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  • Résumé
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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La diaphonie entre les cellules épithéliales mammaires et les cellules endothéliales contribue de manière importante à la progression du cancer du sein, à la croissance tumorale et aux métastases. Dans cette étude, les sphéroïdes ont été fabriqués à partir de cellules cancéreuses du sein avec des cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques et démontrent leur applicabilité en tant que système in vitro pour la recherche sur le cancer du sein.

Résumé

Le cancer du sein est la principale cause de mortalité chez les femmes. La croissance des cellules cancéreuses du sein et leurs métastases subséquentes sont un facteur clé de sa progression. Bien que les mécanismes impliqués dans la promotion de la croissance du cancer du sein aient été étudiés de manière intensive à l’aide de monocultures de cellules cancéreuses du sein telles que les cellules MCF-7, la contribution d’autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques qui sont intimement impliquées dans la croissance tumorale, n’a pas été étudiée en profondeur. L’interaction cellule-cellule joue un rôle clé dans la croissance et la progression tumorales. La néoangiogenèse, ou le développement des vaisseaux, est essentielle à la croissance tumorale, tandis que le système lymphatique sert de portail pour la migration des cellules cancéreuses et les métastases ultérieures. Des études récentes fournissent des preuves que les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques peuvent influencer de manière significative la croissance des cellules cancéreuses. Ces observations impliquent la nécessité de développer des modèles in vitro qui refléteraient de manière plus réaliste les processus de croissance du cancer du sein in vivo. De plus, les restrictions dans la recherche animale nécessitent le développement de modèles ex vivo pour mieux élucider les mécanismes impliqués.

Cet article décrit le développement de sphéroïdes du cancer du sein composés à la fois de cellules cancéreuses du sein (cellules MCF-7 positives aux récepteurs d’œstrogènes) et de cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques. Le protocole décrit une approche détaillée étape par étape dans la création de sphéroïdes à deux cellules en utilisant deux approches différentes, la goutte suspendue (étalon-or et bon marché) et les plaques à fond en U à 96 puits (coûteuses). Des instructions détaillées sont fournies sur la façon de ramasser délicatement les sphéroïdes formés pour surveiller la croissance par dimensionnement microscopique et évaluer la viabilité à l’aide de la coloration des cellules mortes et vivantes. De plus, les procédures pour fixer les sphéroïdes pour la section et la coloration avec des anticorps spécifiques à la croissance afin de différencier les modèles de croissance chez les sphéroïdes sont délimitées. En outre, des détails pour la préparation des sphéroïdes avec des cellules transfectées et des méthodes d’extraction de l’ARN pour l’analyse moléculaire sont fournis. En conclusion, cet article fournit des instructions détaillées pour la préparation des sphéroïdes multicellulaires pour la recherche sur le cancer du sein.

Introduction

L’utilisation d’animaux pour des expériences a des limites. Les études animales ne peuvent pas imiter avec précision la progression de la maladie chez les humains, et les animaux et les humains n’ont pas de réponses identiques aux agents pathogènes. En outre, des restrictions dans l’expérimentation animale en raison de préoccupations concernant la souffrance animale et des problèmes éthiques1,2 limiter de plus en plus les programmes de recherche. In vitro des systèmes ont été largement mis au point pour contourner l’utilisation des animaux; de plus, l’utilisation de cellules humaines a fait in vitro modèles plus pertinents pour l’investigation physiopathologique et thérapeutique. Les cultures cellulaires monocouches conventionnelles (2D) sont largement utilisées car elles imitent les tissus humains dans une certaine mesure. Cependant, les monocultures 2D ne parviennent pas à imiter les organes humains, et les monocultures 2D sont incapables de simuler le microenvironnement complexe des organes d’origine et d’imiter le in vivo situation3,4,5,6. De plus, dans les cultures cellulaires monocouches, les traitements médicamenteux pourraient facilement détruire / endommager toutes les cellules. Il est important de noter que certaines de ces limitations peuvent être surmontées en passant à des cultures cellulaires tridimensionnelles (3D) multicouches7,8. En fait, il a été démontré que les modèles de culture 3D reflètent mieux la structure cellulaire, la disposition et la fonction des cellules dans les tissus primaires. Ces cultures 3D peuvent être formées en utilisant une variété de lignées cellulaires, semblables à un organe fonctionnel. En effet, il existe deux modèles de cultures 3D. Un modèle produit des sphéroïdes de cellules agrégées qui forment des amas et les réorganisent en sphères (modèles sans échafaudage). Le second donne des organoïdes, qui ont une structure plus complexe et consistent en des combinaisons de plusieurs cellules spécifiques à un organe, qui sont considérées comme une version miniature des organes.9,10. Pour cette raison, les systèmes de culture 3D représentent une technologie innovante avec de nombreuses applications biologiques et cliniques. Ainsi, les sphéroïdes et les organoïdes ont de nombreuses applications pour la modélisation des maladies et les études liées à la médecine régénérative, au dépistage des médicaments et aux études toxicologiques.6,11,12,13,14,15. Les sphéroïdes cancérigènes, dérivés de la technologie 3D, recréent la morphologie et le phénotype des types de cellules pertinents, imitent le in vivo microenvironnement tumoral et modèles de communications cellulaires et de voies de signalisation qui sont opérationnelles pendant le développement de la tumeur16,17,18. En outre, pour améliorer la compréhension de la biologie du cancer, les sphéroïdes / organoïdes tumoraux peuvent également être utilisés pour identifier un traitement anticancéreux potentiel spécifique au patient (personnalisé) et évaluer son efficacité, sa toxicité et ses effets à long terme.19,20,21,22. Les sphéroïdes ont ouvert d’importantes possibilités d’étudier la physiopathologie, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en raison de leur capacité à préserver l’architecture cellulaire et tridimensionnelle des tissus, la capacité d’imiter le in vivo et les interactions cellule-cellule. Cependant, il faut également être conscient des limites de ce système, telles que l’absence de composant vasculaire / systémique, système immunitaire ou nerveux fonctionnel, et le système représente une approche réductionniste par rapport aux modèles animaux. En effet, contrairement aux modèles animaux, les structures 3D ne fournissent qu’une approximation de la biologie au sein d’un corps humain. Comprendre les limites de la méthode 3D peut aider les chercheurs à concevoir des processus plus raffinés et valides pour produire des sphéroïdes qui représentent mieux un organe à plus grande échelle23,24,25.

Le cancer est la principale cause de décès dans le monde, et le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes26,27,28. Pour imiter le microenvironnement complexe du cancer du sein, les sphéroïdes du cancer du sein doivent être cultivés à l’aide de cellules qui jouent un rôle de premier plan dans les tumeurs du sein, c’est-à-dire les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les fibroblastes et / ou les cellules immunitaires. De plus, pour un sphéroïde représentant le cancer du sein, l’expression des récepteurs hormonaux féminins (récepteurs œstrogènes/progestérone), la capacité de conserver l’état histologique de la tumeur de la patiente et la capacité d’imiter la réponse au traitement doivent également être prises en compte. Des études ont montré que les systèmes de co-culture 3D ont une organisation cellulaire similaire à celle du tissu primaire in vivo,ont la capacité de réagir en temps réel aux stimuli, et ont des récepteurs androgènes fonctionnels29,30,31,32. Par conséquent, une approche similaire pourrait être utile pour imiter une tumeur du sein in vitro. Le but du protocole actuel est d’établir une nouvelle méthode de génération de sphéroïdes du cancer du sein. Cette méthode utilise des cellules MCF-7 à récepteurs d’œstrogènes positifs (une lignée cellulaire humaine immortalisée de cellules épithéliales) et des cellules endothéliales vasculaires (HUVEC) ou des cellules endothéliales lymphatiques (HMVEC-DNeo) pour créer un modèle qui imite ou reflète étroitement les interactions entre ces cellules au sein d’une tumeur. Bien que les cellules MCF-7 (sensibles aux œstrogènes) et endothéliales aient été utilisées pour développer des sphéroïdes dans la présente étude, d’autres cellules telles que les fibroblastes qui représentent environ 80% de la masse tumorale du sein pourraient également être combinées à l’avenir pour mieux représenter et imiter la tumeur mammaire.

Il existe plusieurs méthodes pour former des sphéroïdes, telles que: 1) la méthode des gouttelettes suspendues qui utilise la gravité33,34; 2) la méthode de lévitation magnétique qui utilise des nanoparticules magnétiques exposées à un aimant externe 35 , et3)la méthode de microplaque sphéroïde qui est réalisée en ensemençant des cellules sur des plaques à faible fixation36,37. Sur la base des méthodes existantes, qui n’utilisent qu’un seul type de cellule, le présent protocole a été optimisé en utilisant des cellules épithéliales et endothéliales pour mieux imiter les conditions de croissance des tumeurs du cancer du sein in vivo38,39,40,41. Cette méthode peut être facilement réalisée en laboratoire à faible coût et avec un minimum d’équipement. Sur la base des besoins / objectifs du laboratoire, différentes approches ont été utilisées pour former des sphéroïdes et obtenir du matériel cellulaire pertinent à partir de ces sphéroïdes. Dans ce contexte, pour l’analyse de l’ADN, de l’ARN ou des protéines, les sphéroïdes 3D sont produits en co-cultivant des cellules endothéliales et épithéliales avec la méthode de la goutte suspendue. Cependant, pour les études fonctionnelles, par exemple, pour surveiller la croissance cellulaire après une transfection interférente courte (siRNA) et / ou un traitement hormonal, les sphéroïdes sont générés à l’aide de plaques à fond en U.

Le but de ce protocole technique est de fournir une description détaillée étape par étape pour 1) la formation de sphéroïdes multicellulaires du cancer du sein, 2) la préparation d’échantillons pour la coloration histologique et 3) la collecte de cellules pour l’extraction de l’ARN, de l’ADN et des protéines. La méthode de chute suspendue peu coûteuse et les plaques à fond en U plus chères sont utilisées pour former des sphéroïdes. Ici, un protocole pour préparer (fixer) les sphéroïdes pour la section et l’immunocoloration ultérieure avec des marqueurs pour évaluer la prolifération cellulaire, l’apoptose et la distribution des cellules épithéliales et endothéliales dans un sphéroïde est fourni. De plus, ce protocole montre une analyse complète étape par étape des données histologiques à l’aide du logiciel ImageJ. L’interprétation des données biologiques varie en fonction du type d’expérience et des anticorps utilisés. La section des sphéroïdes fixes et la coloration ultérieure des sections ont été effectuées par un laboratoire de pathologie de routine (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Protocole

1. Culture cellulaire

REMARQUE: Effectuer la manipulation des cellules dans des conditions stériles.

  1. Sous-culture des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)
    1. Enduire 75 cm2 flacons de collagène (5 μg/cm2) (queue de rat) pendant la nuit (ON) à température ambiante (RT) ou 2-3 h à 37 °C, rincer à l’eau et laisser sécher la fiole.
    2. Cultiver des HUVEC en milieu de croissance (EBM-2, Milieu basal endothélial-2) complétés par de la glutamine (1x = 2 mM), une solution antibiotique-antimycotique (AA; 100 μg/mL de streptomycine, 100 μg/mL de pénicilline et 0,025 μg/mL d’amphotéricine B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL d’hydrocortisone, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain, 3 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes de base humains, 10 μg/mL d’héparine) et 10 % de FCS (sérum de veau fœtal) dans des conditions de culture tissulaire standard (37 °C, 5 % de CO2). Changez le milieu tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 70% à 80%.
    3. Laver les cultures sous-confluentes avec 5 mL de HBSS (sans Ca2+ et Mg2+)et ajouter 3 mL de trypsine (0,25% dilué dans HBSS (sans Ca2+ et Mg2+)).
      REMARQUE: HBSS peut également être remplacé par PBS.
    4. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2 min (vérifier au microscope si les cellules sont détachées et arrondies vers le haut) et arrêter la réaction de détachement en ajoutant 6 mL de milieu FCS à 10 % (DMEM-F12 ou EBM-2, 10 % FCS).
    5. Centrifuger la suspension de la cellule à 250 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant.
    6. Suspendez les cellules dans un milieu de croissance et ensemencez dans des flacons de 75 cm2 ou des plats de culture.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, cellules d’adénocarcinome du sein humain) sous-culture
    1. Cultiver des lignées cellulaires de cancer du sein humain dans des flacons de 75 cm2 en milieu de croissance (milieu DMEM/F12 complété par une glutamine commerciale (1x), une solution antibiotique-antimycotique (AA; 100 μg/mL de streptomycine, 100 μg/mL de pénicilline et 0,025 μg/mL d’amphotéricine B), et 10 % de FCS dans des conditions de culture tissulaire standard (37 °C, 5 % de CO2). Changez le milieu tous les 2-3 jours.
    2. Laver les cultures cellulaires sous-fluides (confluence à 70%-80%) avec 5 mL de HBSS (sans Ca2+ et Mg2+)et ajouter 3 mL de trypsine (0,5% diluée dans HBSS (sans Ca2+ et Mg2+)à 37 °C pendant 5 min (vérifier au microscope que les cellules sont détachées).
      REMARQUE: HBSS peut également être remplacé par PBS.
    3. Ajouter 8 mL de milieu FCS à 10 % pour arrêter la réaction de détachement, centrifuger à 250 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant.
    4. Suspendre le granulé dans un milieu de croissance et une assiette dans des flacons de 75 cm2 ou des plats de culture.

2. Formation de sphéroïdes

  1. Plaque 5 x 105 cellules/mL (HUVEC et MCF-7) dans un plat rond de 3,5 cm et culture pendant 48 h.
  2. Traiter ou transfecter les cellules plaquées pendant 24 h ou comme vous le souhaitez.
  3. Étape optionnelle effectuée dans une plaque à fond en U à 96 puits : Laver les cellules avec 1 mL de HBSS (Ca2+ et Mg2+)et colorer les HUVEC à l’aide d’un colorant bleu (0,5 μg/mL) et des cellules MCF-7 à l’aide d’un colorant vert (0,5 μM) dilué dans le milieu de croissance respectif et placer dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 à 40 min.
  4. Lavez les cellules avec 1 mL de HBSS (sans Ca2+ et Mg2+),ajoutez 1 mL de réactif de détachement enzymatique (0,25% de trypsine pour HUVEC et 0,5% de trypsine pour MCF-7) à chaque plat rond à l’aide d’une pipette P1000, puis incubez pendant 2 à 5 minutes jusqu’à ce que les cellules soient détachées.
  5. Recueillir chaque type de cellule séparément dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 mL et ajouter 1 mL de milieu FCS à 10 % à l’aide d’une pipette P1000 pour arrêter la réaction enzymatique. Centrifuger les suspensions cellulaires à 250 x g pendant 5 min.
  6. Aspirer soigneusement le surnageant et suspendre les cellules dans 1 mL de milieu sans stéroïdes (EBM-2, glutamine, antibiotique-antimycotique, 0,4% FCS sf (dépouillé de charbon de bois)).
    REMARQUE: Le milieu sans stéroïdes peut être remplacé par un milieu de croissance normal.
  7. Utiliser 100 μL de chaque suspension cellulaire diluée avec 10 mL de diluant II (voir Tableau des matériaux)pour déterminer le nombre total de cellules et calculer la quantité de milieu de traitement (EBM-2, glutamine, antibiotique-antimycotique, 0,4 % FCS sf, véhicule/traitement) nécessaire pour obtenir une suspension cellulaire de 5 x 103 cellules/mL ou 3,4 x 105 cellules/mL par type de cellule.
    1. Nombre de cellules
      1. Allumez la machine et rincez en appuyant sur les boutons Fonction et Démarrer (configuration S3), avec la solution de diluant II dans un flacon de compteur de cellules.
      2. Utilisez set up S4 et appuyez sur Start pour mesurer l’ébauche avec une solution fraîche de Diluent II.
      3. Changer le flacon de scintillation avec 100 μL de suspension cellulaire dans 10 mL de solution de Diluant II et mesurer les échantillons: installez S4 et appuyezsur Démarrer .
      4. Notez le nombre de cellules par mL sur l’affichage numérique.
        REMARQUE: Le comptage cellulaire peut également être effectué à l’aide d’autres systèmes manuels ou automatiques: quadrillage de l’hémocytomètre, technologie de comptage des cellules à diffusion de lumière, impédance électrique, systèmes basés sur l’imagerie utilisant la coloration cellulaire, par exemple, bleu trypan.
    2. Plaques à fond en U de 96 puits
      1. Préparer 5 mL de chaque suspension cellulaire (5 x 103 cellules/mL) et les mélanger pour obtenir un volume final de 10 mL dans un rapport de 1:1.
      2. Utilisez une pipette à répétition manuelle pour pipeter 100 μL de la suspension de la cellule dans chaque puits des plaques de fond en U de 96 puits.
      3. Placez la plaque dans un incubateur dans des conditions de culture tissulaire standard et vérifiez la formation de sphéroïdes après 48 h.
      4. Étape optionnelle : Prenez des photos des sphéroïdes (40x) à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence.
        REMARQUE: Cette méthode génère 96 sphéroïdes (un sphéroïde / puits) après 48 h (zone 1-2 pixel2), et elle est généralement utilisée pour les études de croissance.
    3. Goutte suspendue
      1. Mélanger les suspensions cellulaires (3,4 x 105 cellules/mL) dans un rapport de 1:1 pour obtenir un volume final de 2 mL.
      2. Utilisez une pipette P20 pour ensemencer le mélange cellulaire sous forme de gouttes de 15 μL sur le couvercle inversé d’une boîte de Petri de 10 cm.
      3. Inverser le couvercle avec les gouttes et ajouter 5 mL de milieu de base (EBM-2) au fond du plat pour éviter l’évaporation des gouttes.
        REMARQUE: Cette méthode génère un sphéroïde / goutte après 48 h. Assurez-vous que les gouttes sont suffisamment éloignées les unes des autres, afin qu’elles ne fusionnent pas lors du changement de couvercle. Utilisez plus d’une boîte de Petri de 10 cm si nécessaire.

3. Étude de croissance des sphéroïdes

  1. Plaque 100 μL de HUVEC et mélange de cellules MCF-7 (5 x 102 cellules/puits) dans des plaques à fond en U de 96 puits et placez-les dans l’incubateur.
  2. 48 h après le placage, vérifiez la formation de sphéroïdes avec un microscope inversé (champ lumineux). Prenez des photos (au moins six photos par traitement, 40x) à 96 h de culture.
  3. Ouvrez les images à l’aide d’un logiciel de traitement d’image et traitez l’image à 300 pixels / pouce et enregistrez l’image sous forme de fichier tiff.
  4. Téléchargez le logiciel ImageJ et ouvrez-le. Cliquez sur l’option Fichier et accédez à Ouvrir.
  5. Convertissez les zones d’intérêt en zones noires saturées de manière uniforme pour avoir une image binaire (noir et blanc). Pour cela, sélectionnez l’option Image, choisissez Type | 8 bits. Maintenant, l’image est en noir et blanc.
  6. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour dessiner la bordure des sphéroïdes.
  7. Pour calculer la zone d’intérêt et séparer l’objet ou les pixels de premier plan des pixels d’arrière-plan, utilisez la fonction de seuil: Sélectionnez l’option Image, choisissez Ajuster et cliquez sur Seuil.
  8. Maintenant, une fenêtre contextuelle Seuil s’ouvrira. La barre supérieure indique la valeur de seuil minimale : définissez la valeur à zéro. La barre inférieure indique la valeur de seuil maximale : déplacez la barre jusqu’à ce que la zone d’intérêt devienne complètement rouge.
    REMARQUE : Si la couleur n’est pas rouge, sélectionnez Rouge dans la fenêtre Seuil.
  9. Aller à Analyser | Définissez Mesures et sélectionnez Zone et périmètre.
  10. Pour mesurer la zone d’intérêt, sélectionnez l’option Analyser et utilisez l’outil Analyser les particules. Dans la fenêtre Analyser les particules, définissez la taille à mesurer (0,00003-infini ou 3-infini, selon la taille des sphéroïdes), sélectionnez Résumer et afficher les résultats. Ensuite, cliquez sur OK.
  11. Les résultats apparaîtront dans un graphique. Copiez les mesures dans une feuille de calcul pour analyser les données.
    REMARQUE: La zone est calculée comme le nombre total de pixels; utilisez la zone totale pour le calcul.

4. Étude d’immunohistochimie sphéroïde

  1. Préparation des échantillons
    1. Plaquer le mélange cellulaire de HUVEC et de MCF-7 (5 x 103 cellules/puits) dans des plaques à fond en U de 96 puits dans un milieu de croissance HUVEC pendant 96 h.
    2. Recueillir environ 50 sphéroïdes dans un tube de 1,5 mL avec une pointe coupée d’une pipette P200 μL; laissez-les se déposer au fond du tube par gravité, puis jetez le surnageant.
    3. Fixez les sphéroïdes avec 500 μL de PFA à 4% pendant 1 h, RT.
    4. Faire bouillir la solution de gélose Nobel à 2% dans du PBS à l’aide d’une plaque chauffante avec un agitateur magnétique pendant 3-5 min pour dissoudre complètement la poudre d’agarose et refroidir à environ 60 ° C.
    5. Retirez le PFA avec une pipette P1000, lavez les sphéroïdes avec 500 μL de PBS et laissez-les sédimenter. Jetez le surnageant.
    6. Pipeter soigneusement 600 μL de solution d’agarose dans le tube de 1,5 mL avec des sphéroïdes et placer le tube immédiatement dans une centrifugeuse avec un rotor horizontal à 177 x g pendant 2 min.
    7. Ajoutez une ficelle courte au milieu de la solution d’agarose pour retirer facilement le bouchon du tube.
    8. Solidifier le bouchon d’agarose sur de la glace ou à 4 °C. Ajouter 500 μL de PBS dans le tube de 1,5 mL pour éviter le dessèchement de la pastille.
      REMARQUE: Les échantillons sont prêts pour la déshydratation ultérieure, l’incorporation de paraffine, le sectionnement, le transfert sur les lames du microscope et la coloration IHC (effectuée par Sophistolab).
  2. Acquisition et traitement d’images
    1. Acquérir des images de sections sphéroïdes à l’aide d’un stéréomicroscope.
    2. Enregistrez trois images pour chaque exemple en tant que fichiers .jpg.
    3. Ouvrez le logiciel ImageJ. Ouvrez l’image JPEG, cliquez sur Fichier puis sur Ouvrir.
    4. Sélectionnez Déconvolution des couleurs et des couleurs dans l’option Image.
    5. Sélectionnez vecteurs DAB H dans la fenêtre Déconvolution des couleurs 1.7 et les trois images s’affichent.
      REMARQUE: Les trois images sont: La couleur 1 représente uniquement la coloration à l’hématoxyline (bleu / violet) et la couleur 2 représente uniquement la coloration DAB (brun). La couleur 3 n’est pas nécessaire pour l’analyse d’image avec deux colorations.
    6. Sélectionnez la fenêtre Couleur 1 et définissez le seuil : accédez à Image | Ajustez et cliquez sur Seuil. La fenêtre Seuil s’affiche.
    7. Laissez la valeur de seuil minimale définie à zéro et ajustez la valeur de seuil maximale pour supprimer le signal d’arrière-plan sans influencer le signal réel. Cliquez sur Appliquer.
      1. Mesure de surface
        1. Cliquez sur Analyser, choisissez Définir la mesure. Sélectionnez Zone, Valeur grise moyenneet Valeur grise min et maximale et cliquez sur OK pour confirmer.
        2. Mesurez la taille du noyau à l’aide de l’option Analyser, puis sélectionnez Mesurer.
          REMARQUE : La fenêtre Résultats donne le nom de l’image (étiquette), la taille de l’image (zone), l’intensité moyenne en pixels de l’image IHC (moyenne) et les valeurs de gris minimales et maximales (Min, Max). Utilisez la valeur moyenne pour le calcul.
        3. Répétez les étapes 4.2.6 à 4.7.1.2 pour la fenêtre Couleur 2 (et Couleur 3 s’il y a double coloration).
      2. Quantification cellulaire
        1. Cliquez sur Processus, choisissez l’option Binaire et sélectionnez Watershed pour séparer les cellules.
        2. Allez dans Analyser et cliquez sur Analyser les particules. Dans la fenêtre contextuelle Analyser les particules, définissez la taille des cellules pour exclure les particules non spécifiques. Ensuite, dans l’option Afficher, cliquez sur la liste déroulante et sélectionnez Contours. Ensuite, cliquez sur OK.
        3. Répétez les étapes 4.2.6 à 4.2.7 et les étapes de quantification des cellules (section 4.2.7.2) pour la fenêtre Couleur 2 (et Couleur 3 s’il y a double coloration).
          REMARQUE: Maintenant, trois fenêtres apparaîtront: 1) Résultats récapitulatifs (nombre de cellules comptées, surface totale, taille moyenne, % de la surface et moyenne), 2) Résultats (respectivement aux cellules comptées) et 3) Fenêtre de dessin (image représentée des cellules comptées).

5. Coloration vivante / morte dans les sphéroïdes

  1. Préparer 4 mM de solutions mères de Calcein AM dans le DMSO (taches vertes des cellules vivantes) et 2 mM d’homodimère d’Ethidium dans le DMSO (tache les cellules mortes en rouge) dans des tubes de 1,5 mL.
  2. Calculer la quantité de solution nécessaire pour ajouter 10 μL/puits d’un mélange de Calcein AM et d’homodimère d’Ethidium dilué à 1:50 dans EBM-2.
  3. Ajouter le mélange de coloration aux sphéroïdes et placer la plaque dans l’incubateur dans des conditions de culture tissulaire standard pendant 30 à 60 min.
  4. Acquérir des images (40x) à l’aide du stéréomicroscope à fluorescence.

6. Isolement de la protéine et de l’ARN du sphéroïde

  1. Préparer des suspensions cellulaires à 3,4 x 105 cellules/mL par type de cellule, les mélanger dans un rapport de 1:1 et ensemencer le mélange cellulaire à l’aide d’une pipette P20 sous forme de gouttes de 15 μL sur le couvercle d’une boîte de Petri de 10 cm. Inverser le couvercle et le placer dans l’incubateur dans des conditions de culture tissulaire standard pendant 96 h.
  2. Utilisez 5 à 6 mL de PBS pour recueillir les sphéroïdes dans un tube de polystyrène à fond rond de 15 mL à l’aide de pipettes stériles en polystyrène de 5 mL.
    REMARQUE: Il est également possible d’utiliser des tubes coniques de 15 mL.
  3. Centrifuger la suspension des sphéroïdes à 250 x g pendant 5 min, puis aspirer soigneusement le surnageant.
  4. Ajouter 500 μL de trypsine (100%) et pipeter de haut en bas à l’aide d’une pipette P1000 pendant 30 s pour désagréger les sphéroïdes, obtenant ainsi une suspension cellulaire.
  5. Neutraliser la trypsine avec un milieu FCS à 10%, centrifuger les tubes à 250 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
  6. Selon le protocole du fabricant (kit spécifique pour l’isolement de l’ARN sans ADN), utilisez 300 μL de tampon de lyse d’ARN pour lyser la pastille cellulaire.
    REMARQUE: Le tampon de lyse peut également être directement ajouté aux sphéroïdes intacts (aucune étape de trypsine requise) pour extraire l’ARN. Ajouter 300 μL du tampon de lyse aux sphéroïdes granulés, placer les tubes dans la glace et triturer 10 fois à l’aide d’une pipette P200. Par la suite, isolez l’ARN comme ci-dessus. La dissociation sphéroïde peut être nécessaire si la récupération de l’ARN est faible en raison d’interférences matricielles.
  7. Vous pouvez également utiliser 70 μL du tampon de lyse pour l’isolement des protéines. Homogénéiser pendant 2-4 s par sonication et déterminer la concentration en protéines selon le protocole du fabricant à l’aide d’un kit de dosage BCA.
    REMARQUE: Pour l’isolement des protéines, les sphéroïdes granulés peuvent être lysés directement dans un tampon de lyse suivi d’une sonication. Utilisez 25 μg de protéines totales pour effectuer le transfert western.

Résultats

Le modèle de sphéroïdes utilisant des co-cultures épithéliales et endothéliales est nécessaire pour imiter étroitement les conditions in vivo des tumeurs mammaires pour des expériences in vitro. Le schéma de la figure 1 illustre le protocole de formation de sphéroïdes avec des cellules épithéliales du cancer du sein et des cellules endothéliales vasculaires ou lymphatiques (Figure 1). Chaque type de cellule est ensemencé sépar?...

Discussion

Comparée aux cultures cellulaires 2D, la technologie révolutionnaire de culture sphéroïde 3D est un outil meilleur et plus puissant pour reconstruire le microenvironnement d’un organe, les interactions cellule-cellule et les réponses médicamenteuses in vitro. Il s’agit du premier protocole décrivant la formation de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires multicellulaires (épithéliales et endothéliales) pour la recherche sur le cancer du sein. Ce protocole assure la croissance 3D sphéroïdal...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par la Fondation pour la recherche sur le cancer / subvention de la Ligue suisse contre le cancer KFS-4125-02-2017 à RKD et la subvention de l’Institut national de la santé DK079307 à EKJ.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishesCorningCLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture DishFalcon353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, SterileFalcon357543
Adobe PhotoshopVersion: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955
Calcein-AMSigma-Aldrich17783
CD31 (cluster of differentiation 31)Cell Marque131M-95monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)InvitrogenC7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)DBSMob189-05monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted MicroscopeOlympus Life ScienceOlympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3Cell Signaling9661Lpolyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)Roche11 179 179 001
Coulter ISOTON II DiluentBeckman Coulter844 80 11Diluent II
Coulter Z1, Cell CounterCoulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble AgarBD DifcoBD 214220
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-AldrichD6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2Lonza190860
Ethidium homodimerSigma-Aldrich46043
Fetal Calf Serum (FCS)Thermo Fisher ScientificSH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)Thermo Fisher ScientificSH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FALeica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redGibco14175053
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial CellsLonzaCC-2517
ImageJNational Institute of Health, USAWayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67Cell Marque275R-16monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)GibcoS003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell lineClinic for Gynecology, University Hospital ZurichProvived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plateThermo Fisher Scientific174925
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1xGibco10010015
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Protein Lysis BufferCell Signaling, Danvers, USA9803
Quick-RNA Miniprep KitZymo ResearchR1055
RNA Lysis BufferZymo ResearchR1060-1-100Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R CentrifugeHettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLFalcon352003
SonicatorBandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate readerTecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75TPP90076
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT3924

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