Сфероиды эпителиальных и эндотелиальных клеток молочной железы как потенциальная функциональная модель in vitro для исследований рака молочной железы

Резюме

Перекрестные помехи между эпителиальными клетками молочной железы и эндотелиальными клетками в значительной степени способствуют прогрессированию рака молочной железы, росту опухоли и метастазированию. В этом исследовании сфероиды были изготовлены из клеток рака молочной железы вместе с сосудистыми и / или лимфатическими эндотелиальными клетками и демонстрируют их применимость в качестве системы in vitro для исследования рака молочной железы.

Аннотация

Рак молочной железы является основной причиной смертности у женщин. Рост клеток рака молочной железы и их последующее метастазирование является ключевым фактором его прогрессирования. Хотя механизмы, участвующие в стимулировании роста рака молочной железы, интенсивно изучались с использованием монокультур клеток рака молочной железы, таких как клетки MCF-7, вклад других типов клеток, таких как сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки, которые тесно участвуют в росте опухоли, не был глубоко изучен. Клеточно-клеточное взаимодействие играет ключевую роль в росте и прогрессировании опухоли. Неоангиогенез, или развитие сосудов, необходим для роста опухоли, тогда как лимфатическая система служит порталом для миграции раковых клеток и последующего метастазирования. Недавние исследования свидетельствуют о том, что сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки могут значительно влиять на рост раковых клеток. Эти наблюдения подразумевают необходимость разработки моделей in vitro, которые более реалистично отражали бы процессы роста рака молочной железы in vivo. Кроме того, ограничения в исследованиях на животных требуют разработки моделей ex vivo, чтобы лучше прояснить задействованные механизмы.

В этой статье описывается развитие сфероидов рака молочной железы, состоящих как из клеток рака молочной железы (эстроген-рецептор-положительные клетки MCF-7), так и сосудистых и /или лимфатических эндотелиальных клеток. Протокол описывает подробный пошаговый подход к созданию двухэлементных сфероидов с использованием двух разных подходов: висячие капли (золотой стандарт и дешевизна) и 96-луночные U-образные нижние пластины (дорогие). Приведены подробные инструкции о том, как деликатно подобрать сформированные сфероиды для мониторинга роста путем микроскопических размеров и оценки жизнеспособности с использованием окрашивания мертвых и живых клеток. Кроме того, очерчены процедуры фиксации сфероидов для сечения и окрашивания специфическими для роста антителами для дифференциации паттернов роста в сфероидах. Дополнительно приведены подробности получения сфероидов с трансфектированными клетками и методы извлечения РНК для молекулярного анализа. В заключение, в этой статье приведены подробные инструкции по подготовке многоклеточных сфероидов для исследования рака молочной железы.

Введение

Использование животных для экспериментов имеет ограничения. Исследования на животных не могут точно имитировать прогрессирование заболевания у людей, а животные и люди не имеют одинаковых реакций на патогены. Кроме того, ограничения в экспериментах на животных из-за опасений по поводу страданий животных и этических проблем^1,2 все больше ограничивают исследовательские программы. In vitro системы были широко разработаны для обхода использования животных; более того, использование человеческих клеток сделало in vitro модели, более актуальные для патофизиологического и терапевтического исследован....

протокол

1. Клеточная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводить обработку клеток в стерильных условиях.

1. Субкультура эндотелиальных клеток пупочных вен человека (HUVECs)
   1. Покрыть 75^см2 колбы коллагеном (5 мкг/см2) (крысиный хвост) на ночь (ON) при комнатной температуре (RT) или 2-3 ч при 37 °C, промыть водой и дать колбе высохнуть.
   2. Выращивать HUVECs в питательной среде (EBM-2, эндотелиальная базальная среда-2) с добавлением глутамина (1x = 2 мМ), антибиотико-антимикотического раствора (AA; 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина и 0,025 мкг/мл амфотерицина B), LSGS (2% v/v FCS, 1 мкг/мл гидрокортизона, ....

Результаты

Модель сфероидов с использованием эпителиальных и эндотелиальных кокультур необходима для точной имитации in vivo состояний опухолей молочной железы для экспериментов in vitro. Схема на фиг.1 изображает протокол формирования сфероидов с эпителиальными клетками ра.......

Обсуждение

По сравнению с 2D-клеточными культурами, революционная технология 3D-сфероидных культур является лучшим и более мощным инструментом для реконструкции микросреды органа, клеточных взаимодействий и реакций на лекарства in vitro. Это первый протокол, описывающий образование сфероидов и?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes	Corning	CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile	Falcon	357543
Adobe Photoshop			Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	17783
CD31 (cluster of differentiation 31)	Cell Marque	131M-95	monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	Invitrogen	C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)	DBS	Mob189-05	monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope	Olympus Life Science		Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3	Cell Signaling	9661L	polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)	Roche	11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent	Beckman Coulter	844 80 11	Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter	Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar	BD Difco	BD 214220
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2	Lonza	190860
Ethidium homodimer	Sigma-Aldrich	46043
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)	Thermo Fisher Scientific	SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA	Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175053
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
ImageJ	National Institute of Health, USA		Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit)
Ki67	Cell Marque	275R-16	monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome		149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Gibco	S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line	Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich		Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate	Thermo Fisher Scientific	174925
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Protein Lysis Buffer	Cell Signaling, Danvers, USA	9803
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055
RNA Lysis Buffer	Zymo Research	R1060-1-100	Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge	Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL	Falcon	352003
Sonicator	Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader	Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75	TPP	90076
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924