل مل على الشاشة الرقمية.
        ملاحظة: يمكن أيضا إجراء عد الخلايا باستخدام أنظمة يدوية أو تلقائية أخرى: خطوط الشبكة لقياس الخلايا، وتكنولوجيا عد الخلايا المبعثرة للضوء، والمعاوقة الكهربائية، والنظم القائمة على التصوير باستخدام تلطيخ الخلايا، على سبيل المثال، ثلاثية اللون الأزرق.
    2. 96-جيدا لوحات U-أسفل
      1. إعداد 5 مل من كل تعليق الخلية (5 × 103 خلايا / مل) ومزجها للحصول على حجم النهائي من 10 مل في نسبة 1:1.
      2. استخدام ماصة تكرار دليل إلى ماصة من أصل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحات يو القاع 96 جيدا.
      3. ضع اللوحة في حاضنة تحت ظروف زراعة الأنسجة القياسية وتحقق من تكوين كرويدات بعد 48 ساعة.
      4. الخطوة الاختيارية: التقاط صور للشفرات (40x) باستخدام مجهر ستيريو مضان.
        ملاحظة: هذه الطريقة يولد 96 كروية (كروية واحدة / جيدا) بعد 48 ساعة (منطقة 1-2 بكسل2)،وعادة ما تستخدم لدراسات النمو.
    3. إسقاط معلق
      1. امزج تعليق الخلية (3.4 × 105 خلايا/مل) بنسبة 1:1 للحصول على حجم نهائي قدره 2 مل.
      2. استخدام ماصة P20 لزرع خليط الخلية في شكل قطرات 15 ميكرولتر على غطاء مقلوب من طبق بيتري 10 سم.
      3. عكس الغطاء مع قطرات وإضافة 5 مل من المتوسطة الأساسية (EBM-2) في الجزء السفلي من الطبق لتجنب تبخر قطرات.
        ملاحظة: هذا الأسلوب بإنشاء واحد كروي/إسقاط بعد 48 ساعة. تأكد من أن القطرات منفصلة بما فيه الكفاية عن بعضها البعض ، بحيث لا تندمج أثناء تبديل الغطاء. استخدام أكثر من 10 سم طبق بيتري إذا لزم الأمر.

3. دراسة النمو الكروي

  1. لوحة 100 ميكرولتر من HUVECs ومزيج الخلية MCF-7 (5 × 102 خلايا / جيدا) في لوحات U-bottom 96 جيدا ووضعها في الحاضنة.
  2. 48 ساعة بعد الطلاء، تحقق من تشكيل كرويدات مع المجهر المقلوب (حقل مشرق). التقاط الصور (ما لا يقل عن ست صور لكل علاج، 40x) في 96 ساعة من الثقافة.
  3. افتح الصور باستخدام برنامج معالجة الصور وعالج الصورة إلى 300 بكسل/بوصة واحفظ الصورة كملف tiff.
  4. تحميل برنامج ImageJ وفتحه. انقر على الخيار ملف واذهب إلى فتح.
  5. تحويل المناطق ذات الأهمية إلى المناطق السوداء المشبعة بطريقة موحدة أن يكون صورة ثنائية (أبيض وأسود). لهذا، حدد الخيار صورة، اختر نوع | 8 بت. الآن، الصورة بالأبيض والأسود.
  6. استخدم أداة التحديد اليدوي لرسم حدود كرويدات.
  7. لحساب مساحة الاهتمام وفصل الكائن أو وحدات البكسل الأمامية عن وحدات بكسل الخلفية، استخدم وظيفة العتبة: حدد خيار الصورة، واختر ضبط وانقر على العتبة.
  8. الآن سيتم فتح عتبة النافذة المنبثقة. يشير الشريط العلوي إلى الحد الأدنى لقيمة العتبة: تعيين القيمة عند الصفر. يشير الشريط السفلي إلى الحد الأقصى لقيمة العتبة: حرك الشريط حتى تصبح منطقة الاهتمام حمراء تماما.
    ملاحظة: إذا كان اللون غير أحمر، حدد أحمر من إطار العتبة.
  9. انتقل إلى تحليل | تعيين القياسات وتحديد المنطقة والمحيط.
  10. لقياس مجال الاهتمام، حدد الخيار تحليل واستخدم أداة تحليل الجسيمات. في إطار تحليل الجسيمات، قم بتعيين الحجم لقياس (0.00003-Infinity أو 3-Infinity، اعتمادا على حجم كرويدات)، حدد تلخيص وعرض النتائج. ثم انقر فوق موافق.
  11. ستظهر النتائج في مخطط. نسخ القياسات في جدول بيانات لتحليل البيانات.
    ملاحظة: يتم حساب المنطقة كعدد إجمالي وحدات البكسل; استخدم المساحة الإجمالية للحساب.

4. دراسة الكيمياء المناعية الكروية

  1. إعداد العينة
    1. لوحة خليط الخلية من HUVECs وMCF-7 (5 × 103 خلايا / جيدا) في لوحات U-bottom 96 جيدا في متوسط نمو HUVEC لمدة 96 ساعة.
    2. جمع ما يقرب من 50 كروية في أنبوب 1.5 مل مع طرف قطع من ماصة P200 ميكرولتر; السماح لهم بالاستقرار في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية ، ومن ثم التخلص من supernatant.
    3. إصلاح كرويدات مع 500 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 1 ساعة، RT.
    4. يغلي 2٪ نوبل أغار الحل في برنامج تلفزيوني باستخدام لوحة ساخنة مع stirrer المغناطيسي لمدة 3-5 دقائق لإذابة مسحوق الآغروز تماما وتبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية.
    5. إزالة PFA مع ماصة P1000، وغسل كرويدات مع 500 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني، والسماح لهم الرواسب. تجاهل الناتنات الفائق.
    6. ماصة بعناية 600 ميكرولتر من محلول الآغروز في أنبوب 1.5 مل مع كرويدات ووضع الأنبوب على الفور في جهاز طرد مركزي مع الدوار الأفقي في 177 × ز لمدة 2 دقيقة.
    7. إضافة سلسلة قصيرة في منتصف الحل agarose لإزالة بسهولة المكونات من الأنبوب.
    8. ترسيخ سد العجز agarose على الجليد أو في 4 °C. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 مل لتجنب الجفاف من بيليه.
      ملاحظة: العينات جاهزة للجفاف اللاحق، وتضمين البارافين، والقسم، ونقلها إلى شرائح المجهر، وتلطيخ IHC (التي يؤديها سوفيستولاب).
  2. الحصول على الصور ومعالجتها
    1. الحصول على صور من المقاطع كروية باستخدام مجسم.
    2. احفظ ثلاث صور لكل عينة كملفات .jpg.
    3. افتح برنامج ImageJ. افتح صورة JPEG، وانقر على ملف ثم افتح.
    4. حدد لون وألوان Deconvolution في الخيار صورة.
    5. حدد ناقلات H DAB في إطار 1.7 Deconvolution اللون، وتظهر الصور الثلاث.
      ملاحظة: الصور الثلاث هي: اللون 1 يمثل فقط تلطيخ Hematoxylin (أزرق / أرجواني)، واللون 2 يمثل فقط تلطيخ DAB (البني). لا يلزم اللون 3 لتحليل الصورة مع اثنين من تلطيخ.
    6. حدد إطار اللون 1 ثم قم بتعيين العتبة: انتقل إلى صورة | ضبط وانقر على عتبة. يظهر إطار العتبة.
    7. اترك الحد الأدنى لقيمة العتبة معينا عند الصفر واضبط القيمة القصوى العتبة لإزالة إشارة الخلفية دون التأثير على الإشارة الحقيقية. انقر على تطبيق.
      1. قياس المنطقة
        1. انقر على تحليل، اختر تعيين القياس. حدد المنطقة ومتوسط القيمة الرماديةو Min و Max قيمة رمادية وانقر فوق موافق للتأكيد.
        2. قم بقياس حجم النواة باستخدام الخيار تحليل، ثم حدد قياس.
          ملاحظة: تعطي نافذة النتائج اسم الصورة (التسمية) وحجم الصورة (المنطقة) ومتوسط كثافة البكسل لصورة IHC (متوسط) والقيم الرمادية الدنيا والقص قصوى (الحد الأدنى والحد الأقصى). استخدم القيمة المتوسطة للحساب.
        3. كرر الخطوات 4.2.6-4.7.1.2 للون 2 (واللون 3 إذا كان هناك تلطيخ مزدوج) النافذة.
      2. تحديد كمية الخلية
        1. انقر على عملية، واختيار الخيار ثنائي وحدد مستجمعات المياه لفصل الخلايا.
        2. انتقل إلى تحليل وانقر على تحليل الجسيمات. في النافذة المنبثقة تحليل الجسيمات، قم بتعيين حجم الخلايا لاستبعاد الجسيمات غير المحددة. بعد ذلك، في الخيار إظهار، انقر على المربع المنسدل وحدد الخطوط العريضة. ثم انقر فوق موافق.
        3. كرر الخطوات 4.2.6-4.2.7 وخطوات تحديد كمية الخلية (القسم 4.2.7.2) للون 2 (واللون 3 إذا كان هناك تلطيخ مزدوج) النافذة.
          ملاحظة: الآن ستظهر ثلاث نوافذ: 1) نتائج الملخص (عدد الخلايا التي تم عدها، المساحة الإجمالية، متوسط الحجم، النسبة المئوية للمنطقة والمتوسط)، 2) النتائج (لكل منها للخلايا التي يتم عدها)، و 3) نافذة الرسم (صورة مصورة للخلايا التي يتم عدها).

5. يعيش / الميت تلطيخ في كرويدات

  1. إعداد 4 MM حلول الأسهم من Calcein AM في DMSO (البقع الخلايا الحية الخضراء) و 2 mM من Ethidium homodimer في DMSO (البقع الخلايا الميتة الحمراء) في أنابيب 1.5 مل.
  2. حساب كمية الحل اللازمة لإضافة 10 ميكرولتر / بئر من خليط من كالسين AM وEthidium homodimer المخفف 1:50 في EBM-2.
  3. إضافة خليط تلطيخ إلى كرويدات ووضع لوحة في الحاضنة في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية لمدة 30-60 دقيقة.
  4. الحصول على الصور (40x) باستخدام المجهر ستيريو مضان.

6. بروتين كرويد وعزلة الحمض النووي الريبي

  1. إعداد تعليق الخلية في 3.4 × 105 خلايا / مل لكل نوع الخلية، ومزجها بنسبة 1:1، والبذور خليط الخلية باستخدام ماصة P20 في شكل قطرات 15 ميكرولتر على غطاء طبق بيتري 10 سم. عكس الغطاء ووضعه في الحاضنة في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية لمدة 96 ساعة.
  2. استخدام 5-6 مل من برنامج تلفزيوني لجمع كرويدات في أنبوب البوليسترين 15 مل ذهابا وإيابا باستخدام 5 مل المصاطب البوليسترين المعقمة.
    ملاحظة: من الممكن أيضا استخدام أنابيب مخروطية سعة 15 مل.
  3. الطرد المركزي تعليق كرويدات في 250 × ز لمدة 5 دقائق، ومن ثم يستنشق بعناية supernatant.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من التريبسين (100٪) وماصة صعودا وهبوطا باستخدام ماصة P1000 لمدة 30 ثانية لتصنيف كرويدات، وتحقيق تعليق الخلية.
  5. تحييد التريبسين مع 10٪ FCS المتوسطة، والطرد المركزي الأنابيب في 250 × ز لمدة 5 دقائق، ونسيخ supernatant.
  6. وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (مجموعة محددة لعزل الحمض النووي الريبي الخالية)، استخدم 300 ميكرولتر من العازلة تحلل الحمض النووي الريبي لتحلل بيليه الخلية.
    ملاحظة: يمكن أيضا إضافة المخزن المؤقت Lysis مباشرة إلى كرويدات سليمة (لا خطوة جربسين المطلوبة) لاستخراج الحمض النووي الريبي. إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى كرويدات بيليه، ووضع أنابيب في الجليد، وتريتورات 10 مرات باستخدام ماصة P200. في وقت لاحق، عزل الجيش الملكي النيبالي على النحو الوارد أعلاه. قد تكون هناك حاجة إلى فصفير كروي إذا كان استرداد الحمض النووي الريبي منخفضا بسبب تداخل المصفوفة.
  7. بدلا من ذلك، استخدم 70 ميكرولتر من حاجز التحلل لعزل البروتين. تجانس لمدة 2-4 ق عن طريق سونيكيشن وتحديد تركيز البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام مجموعة BCA Assay Kit.
    ملاحظة: لعزل البروتين، يمكن أن يتم تحلل كرويات الكريات مباشرة في عازلة التحلل تليها سونيكيشن. استخدام 25 ميكروغرام من البروتين الكلي لأداء لطخة الغربية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نموذج كرويدات باستخدام الثقافات الظهارية والظهارية المشتركة مطلوب لمحاكاة عن كثب في ظروف الجسم الحي من أورام الثدي للتجارب في المختبر. يصور المخطط في الشكل 1 البروتوكول لتشكيل كرويات مع خلايا ظهارية سرطان الثدي والخلايا البطانية الوعائية أو اللمفاوية (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

بالمقارنة مع ثقافات الخلايا 2D ، فإن تقنية ثقافة كروية ثلاثية الأبعاد الثورية هي أداة أفضل وأكثر قوة لإعادة بناء البيئة الدقيقة للجهاز ، وتفاعلات خلايا الخلية ، واستجابات الدواء في المختبر. هذا هو البروتوكول الأول الذي يصف تشكيل كرويات من خطوط الخلايا المتعددة الخلايا (الظهارية والظ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة أبحاث السرطان / منحة الرابطة السويسرية للسرطان KFS-4125-02-2017 إلى RKD ومنحة المعهد الوطني للصحة DK079307 إلى EKJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishesCorningCLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture DishFalcon353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, SterileFalcon357543
Adobe PhotoshopVersion: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955
Calcein-AMSigma-Aldrich17783
CD31 (cluster of differentiation 31)Cell Marque131M-95monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)InvitrogenC7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)DBSMob189-05monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted MicroscopeOlympus Life ScienceOlympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3Cell Signaling9661Lpolyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)Roche11 179 179 001
Coulter ISOTON II DiluentBeckman Coulter844 80 11Diluent II
Coulter Z1, Cell CounterCoulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble AgarBD DifcoBD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo)LonzaCC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-AldrichD6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2Lonza190860
Ethidium homodimerSigma-Aldrich46043
Fetal Calf Serum (FCS)Thermo Fisher ScientificSH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)Thermo Fisher ScientificSH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FALeica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redGibco14175053
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial CellsLonzaCC-2517
ImageJNational Institute of Health, USAWayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67Cell Marque275R-16monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscopeLeica MicrosystemsM205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)GibcoS003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell lineClinic for Gynecology, University Hospital ZurichProvived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plateThermo Fisher Scientific174925
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1xGibco10010015
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Protein Lysis BufferCell Signaling, Danvers, USA9803
Quick-RNA Miniprep KitZymo ResearchR1055
RNA Lysis BufferZymo ResearchR1060-1-100Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R CentrifugeHettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLFalcon352003
SonicatorBandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate readerTecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75TPP90076
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT3924

References

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285(2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97(2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460(2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116(2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720(2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955(2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved