АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Перекрестные помехи между эпителиальными клетками молочной железы и эндотелиальными клетками в значительной степени способствуют прогрессированию рака молочной железы, росту опухоли и метастазированию. В этом исследовании сфероиды были изготовлены из клеток рака молочной железы вместе с сосудистыми и / или лимфатическими эндотелиальными клетками и демонстрируют их применимость в качестве системы in vitro для исследования рака молочной железы.

Аннотация

Рак молочной железы является основной причиной смертности у женщин. Рост клеток рака молочной железы и их последующее метастазирование является ключевым фактором его прогрессирования. Хотя механизмы, участвующие в стимулировании роста рака молочной железы, интенсивно изучались с использованием монокультур клеток рака молочной железы, таких как клетки MCF-7, вклад других типов клеток, таких как сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки, которые тесно участвуют в росте опухоли, не был глубоко изучен. Клеточно-клеточное взаимодействие играет ключевую роль в росте и прогрессировании опухоли. Неоангиогенез, или развитие сосудов, необходим для роста опухоли, тогда как лимфатическая система служит порталом для миграции раковых клеток и последующего метастазирования. Недавние исследования свидетельствуют о том, что сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки могут значительно влиять на рост раковых клеток. Эти наблюдения подразумевают необходимость разработки моделей in vitro, которые более реалистично отражали бы процессы роста рака молочной железы in vivo. Кроме того, ограничения в исследованиях на животных требуют разработки моделей ex vivo, чтобы лучше прояснить задействованные механизмы.

В этой статье описывается развитие сфероидов рака молочной железы, состоящих как из клеток рака молочной железы (эстроген-рецептор-положительные клетки MCF-7), так и сосудистых и /или лимфатических эндотелиальных клеток. Протокол описывает подробный пошаговый подход к созданию двухэлементных сфероидов с использованием двух разных подходов: висячие капли (золотой стандарт и дешевизна) и 96-луночные U-образные нижние пластины (дорогие). Приведены подробные инструкции о том, как деликатно подобрать сформированные сфероиды для мониторинга роста путем микроскопических размеров и оценки жизнеспособности с использованием окрашивания мертвых и живых клеток. Кроме того, очерчены процедуры фиксации сфероидов для сечения и окрашивания специфическими для роста антителами для дифференциации паттернов роста в сфероидах. Дополнительно приведены подробности получения сфероидов с трансфектированными клетками и методы извлечения РНК для молекулярного анализа. В заключение, в этой статье приведены подробные инструкции по подготовке многоклеточных сфероидов для исследования рака молочной железы.

Введение

Использование животных для экспериментов имеет ограничения. Исследования на животных не могут точно имитировать прогрессирование заболевания у людей, а животные и люди не имеют одинаковых реакций на патогены. Кроме того, ограничения в экспериментах на животных из-за опасений по поводу страданий животных и этических проблем1,2 все больше ограничивают исследовательские программы. In vitro системы были широко разработаны для обхода использования животных; более того, использование человеческих клеток сделало in vitro модели, более актуальные для патофизиологического и терапевтического исследования. Обычные монослойные (2D) клеточные культуры широко используются, потому что они в некоторой степени имитируют ткани человека. Однако 2D-монокультуры не могут имитировать человеческие органы, а 2D-монокультуры не могут имитировать сложное микроокружение исходных органов и имитировать in vivo ситуация3,4,5,6. Кроме того, в монослойных клеточных культурах медикаментозное лечение может легко уничтожить / повредить все клетки. Важно отметить, что некоторые из этих ограничений могут быть преодолены путем перехода на многослойные трехмерные (3D) клеточные культуры.7,8. Фактически, было показано, что модели 3D-культур лучше отражают клеточную структуру, расположение и функцию клеток в первичных тканях. Эти 3D-культуры могут быть сформированы с использованием различных клеточных линий, похожих на функциональный орган. Действительно, существует две модели 3D-культур. Одна модель производит сфероиды агрегированных клеток, которые образуют кластеры и реорганизуют их в сферы (модели без каркасов). Второй дает органоиды, которые имеют более сложную структуру и состоят из комбинаций множественных орган-специфических клеток, которые рассматриваются как миниатюрная версия органов.9,10. Благодаря этому системы 3D-культур представляют собой инновационную технологию со многими биологическими и клиническими применениями. Таким образом, сфероиды и органоиды имеют многочисленные применения для моделирования заболеваний и исследований, связанных с регенеративной медициной, скринингом лекарств и токсикологическими исследованиями.6,11,12,13,14,15. Канцерогенные сфероиды, полученные из 3D-технологии, воссоздают морфологию и фенотип соответствующих типов клеток, имитируют in vivo микроокружение опухоли и моделирование клеточных коммуникаций и сигнальных путей, которые функционируют во время развития опухоли16,17,18. Кроме того, чтобы улучшить понимание биологии рака, сфероиды / органоиды опухоли также могут быть использованы для идентификации потенциальной специфической для пациента противораковой терапии (персонализированной) и оценки ее эффективности, токсичности и долгосрочных эффектов.19,20,21,22. Сфероиды открыли выдающиеся возможности для исследования патофизиологии, моделирования заболеваний и скрининга лекарств из-за их способности сохранять клеточную и трехмерную тканевую архитектуру, способности имитировать in vivo ситуация и клеточно-клеточные взаимодействия. Тем не менее, необходимо также знать об ограничениях этой системы, таких как отсутствие сосудистого / системного компонента, функциональной иммунной или нервной системы, и система представляет собой редукционистский подход по сравнению с животными моделями. Действительно, в отличие от животных моделей, 3D-структуры обеспечивают лишь приближение биологии в человеческом теле. Понимание ограничений 3D-метода может помочь исследователям разработать более совершенные и валидные процессы для получения сфероидов, которые лучше представляют орган в большем масштабе.23,24,25.

Рак является основной причиной смерти во всем мире, а рак молочной железы является наиболее распространенным раком у женщин26,27,28лет. Чтобы имитировать сложное микроокружение рака молочной железы, сфероиды рака молочной железы следует культивировать с использованием клеток, которые играют заметную роль в опухолях молочной железы, то есть эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток, фибробластов и / или иммунных клеток. Кроме того, для сфероида, представляющего рак молочной железы, также следует учитывать экспрессию рецепторов женских гормонов (рецепторов эстрогена / прогестерона), способность сохранять гистологический статус опухоли пациента и способность имитировать ответ на терапию. Исследования показали, что 3D кокультурные системы имеют клеточную организацию, аналогичную таковой первичной ткани in vivo,обладают способностью реагировать в режиме реального времени на раздражители и имеют функциональные андрогенные рецепторы29,30,31,32. Следовательно, подобный подход может быть полезен для имитации опухоли молочной железы in vitro. Целью текущего протокола является установление нового метода генерации сфероидов рака молочной железы. Этот метод использует эстроген-рецептор-положительные клетки MCF-7 (увековеченная клеточная линия эпителиальных клеток человека) и сосудистые эндотелиальные клетки (HUVECs) или лимфатические эндотелиальные клетки (HMVEC-DNeo) для создания модели, которая имитирует или близко отражает взаимодействия между этими клетками в опухоли. Хотя MCF-7 (эстроген-чувствительные) и эндотелиальные клетки были использованы для разработки сфероидов в настоящем исследовании, другие клетки, такие как фибробласты, которые составляют ~ 80% массы опухоли молочной железы, также могут быть объединены в будущем, чтобы лучше представлять и имитировать опухоль молочной железы.

Существует несколько методов образования сфероидов, таких как: 1) метод висячих капель, который использует гравитацию33,34; 2) метод магнитной левитации, использующий магнитные наночастицы, подвергающиеся воздействию внешнего магнита35,и 3) сфероидный микропластинчатый метод, который выполняется путем посева клеток на пластины с низким креплением36,37. На основе существующих методов, в которых используется только один тип клеток, настоящий протокол был оптимизирован с использованием эпителиальных и эндотелиальных клеток для лучшей имитации условий роста опухолей рака молочной железы in vivo38,39,40,41. Этот метод может быть легко достигнут в лаборатории при низких затратах и с минимальными требованиями к оборудованию. Основываясь на потребностях / целях лаборатории, были использованы различные подходы для формирования сфероидов и получения соответствующего клеточного материала из этих сфероидов. В этом контексте для анализа ДНК, РНК или белка 3D-сфероиды производятся путем совместного культивирования эндотелиальных и эпителиальных клеток методом висячей капли. Однако для функциональных исследований, например, для мониторинга роста клеток после короткой интерферирующей (siRNA) трансфекции и/или гормональной терапии, сфероиды генерируются с использованием U-нижних пластин.

Целью данного технического протокола является предоставление подробного пошагового описания 1) формирования сфероидов многоклеточного типа рака молочной железы, 2) подготовки образцов для гистологического окрашивания и 3) сбора клеток для экстракции РНК, ДНК и белков. Для формирования сфероидов используется как недорогой метод подвесных капель, так и более дорогие U-образные пластины. Здесь представлен протокол подготовки (фиксации) сфероидов к разделению и последующему иммуноокрашиванию маркерами для оценки пролиферации клеток, апоптоза и распределения эпителиальных и эндотелиальных клеток внутри сфероида. Кроме того, этот протокол показывает полный пошаговый анализ гистологических данных с использованием программного обеспечения ImageJ. Интерпретация биологических данных варьируется в зависимости от типа эксперимента и используемых антител. Секционирование фиксированных сфероидов и последующее окрашивание срезов выполнялось обычной лабораторией патологии (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

протокол

1. Клеточная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводить обработку клеток в стерильных условиях.

  1. Субкультура эндотелиальных клеток пупочных вен человека (HUVECs)
    1. Покрыть 75см2 колбы коллагеном (5 мкг/см2) (крысиный хвост) на ночь (ON) при комнатной температуре (RT) или 2-3 ч при 37 °C, промыть водой и дать колбе высохнуть.
    2. Выращивать HUVECs в питательной среде (EBM-2, эндотелиальная базальная среда-2) с добавлением глутамина (1x = 2 мМ), антибиотико-антимикотического раствора (AA; 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина и 0,025 мкг/мл амфотерицина B), LSGS (2% v/v FCS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл эпидермального фактора роста человека, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов человека, 10 мкг/мл гепарина) и 10% FCS (фетальная икроножная сыворотка) в стандартных условиях культивирования тканей (37 °C, 5% CO2). Меняйте среду каждые 2 дня, пока клетки не достигнут 70%-80% слияния.
    3. Промыть субслияющие культуры 5 мл HBSS (без Ca2+ и Mg2+)и добавить 3 мл трипсина (0,25% разведенного в HBSS (без Ca2+ и Mg2+)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS также может быть заменен на PBS.
    4. Инкубируют клетки при 37 °C в течение 2 мин (микроскопически проверяют, отделяются ли клетки и округляются) и останавливают реакцию отсоединения, добавляя 6 мл 10% среды FCS (DMEM-F12 или EBM-2, 10% FCS).
    5. Центрифугируют клеточную суспензию при 250 х г в течение 5 мин при РТ и отбрасывают супернатант.
    6. Суспендировать клетки в питательной среде и посадить в 75см2 колбы или культуральную посуду.
  2. Субкультура Мичиганского онкологического фонда-7 (MCF-7, клетки аденокарциномы молочной железы человека)
    1. Выращивайте клеточные линии рака молочной железы человека в колбах размером75 см2 в питательной среде (среда DMEM/F12, дополненная коммерческим глутамином (1x), антибиотико-антимикотическим раствором (AA; 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина и 0,025 мкг/мл амфотерицина B) и 10% FCS в стандартных условиях культивирования тканей (37 °C, 5% CO2). Меняйте среду каждые 2-3 дня.
    2. Промыть субконфлюентные клеточные культуры (70%-80% слияние) 5 мл HBSS (без Ca2+ и Mg2+)и добавить 3 мл трипсина (0,5% разбавленного в HBSS (без Ca2+ и Mg2+)при 37 °C в течение 5 мин (микроскопически убедитесь, что клетки отсоединены).
      ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS также может быть заменен на PBS.
    3. Добавьте 8 мл 10% среды FCS, чтобы остановить реакцию отсоединения, центрифугу при 250 х г в течение 5 мин при RT и выбросьте супернатант.
    4. Суспендировать гранулу в питательной среде и в тарелке по75 см2 колбы или культуральную посуду.

2. Сфероидное образование

  1. Пластина 5 х10 5 клеток/мл (HUVECs и MCF-7) в круглой посуде 3,5 см и культуре в течение 48 ч.
  2. Обрабатывайте или трансфектируйте покрытые клетки в течение 24 ч или по желанию.
  3. Необязательный этап, выполняемый в 96-луночной U-образной нижней пластине: промыть клетки 1 мл HBSS (Ca2+ и Mg2+)и окрашивать HUVEC с использованием синего красителя (0,5 мкг/мл) и клеток MCF-7 с использованием зеленого красителя (0,5 мкМ), разбавленного в соответствующей питательной среде, и поместить в инкубатор с 37 °C и 5% CO2 в течение 30-40 мин.
  4. Промыть клетки 1 мл HBSS (без Ca2+ и Mg2+),добавить 1 мл реагента ферментативной отслойки (0,25% трипсина для HUVEC и 0,5% трипсина для MCF-7) в каждую круглую посуду с помощью пипетки P1000, а затем инкубировать в течение 2-5 мин до отделения клеток.
  5. Соберите каждый тип клеток отдельно в полистирольную трубку с круглым дном объемом 5 мл и добавьте 1 мл 10% среды FCS с помощью пипетки P1000, чтобы остановить ферментативную реакцию. Центрифугируйте клеточные суспензии по 250 х г в течение 5 мин.
  6. Осторожно аспирировать супернатант и суспендировать клетки в 1 мл безстероидной среды (EBM-2, глютамин, антибиотик-антимикотик, 0,4% FCS sf (без древесного угля)).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безстероидная среда может быть заменена нормальной питательной средой.
  7. Используйте 100 мкл каждой клеточной суспензии, разбавленной 10 мл разбавителя II (см. Таблицу материалов), чтобыопределить общее количество клеток и рассчитать количество лечебной среды (EBM-2, глутамин, антибиотик-антимикотический, 0,4% FCS sf, транспортное средство / лечение), необходимое для получения клеточной суспензии 5х 10 3 клеток / мл или 3,4 х 105 клеток / мл на тип клеток.
    1. Количество ячеек
      1. Включите машину и смойте, нажав кнопки Function и Start (настройка S3), с раствором Diluent II во флаконе счетчика клеток.
      2. Используйте настройку S4 и нажмите кнопку Пуск, чтобы измерить заготовку свежим раствором Разбавителя II.
      3. Замените сцинтилляционный флакон со 100 мкл клеточной суспензии на 10 мл раствора разбавителя II и отмерьте образцы: установите S4 и нажмите Start.
      4. Обратите внимание на количество ячеек в мл на цифровом дисплее.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток также может быть выполнен с использованием других ручных или автоматических систем: линий сетки гемоцитометра, технологии подсчета клеток рассеяния света, электрического импеданса, систем на основе визуализации с использованием окрашивания клеток, например, трипан-синего цвета.
    2. 96-луночные U-образные плиты
      1. Подготовьте 5 мл каждой клеточной суспензии (5х 10 3 клетки/мл) и перемешайте их, чтобы получить конечный объем 10 мл в соотношении 1:1.
      2. Используйте ручную повторяющуюся пипетку, чтобы вытащить 100 мкл клеточной суспензии в каждую скважину из 96-луночных U-образных пластин.
      3. Поместите пластину в инкубатор в стандартных условиях культивирования тканей и проверьте образование сфероидов через 48 ч.
      4. Дополнительный шаг: Сделайте снимки сфероидов (40x) с помощью флуоресцентного стереомикроскопа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод генерирует 96 сфероидов (один сфероид /лунка) через 48 ч (площадь 1-2 пикселя2),и он обычно используется для исследований роста.
    3. Висячая капля
      1. Смешайте клеточные суспензии (3,4х 10 5 клеток/мл) в соотношении 1:1, чтобы получить конечный объем 2 мл.
      2. Используйте пипетку P20 для посева клеточной смеси в виде капель объемом 15 мкл на перевернутую крышку чашки Петри размером 10 см.
      3. Переверните крышку с каплями и добавьте 5 мл базовой среды (EBM-2) на дно чашки, чтобы избежать испарения капель.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод генерирует один сфероид/каплю через 48 ч. Убедитесь, что капли находятся достаточно отдельно друг от друга, чтобы они не сливались при переключении крышки. При необходимости используйте более одной чашки Петри размером 10 см.

3. Исследование роста сфероидов

  1. Пластина 100 мкл СМЕСИ HUVEC и MCF-7 (5 x 102 ячейки/лунка) в 96-луночных U-образных нижних пластинах и поместите их в инкубатор.
  2. Через 48 ч после нанесения покрытия проверьте образование сфероидов с помощью перевернутого микроскопа (яркого поля). Делайте снимки (не менее шести снимков за обработку, 40 раз) через 96 ч культуры.
  3. Откройте изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений, обработайте изображение до 300 пикселей / дюйм и сохраните изображение в виде файла tiff.
  4. Загрузите программное обеспечение ImageJ и откройте его. Нажмите на опцию Файл и перейдите в Раздел Открыть.
  5. Преобразуйте интересующие области в насыщенные черные области единообразным образом, чтобы получить двоичное изображение (черно-белое). Для этого выберите параметр Изображение, выберите Тип | 8-бит. Теперь изображение черно-белое.
  6. Используйте инструмент «Выделение от руки», чтобы нарисовать границу сфероидов.
  7. Чтобы рассчитать интересующую область и отделить объект или пиксели переднего плана от пикселов фона, используйте функцию порога: Выберите опцию «Изображение», выберите «Настроить» и нажмите «Порог».
  8. Теперь откроется всплывающее окно Threshold. Верхняя панель указывает минимальное пороговое значение: установите значение равным нулю. Нижняя панель указывает максимальное пороговое значение: перемещайте бар до тех пор, пока интересующая область не станет полностью красной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если цвет не красный, выберите Красный в окне Порог.
  9. Перейти к анализу | Задайте измерения и выберите Площадь и периметр.
  10. Чтобы измерить интересующую область, выберите параметр «Анализ» и используйте инструмент «Анализ частиц». В окне Анализ частиц задайте размер для измерения (0,00003-Бесконечность или 3-Бесконечность, в зависимости от размера сфероидов), выберите Суммировать и отображать результаты. Затем нажмите OK.
  11. Результаты отобразятся на графике. Скопируйте измерения в электронную таблицу для анализа данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Площадь вычисляется как количество пикселей; используйте общую площадь для расчета.

4. Исследование сфероидной иммуногистохимии

  1. Пробоподготовка
    1. Обложите клеточную смесь HUVECs и MCF-7 (5 x 103 ячейки/лунка) в 96-луночных U-образных нижних пластинах в среде для роста HUVEC в течение 96 ч.
    2. Соберите приблизительно 50 сфероидов в трубку объемом 1,5 мл с разрезанным наконечником пипетки P200 мкл; дайте им осесть на дно трубки под действием силы тяжести, а затем выбросьте супернатант.
    3. Зафиксируйте сфероиды с 500 мкл 4% PFA в течение 1 ч, RT.
    4. Вскипятите 2% раствор агара Нобеля в PBS с помощью конфорки с магнитной мешалкой в течение 3-5 мин, чтобы полностью растворить порошок агарозы и остыть примерно до 60 °C.
    5. Удалите PFA с помощью пипетки P1000, промыте сфероиды 500 мкл PBS и дайте им отстояться. Выбросьте супернатант.
    6. Осторожно пипетку 600 мкл раствора агарозы в трубку объемом 1,5 мл со сфероидами и поместите трубку сразу в центрифугу с горизонтальным ротором при 177 х г в течение 2 мин.
    7. Добавьте короткую нить в середину раствора агарозы, чтобы легко извлечь пробку из трубки.
    8. Затвердевают агарозную пробку на льду или при 4 °C. Добавьте 500 мкл PBS в пробирку объемом 1,5 мл, чтобы избежать высыхания гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы готовы к последующему обезвоживанию, встраиванию парафина, сечению, переносу на предметные стекла микроскопа и окрашиванию IHC (выполняется Sophistolab).
  2. Получение и обработка изображений
    1. Получение изображений сфероидных участков с помощью стереомикроскопа.
    2. Сохраните три изображения для каждого образца в виде .jpg файлов.
    3. Откройте программное обеспечение ImageJ. Откройте изображение JPEG, нажмите «Файл», а затем «Открыть».
    4. Выберите «Цвет и деконволюция цвета» в параметре «Изображение».
    5. Выберите векторы H DAB в окне Color Deconvolution 1.7, и появятся три изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три изображения: Цвет 1 представляет только окрашивание гематоксилином (синий / фиолетовый), а цвет 2 представляет только окрашивание DAB (коричневый). Цвет 3 не нужен для анализа изображения с двумя пятнами.
    6. Выберите окно Цвет 1 и установите Порог: перейдите в | Отрегулируйте и нажмите на Порог. Появится окно Порог.
    7. Оставьте минимальное пороговое значение равным нулю и настройте максимальное пороговое значение, чтобы удалить фоновый сигнал, не влияя на истинный сигнал. Нажмите кнопку Применить.
      1. Измерение площади
        1. Нажмите «Анализировать»,выберите «Установить измерение». Выберите Область, Среднее значение серого цветаи Минимальное и максимальное серое значение и нажмите OK для подтверждения.
        2. Измерьте размер ядра с помощью параметра «Анализировать», а затем выберите «Измерить».
          ПРИМЕЧАНИЕ: В окне Результаты указывается имя изображения (Метка), размер изображения (Область), средняя интенсивность пикселей изображения IHC (Среднее), а также минимальные и максимальные значения серого (Мин, Макс). Используйте среднее значение для расчета.
        3. Повторите шаги 4.2.6-4.7.1.2 для окна Color 2 (и Color 3 при наличии двойного окрашивания).
      2. Количественная оценка ячеек
        1. Нажмите «Процесс»,выберите опцию «Двоичный» и выберите «Водораздел» для разделения ячеек.
        2. Перейдите в «Анализ» и нажмите «Анализировать частицы». Во всплывающем окне «Анализ частиц» задайте размер ячеек, чтобы исключить неспецифические частицы. Затем на опции Показать нажмите на раскрывающийся список и выберите Контуры. Затем нажмите OK.
        3. Повторите шаги 4.2.6-4.2.7 и этапы количественной оценки ячеек (раздел 4.2.7.2) для окна Color 2 (и Color 3 при наличии двойного окрашивания).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь появятся три окна: 1) Сводные результаты (количество подсчитанных ячеек, общая площадь, средний размер, % площади и среднее), 2) Результаты (соответствующие ячейкам, которые подсчитываются) и 3) Окно рисования (изображенное изображение подсчитанных ячеек).

5. Живое/мертвое окрашивание в сфероидах

  1. Готовят 4 мМ стоковых растворов Кальциина АМ в ДМСО (окрашивает живые клетки зеленым цветом) и 2 мМ гомодимера этидия в ДМСО (окрашивает мертвые клетки красным цветом) в пробирках по 1,5 мл.
  2. Рассчитать количество раствора, необходимое для добавления 10 мкл/лунку смеси кальцеина АМ и гомодимера этидия, разведенного 1:50 в EBM-2.
  3. Добавьте окрашивающую смесь к сфероидам и поместите пластину в инкубатор при стандартных условиях культивирования тканей на 30-60 мин.
  4. Получайте снимки (40x) с помощью флуоресцентного стереомикроскопа.

6. Выделение белка и РНК сфероида

  1. Приготовьте клеточные суспензии по3,4 х 10 5 клеток/мл на тип клеток, перемешайте их в соотношении 1:1 и засейте клеточную смесь с помощью пипетки P20 в виде капель по 15 мкл на крышке чашки Петри 10 см. Переверните крышку и поместите ее в инкубатор в стандартных условиях культивирования тканей на 96 ч.
  2. Используйте 5-6 мл PBS для сбора сфероидов в 15 мл полистирольной трубки с круглым дном с использованием 5 мл стерильных полистирольных пипеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также возможно использование конических трубок объемом 15 мл.
  3. Центрифугируют суспензию сфероидов по 250 х г в течение 5 мин, а затем осторожно аспирируют надосадочный материал.
  4. Добавьте 500 мкл трипсина (100%) и пипетку вверх и вниз, используя пипетку P1000 в течение 30 с, чтобы дезагрегировать сфероиды, получая клеточную суспензию.
  5. Нейтрализуют трипсин 10% средой FCS, центрифугируют пробирки при 250 х г в течение 5 мин и аспирируют супернатант.
  6. Согласно протоколу производителя (специальный набор для выделения РНК без ДНК), используйте 300 мкл буфера лизиса РНК для лизирования клеточной гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лизиса также может быть непосредственно добавлен к интактным сфероидам (не требуется стадия трипсина) для извлечения РНК. Добавьте 300 мкл буфера лизиса к гранулированным сфероидам, поместите трубки во лед и тритурируйте 10 раз, используя пипетку P200. Впоследствии выделяют РНК, как указано выше. Сфероидная диссоциация может потребоваться, если восстановление РНК низкое из-за матричной интерференции.
  7. Альтернативно, используйте 70 мкл буфера Лизиса для выделения белка. Гомогенизировать в течение 2-4 с ультразвуком и определить концентрацию белка в соответствии с протоколом производителя с помощью набора для анализа BCA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения белка гранулированные сфероиды могут быть лизированы непосредственно в буфере лизиса с последующей обработкой ультразвуком. Используйте 25 мкг общего белка для выполнения вестерн-блоттинга.

Результаты

Модель сфероидов с использованием эпителиальных и эндотелиальных кокультур необходима для точной имитации in vivo состояний опухолей молочной железы для экспериментов in vitro. Схема на фиг.1 изображает протокол формирования сфероидов с эпителиальными клетками ра...

Обсуждение

По сравнению с 2D-клеточными культурами, революционная технология 3D-сфероидных культур является лучшим и более мощным инструментом для реконструкции микросреды органа, клеточных взаимодействий и реакций на лекарства in vitro. Это первый протокол, описывающий образование сфероидов и?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом Фонда исследований рака / Швейцарской онкологической лиги KFS-4125-02-2017 для RKD и грантом Национального института здравоохранения DK079307 для EKJ.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishesCorningCLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture DishFalcon353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, SterileFalcon357543
Adobe PhotoshopVersion: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955
Calcein-AMSigma-Aldrich17783
CD31 (cluster of differentiation 31)Cell Marque131M-95monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)InvitrogenC7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)DBSMob189-05monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted MicroscopeOlympus Life ScienceOlympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3Cell Signaling9661Lpolyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)Roche11 179 179 001
Coulter ISOTON II DiluentBeckman Coulter844 80 11Diluent II
Coulter Z1, Cell CounterCoulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble AgarBD DifcoBD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo)LonzaCC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-AldrichD6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2Lonza190860
Ethidium homodimerSigma-Aldrich46043
Fetal Calf Serum (FCS)Thermo Fisher ScientificSH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)Thermo Fisher ScientificSH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FALeica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redGibco14175053
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial CellsLonzaCC-2517
ImageJNational Institute of Health, USAWayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67Cell Marque275R-16monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscopeLeica MicrosystemsM205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)GibcoS003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell lineClinic for Gynecology, University Hospital ZurichProvived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plateThermo Fisher Scientific174925
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1xGibco10010015
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Protein Lysis BufferCell Signaling, Danvers, USA9803
Quick-RNA Miniprep KitZymo ResearchR1055
RNA Lysis BufferZymo ResearchR1060-1-100Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R CentrifugeHettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLFalcon352003
SonicatorBandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate readerTecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75TPP90076
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT3924

Ссылки

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены