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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.

Abstract

Il cancro al seno è la principale causa di mortalità nelle donne. La crescita delle cellule del cancro al seno e le loro successive metastasi è un fattore chiave per la sua progressione. Sebbene i meccanismi coinvolti nella promozione della crescita del cancro al seno siano stati intensamente studiati utilizzando monocolture di cellule di cancro al seno come le cellule MCF-7, il contributo di altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali vascolari e linfatiche che sono intimamente coinvolte nella crescita del tumore, non è stato studiato in profondità. L'interazione cellula-cellula svolge un ruolo chiave nella crescita e nella progressione del tumore. La neoangiogenesi, o lo sviluppo dei vasi, è essenziale per la crescita del tumore, mentre il sistema linfatico funge da portale per la migrazione delle cellule tumorali e le successive metastasi. Studi recenti forniscono la prova che le cellule endoteliali vascolari e linfatiche possono influenzare significativamente la crescita delle cellule tumorali. Queste osservazioni implicano la necessità di sviluppare modelli in vitro che riflettano più realisticamente i processi di crescita del cancro al seno in vivo. Inoltre, le restrizioni nella ricerca sugli animali richiedono lo sviluppo di modelli ex vivo per chiarire meglio i meccanismi coinvolti.

Questo articolo descrive lo sviluppo di sferoidi del cancro al seno composti sia da cellule di cancro al seno (cellule MCF-7 positive al recettore degli estrogeni) che da cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche. Il protocollo descrive un approccio dettagliato passo-passo nella creazione di sferoidi a doppia cella utilizzando due diversi approcci, hanging drop (gold standard ed economico) e piastre a U a 96 pozzetti (costose). Vengono fornite istruzioni approfondite su come raccogliere delicatamente gli sferoidi formati per monitorare la crescita mediante dimensionamento microscopico e valutazione della vitalità utilizzando la colorazione di cellule morte e vive. Inoltre, vengono delineate le procedure per fissare gli sferoidi per il sezionamento e la colorazione con anticorpi specifici della crescita per differenziare i modelli di crescita negli sferoidi. Inoltre, vengono forniti dettagli per la preparazione di sferoidi con cellule trasfettate e metodi per estrarre l'RNA per l'analisi molecolare. In conclusione, questo articolo fornisce istruzioni approfondite per la preparazione di sferoidi multicellulari per la ricerca sul cancro al seno.

Introduzione

L'uso di animali per esperimenti ha dei limiti. Gli studi sugli animali non possono imitare accuratamente la progressione della malattia negli esseri umani e gli animali e gli esseri umani non hanno risposte identiche agli agenti patogeni. Inoltre, le restrizioni nella sperimentazione animale a causa delle preoccupazioni per la sofferenza degli animali e dei problemi etici1,2 vincolano sempre più i programmi di ricerca. In vitro sono stati ampiamente sviluppati sistemi per eludere l'uso degli animali; inoltre, l'uso di cellule umane ha reso in vitro modelli più rilevanti per l'indagine fisiopatologica e terapeutica. Le colture cellulari monostrato convenzionali (2D) sono ampiamente utilizzate perché imitano i tessuti umani in una certa misura. Tuttavia, le monocolture 2D non riescono a imitare gli organi umani e le monocolture 2D non sono in grado di simulare il complesso microambiente degli organi originali e imitare il in vivo situazione3,4,5,6. Inoltre, nelle colture cellulari monostrato, i trattamenti farmacologici potrebbero facilmente distruggere / danneggiare tutte le cellule. È importante sottolineare che alcune di queste limitazioni possono essere superate passando a colture cellulari tridimensionali multistrato (3D)7,8. In effetti, i modelli di coltura 3D hanno dimostrato di riflettere meglio la struttura cellulare, il layout e la funzione delle cellule nei tessuti primari. Queste colture 3D possono essere formate utilizzando una varietà di linee cellulari, simili a un organo funzionale. In effetti, ci sono due modelli di culture 3D. Un modello produce sferoidi di cellule aggregate che formano cluster e li riorganizzano in sfere (modelli senza impalcature). Il secondo produce organoidi, che hanno una struttura più complessa e consistono in combinazioni di più cellule specifiche dell'organo, che sono considerate come una versione in miniatura degli organi9,10. Per questo motivo, i sistemi di coltura 3D rappresentano una tecnologia innovativa con molte applicazioni biologiche e cliniche. Pertanto, gli sferoidi e gli organoidi hanno numerose applicazioni per la modellazione delle malattie e gli studi relativi alla medicina rigenerativa, allo screening dei farmaci e agli studi tossicologici.6,11,12,13,14,15. Gli sferoidi cancerogeni, derivati dalla tecnologia 3D, ricreano la morfologia e il fenotipo dei tipi cellulari rilevanti, imitano il in vivo microambiente tumorale e modelli di comunicazioni cellulari e vie di segnalazione che sono operative durante lo sviluppo del tumore16,17,18. Inoltre, per migliorare la comprensione della biologia del cancro, gli sferoidi / organoidi tumorali possono anche essere utilizzati per identificare una potenziale terapia antitumorale specifica per il paziente (personalizzata) e valutarne l'efficacia, la tossicità e gli effetti a lungo termine19,20,21,22. Gli sferoidi hanno aperto importanti opportunità per studiare la fisiopatologia, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci a causa della loro capacità di preservare l'architettura dei tessuti cellulari e tridimensionali, la capacità di imitare il in vivo e le interazioni cellula-cellula. Tuttavia, si deve anche essere consapevoli dei limiti di questo sistema, come la mancanza di componente vascolare / sistemica, sistema immunitario funzionale o nervoso, e il sistema rappresenta un approccio riduzionista rispetto ai modelli animali. Infatti, a differenza dei modelli animali, le strutture 3D forniscono solo un'approssimazione della biologia all'interno di un corpo umano. Comprendere i limiti del metodo 3D può aiutare i ricercatori a progettare processi più raffinati e validi per la produzione di sferoidi che rappresentino meglio un organo su scala più ampia.23,24,25.

Il cancro è la principale causa di morte in tutto il mondo e il cancro al seno è il cancro più comune nelle donne26,27,28. Per imitare il complesso microambiente del cancro al seno, gli sferoidi del cancro al seno devono essere coltivati utilizzando cellule che svolgono un ruolo di primo piano nei tumori al seno, cioè cellule epiteliali, cellule endoteliali, fibroblasti e / o cellule immunitarie. Inoltre, per uno sferoide che rappresenta il cancro al seno, dovrebbero essere prese in considerazione anche l'espressione dei recettori ormonali femminili (recettori degli estrogeni / progesterone), la capacità di conservare lo stato istologico del tumore del paziente e la capacità di imitare la risposta alla terapia. Gli studi hanno dimostrato che i sistemi di co-coltura 3D hanno un'organizzazione cellulare simile a quella del tessuto primario in vivo,hanno la capacità di reagire in tempo reale agli stimoli, e hanno recettori androgeni funzionali29,30,31,32. Quindi, un approccio simile potrebbe essere utile per imitare un tumore al seno in vitro. Lo scopo dell'attuale protocollo è quello di stabilire un nuovo metodo per generare sferoidi del cancro al seno. Questo metodo utilizza cellule MCF-7 positive al recettore degli estrogeni (una linea cellulare umana immortalizzata di cellule epiteliali) e cellule endoteliali vascolari (HUVEC) o cellule endoteliali linfatiche (HMVEC-DNeo) per creare un modello che imita o riflette da vicino le interazioni tra queste cellule all'interno di un tumore. Sebbene MCF-7 (estrogeno-responsivo) e cellule endoteliali siano state utilizzate per sviluppare sferoidi nel presente studio, altre cellule come i fibroblasti che rappresentano circa l'80% della massa tumorale al seno, potrebbero anche essere combinate in futuro per rappresentare e imitare meglio il tumore al seno.

Esistono diversi metodi per formare sferoidi, come: 1) il metodo delle goccioline appese che impiega la gravità33,34; 2) il metodo di levitazione magnetica che utilizza nanoparticelle magnetiche esposte ad un magnete esterno35,e 3) il metodo delle micropiastre sferoidi che viene eseguito seminando cellule su piastre a basso attacco36,37. Sulla base dei metodi esistenti, che utilizzano un solo tipo di cellula, il presente protocollo è stato ottimizzato utilizzando cellule epiteliali ed endoteliali per imitare meglio le condizioni di crescita dei tumori del cancro al seno in vivo38,39,40,41. Questo metodo può essere facilmente ottenuto in laboratorio a basso costo e con requisiti minimi di attrezzatura. Sulla base delle necessità / obiettivi del laboratorio, sono stati utilizzati diversi approcci per formare sferoidi e ottenere materiale cellulare rilevante da questi sferoidi. In questo contesto, per l'analisi del DNA, dell'RNA o delle proteine, gli sferoidi 3D sono prodotti co-coltivando cellule endoteliali ed epiteliali con il metodo della goccia sospesa. Tuttavia, per gli studi funzionali, ad esempio, per monitorare la crescita cellulare dopo una breve trasfezione interferente (siRNA) e / o un trattamento ormonale, gli sferoidi vengono generati utilizzando piastre A-fondo.

Lo scopo di questo protocollo tecnico è quello di fornire una descrizione dettagliata passo-passo per 1) formare sferoidi di tipo multicellulare del cancro al seno, 2) preparare campioni per la colorazione istologica e 3) raccogliere cellule per l'estrazione di RNA, DNA e proteine. Sia il metodo economico della goccia sospesa che le piastre più costose con fondo a U vengono utilizzate per formare sferoidi. Qui, viene fornito un protocollo per la preparazione (fissaggio) di sferoidi per il sezionamento e la successiva immunocolorazione con marcatori per valutare la proliferazione cellulare, l'apoptosi e la distribuzione delle cellule epiteliali ed endoteliali all'interno di uno sferoide. Inoltre, questo protocollo mostra un'analisi completa passo-passo dei dati istologici utilizzando il software ImageJ. L'interpretazione dei dati biologici varia a seconda del tipo di esperimento e degli anticorpi utilizzati. Il sezionamento degli sferoidi fissi e la successiva colorazione delle sezioni è stato eseguito da un laboratorio di patologia di routine (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

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Protocollo

1. Coltura cellulare

NOTA: Condurre la manipolazione delle cellule in condizioni sterili.

  1. Sottocoltura delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)
    1. Rivestire 75 cm2 palloni con collagene (5 μg/cm2) (coda di ratto) durante la notte (ON) a temperatura ambiente (RT) o 2-3 ore a 37 °C, risciacquare con acqua e lasciare asciugare il matraccio.
    2. Crescere HUVEC in terreno di crescita (EBM-2, Endothelial Basal Medium-2) integrato con glutammina (1x = 2 mM), soluzione antibiotico-antimicotica (AA; 100 μg/mL di streptomicina, 100 μg/mL di penicillina e 0,025 μg/mL di amfotericina B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL di idrocortisone, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico umano, 3 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti di base umano, 10 μg/mL di eparina) e 10% FCS (Fetal Calf Serum) in condizioni standard di coltura tissutale (37 °C, 5% CO2). Cambiare il mezzo ogni 2 giorni fino a quando le cellule raggiungono il 70% -80% di confluenza.
    3. Lavare le colture subconfluenti con 5 mL di HBSS (senza Ca2+ e Mg2+) e aggiungere 3 mL di tripsina (0,25% diluito in HBSS (senza Ca2+ e Mg2+)).
      NOTA: HBSS può anche essere sostituito con PBS.
    4. Incubare le cellule a 37 °C per 2 minuti (controllare al microscopio se le cellule sono staccate e arrotondate per eccesso) e fermare la reazione di distacco aggiungendo 6 ml di mezzo FCS al 10% (DMEM-F12 o EBM-2, 10% FCS).
    5. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 minuti a RT ed eliminare il surnatante.
    6. Sospendere le cellule nel terreno di crescita e seminare in 75 cm2 fiaschi o piatti di coltura.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, cellule di adenocarcinoma mammario umano) sottocultura
    1. Coltivare linee cellulari di carcinoma mammario umano in flaconi da 75 cm2 in mezzo di crescita (mezzo DMEM/F12 integrato con una glutammina commerciale (1x), soluzione antibiotico-antimicotica (AA; 100 μg/mL di streptomicina, 100 μg/mL di penicillina e 0,025 μg/mL di amfotericina B) e 10% FCS in condizioni standard di coltura tissutale (37 °C, 5% CO2). Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.
    2. Lavare le colture cellulari subconfluenti (confluenza 70%-80%) con 5 mL di HBSS (senza Ca2+ e Mg2+) e aggiungere 3 mL di tripsina (0,5% diluita in HBSS (senza Ca2+ e Mg2+) a 37 °C per 5 min (verificare microscopicamente che le cellule siano staccate).
      NOTA: HBSS può anche essere sostituito con PBS.
    3. Aggiungere 8 mL di mezzo FCS al 10% per fermare la reazione di distacco, centrifugare a 250 x g per 5 minuti a RT ed eliminare il surnatante.
    4. Sospendere il pellet in terreno di crescita e piastra in 75 cm2 fiaschi o piatti di coltura.

2. Formazione sferoide

  1. Piastra 5 x 105 celle/mL (HUVEC e MCF-7) in un piatto rotondo di 3,5 cm e coltura per 48 ore.
  2. Trattare o trasfettare le cellule placcate per 24 ore o come desiderato.
  3. Fase opzionale eseguita in piastra con fondo a U a 96 pozzetti: lavare le celle con 1 mL di HBSS (Ca2+ e Mg2+)e colorare gli HUVEC utilizzando un colorante blu (0,5 μg/mL) e le cellule MCF-7 utilizzando un colorante verde (0,5 μM) diluito nel rispettivo mezzo di crescita e posizionare in un incubatore a CO2 a 37 °C e 5% per 30-40 min.
  4. Lavare le cellule con 1 mL di HBSS (senza Ca2+ e Mg2+), aggiungere 1 mL di reagente di distacco enzimatico (0,25% tripsina per HUVEC e 0,5% tripsina per MCF-7) a ciascun piatto rotondo usando una pipetta P1000, quindi incubare per 2-5 minuti fino a quando le cellule non si sono staccate.
  5. Raccogliere ogni tipo di cella separatamente in un tubo di polistirene a fondo tondo da 5 mL e aggiungere 1 mL di mezzo FCS al 10% utilizzando una pipetta P1000 per fermare la reazione enzimatica. Centrifugare le sospensioni cellulari a 250 x g per 5 min.
  6. Aspirare accuratamente il surnatante e sospendere le cellule in 1 mL di mezzo privo di steroidi (EBM-2, glutammina, antibiotico-antimicotico, 0,4% FCS sf (charcoal-stripped)).
    NOTA: il mezzo privo di steroidi può essere sostituito con il normale mezzo di crescita.
  7. Utilizzare 100 μL di ciascuna sospensione cellulare diluita con 10 mL di Diluente II (vedi Tabella dei Materiali)per determinare il numero totale di cellule e calcolare la quantità di mezzo di trattamento (EBM-2, glutammina, antibiotico-antimicotico, 0,4% FCS sf, veicolo/Trattamento) necessaria per ottenere una sospensione cellulare di 5 x10 3 cellule/mL o 3,4 x 105 cellule/mL per tipo di cellula.
    1. Conteggio delle celle
      1. Accendere la macchina e lavare premendo i pulsanti Funzione e Start (configurazione S3), con la soluzione Diluent II in un flaconcino del contatore cellulare.
      2. Utilizzare set up S4 e premere Start per misurare lo spazio vuoto con la nuova soluzione Diluent II.
      3. Cambiare il flaconcino di scintillazione con 100 μL di sospensione cellulare in 10 mL di soluzione di Diluent II e misurare i campioni: impostare S4 e premere Start.
      4. Prendere nota del numero di celle per mL sul display digitale.
        NOTA: il conteggio delle cellule può essere eseguito anche utilizzando altri sistemi manuali o automatici: griglie dell'emocitometro, tecnologia di conteggio delle celle a dispersione luminosa, impedenza elettrica, sistemi basati sull'imaging che utilizzano la colorazione cellulare, ad esempio il tripano blu.
    2. Piastre con fondo a U a 96 pozzetti
      1. Preparare 5 mL di ogni sospensione cellulare (5 x10 3 celle/mL) e mescolarli per ottenere un volume finale di 10 mL nel rapporto di 1:1.
      2. Utilizzare una pipetta a ripetizione manuale per pipettare 100 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto delle piastre con fondo a U a 96 pozzetti.
      3. Posizionare la piastra in un incubatore in condizioni standard di coltura tissutale e verificare la formazione di sferoidi dopo 48 ore.
      4. Passaggio opzionale: scatta foto degli sferoidi (40x) usando uno stereomicroscopio a fluorescenza.
        NOTA: Questo metodo genera 96 sferoidi (uno sferoide / pozzetto) dopo 48 ore (area 1-2 pixel2), e di solito viene utilizzato per studi di crescita.
    3. Goccia sospesa
      1. Mescolare le sospensioni cellulari (3,4 x 105 celle/ml) in un rapporto 1:1 per ottenere un volume finale di 2 ml.
      2. Utilizzare una pipetta P20 per seminare la miscela cellulare sotto forma di gocce da 15 μL sul coperchio invertito di una capsula di Petri da 10 cm.
      3. Capovolgere il coperchio con le gocce e aggiungere 5 ml di base media (EBM-2) sul fondo del piatto per evitare l'evaporazione delle gocce.
        NOTA: questo metodo genera uno sferoide/drop dopo 48 h. Assicurarsi che le gocce siano sufficientemente distanti l'una dall'altra, in modo che non si uniscano durante la commutazione del coperchio. Utilizzare più di una capsula di Petri da 10 cm, se necessario.

3. Studio sulla crescita sferoide

  1. Piastra 100 μL di HUVEC e miscela di cellule MCF-7 (5 x 102 celle / pozzetto) in piastre a U a 96 pozzetti e metterle nell'incubatore.
  2. 48 ore dopo la placcatura, verificare la formazione di sferoidi con un microscopio invertito (campo luminoso). Scatta foto (almeno sei foto per trattamento, 40x) a 96 ore di coltura.
  3. Apri le immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini ed elabora l'immagine a 300 pixel / pollice e salva l'immagine come file tiff.
  4. Scarica il software ImageJ e aprilo. Fai clic sull'opzione File e vai su Apri.
  5. Converti le aree di interesse in aree nere sature in modo uniforme per avere un'immagine binaria (bianco e nero). Per questo, seleziona l'opzione Immagine, scegli Tipo | 8 bit. Ora, l'immagine è in bianco e nero.
  6. Utilizzate lo strumento di selezione a mano libera per disegnare il bordo degli sferoidi.
  7. Per calcolare l'area di interesse e separare l'oggetto o i pixel in primo piano dai pixel di sfondo, utilizzare la funzione soglia: selezionare l'opzione Immagine, scegliere Regola e fare clic su Soglia.
  8. Ora si aprirà una finestra pop-up Soglia. La barra superiore indica il valore minimo di soglia: impostare il valore su zero. La barra inferiore indica il valore massimo di soglia: sposta la barra fino a quando l'area di interesse diventa completamente rossa.
    NOTA: se il colore non è rosso, selezionare Rosso dalla finestra Soglia.
  9. Vai ad Analizza | Impostate Misure (Measurements) e selezionate Area e Perimetro (Area) e Perimetro (Perimeter).
  10. Per misurare l'area di interesse, selezionare l'opzione Analizza e utilizzare lo strumento Analizza particelle. Nella finestra Analizza particelle, impostare la dimensione su misura (0,00003-Infinity o 3-Infinity, a seconda delle dimensioni degli sferoidi), selezionare Riepiloga e Visualizza risultati. Quindi, fare clic su OK.
  11. I risultati verranno visualizzati in un grafico. Copia le misurazioni in un foglio di calcolo per analizzare i dati.
    NOTA: l'area viene calcolata come numero di pixel totali; utilizzare l'area totale per il calcolo.

4. Studio di immunoistochimica sferoide

  1. Preparazione del campione
    1. Placcare la miscela cellulare di HUVEC e MCF-7 (5 x 103 celle / pozzetto) in piastre A fondo U a 96 pozzetti nel mezzo di crescita HUVEC per 96 ore.
    2. Raccogliere circa 50 sferoidi in un tubo da 1,5 ml con una punta tagliata di una pipetta P200 μL; permettere loro di depositarsi sul fondo del tubo per gravità, quindi scartare il surnatante.
    3. Fissare gli sferoidi con 500 μL di PFA al 4% per 1 ora, RT.
    4. Far bollire la soluzione di Nobel Agar al 2% in PBS utilizzando una piastra calda con un agitatore magnetico per 3-5 minuti per sciogliere completamente la polvere di agarosio e raffreddare a circa 60 °C.
    5. Rimuovere il PFA con una pipetta P1000, lavare gli sferoidi con 500 μL di PBS e lasciarli sedimentare. Scartare il surnatante.
    6. Pipettare con cura 600 μL di soluzione di agarosio nel tubo da 1,5 mL con sferoidi e posizionare immediatamente il tubo in una centrifuga con rotore orizzontale a 177 x g per 2 minuti.
    7. Aggiungere una corda corta nel mezzo della soluzione di agarosio per rimuovere facilmente la spina dal tubo.
    8. Solidificare il tappo di agarosio su ghiaccio o a 4 °C. Aggiungere 500 μL di PBS nel tubo da 1,5 mL per evitare l'essiccazione del pellet.
      NOTA: I campioni sono pronti per la successiva disidratazione, l'incorporamento di paraffina, il sezionamento, il trasferimento sui vetrini del microscopio e la colorazione IHC (eseguita da Sophistolab).
  2. Acquisizione ed elaborazione di immagini
    1. Acquisire immagini di sezioni sferoidi utilizzando uno stereomicroscopio.
    2. Salvare tre immagini per ogni esempio come file .jpg.
    3. Aprire il software ImageJ. Apri l'immagine JPEG, clicca su File e poi su Apri.
    4. Selezionate Deconvoluzione colore e colore nell'opzione Immagine.
    5. Selezionate I vettori H DAB nella finestra Color Deconvolution 1.7 e vengono visualizzate le tre immagini.
      NOTA: Le tre immagini sono: il colore 1 rappresenta solo la colorazione ematossilina (blu/viola) e il colore 2 rappresenta solo la colorazione DAB (marrone). Il colore 3 non è necessario per l'analisi dell'immagine con due macchie.
    6. Seleziona la finestra Colore 1 e imposta la Soglia: vai a Immagine | Regolare e fare clic su Soglia. Viene visualizzata la finestra Soglia.
    7. Lasciare il valore di soglia minima impostato su zero e regolare il valore di soglia massima per rimuovere il segnale di fondo senza influenzare il segnale reale. Fare clic su Applica.
      1. Misurazione dell'area
        1. Fare clic su Analizza, scegliere Imposta misurazione. Selezionare Area, Valore grigio medioe Valore grigio Minimo e Massimo e fare clic su OK per confermare.
        2. Misurare la dimensione del nucleo utilizzando l'opzione Analizza e quindi selezionare Misura.
          NOTA: la finestra Risultati fornisce il nome dell'immagine (Etichetta), le dimensioni dell'immagine (Area), l'intensità media in pixel dell'immagine IHC (Media) e i valori di grigio minimo e massimo (Min, Max). Utilizzare il valore medio per il calcolo.
        3. Ripetere i passaggi 4.2.6-4.7.1.2 per la finestra Colore 2 (e Colore 3 se è presente una doppia colorazione).
      2. Quantificazione cellulare
        1. Fare clic su Processo, scegliere l'opzione Binario e selezionare Spartiacque per separare le celle.
        2. Vai su Analizza e fai clic su Analizza particelle. Nella finestra popup Analizza particelle, impostare la dimensione delle celle per escludere particelle non specifiche. Quindi, nell'opzione Mostra, fai clic sulla casella a discesa e seleziona Contorni. Quindi, fare clic su OK.
        3. Ripetere i passaggi 4.2.6-4.2.7 e le fasi di quantificazione cellulare (sezione 4.2.7.2) per la finestra Colore 2 (e Colore 3 se è presente una doppia colorazione).
          NOTA: ora verranno visualizzate tre finestre: 1) Risultati di riepilogo (numero di celle contate, area totale, dimensione media, % di area e media), 2) Risultati (rispettivi alle celle contate) e 3) Finestra di disegno (immagine illustrata delle celle contate).

5. Colorazione viva / morta negli sferoidi

  1. Preparare 4 mM di soluzioni stock di Calcein AM in DMSO (macchie di cellule vive verdi) e 2 mM di omodimero di Ethidium in DMSO (macchie di cellule morte rosse) in tubi da 1,5 mL.
  2. Calcolare la quantità di soluzione necessaria per aggiungere 10 μL/pozzetto di una miscela di Calcein AM e Ethidium homodimer diluito 1:50 in EBM-2.
  3. Aggiungere la miscela colorante agli sferoidi e posizionare la piastra nell'incubatore in condizioni standard di coltura tissutale per 30-60 minuti.
  4. Acquisire immagini (40x) utilizzando lo stereomicroscopio a fluorescenza.

6. Isolamento proteico e RNA dello sferoide

  1. Preparare le sospensioni cellulari a 3,4 x 105 cellule / mL per tipo di cellula, mescolarle in un rapporto di 1: 1 e seminare la miscela cellulare usando una pipetta P20 sotto forma di gocce da 15 μL sul coperchio di una capsula di Petri da 10 cm. Capovolgere il coperchio e posizionarlo nell'incubatore in condizioni di coltura tissutale standard per 96 ore.
  2. Utilizzare 5-6 mL di PBS per raccogliere gli sferoidi in un tubo di polistirene a fondo tondo da 15 mL utilizzando pipette sterili in polistirene da 5 mL.
    NOTA: È anche possibile utilizzare tubi conici da 15 ml.
  3. Centrifugare la sospensione degli sferoidi a 250 x g per 5 minuti, quindi aspirare accuratamente il surnatante.
  4. Aggiungere 500 μL di tripsina (100%) e pipettare su e giù usando una pipetta P1000 per 30 s per disaggregare gli sferoidi, ottenendo una sospensione cellulare.
  5. Neutralizzare la tripsina con il 10% di mezzo FCS, centrifugare i tubi a 250 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
  6. Secondo il protocollo del produttore (kit specifico per l'isolamento dell'RNA privo di DNA), utilizzare 300 μL di tampone di lisi dell'RNA per lisare il pellet cellulare.
    NOTA: il tampone di lisi può anche essere aggiunto direttamente agli sferoidi intatti (non è richiesto alcun passaggio di tripsina) per estrarre l'RNA. Aggiungere 300 μL del tampone di lisi agli sferoidi pellettati, posizionare i tubi nel ghiaccio e triturare 10 volte usando una pipetta P200. Successivamente, isolare l'RNA come sopra. La dissociazione sferoide può essere necessaria se il recupero dell'RNA è basso a causa dell'interferenza della matrice.
  7. In alternativa, utilizzare 70 μL del tampone di lisi per l'isolamento proteico. Omogeneizzare per 2-4 s mediante sonicazione e determinare la concentrazione proteica secondo il protocollo del produttore utilizzando un kit di analisi BCA.
    NOTA: per l'isolamento proteico, gli sferoidi pellettati possono essere lisati direttamente nel tampone di lisi seguito da sonicazione. Utilizzare 25 μg di proteine totali per eseguire western blot.

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Risultati

Il modello di sferoidi che utilizza co-colture epiteliali ed endoteliali è necessario per imitare da vicino le condizioni in vivo dei tumori al seno per esperimenti in vitro. Lo schema in Figura 1 illustra il protocollo per formare sferoidi con cellule epiteliali del cancro al seno e cellule endoteliali vascolari o linfatiche (Figura 1). Ogni tipo di cellula viene seminato separatamente in un piatto rotondo di 3,5 cm e trattato con stimolatori...

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Discussione

Rispetto alle colture cellulari 2D, la rivoluzionaria tecnologia di coltura sferoide 3D è uno strumento migliore e più potente per ricostruire il microambiente di un organo, le interazioni cellula-cellula e le risposte ai farmaci in vitro. Questo è il primo protocollo che descrive la formazione di sferoidi da linee cellulari multicellulari (epiteliali ed endoteliali) per la ricerca sul cancro al seno. Questo protocollo garantisce la crescita 3D sferoidale degli sferoidi per un massimo di 5 giorni e gli sferoi...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 a RKD e National Institute of Health grant DK079307 a EKJ.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishesCorningCLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture DishFalcon353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, SterileFalcon357543
Adobe PhotoshopVersion: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955
Calcein-AMSigma-Aldrich17783
CD31 (cluster of differentiation 31)Cell Marque131M-95monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)InvitrogenC7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)DBSMob189-05monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted MicroscopeOlympus Life ScienceOlympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3Cell Signaling9661Lpolyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)Roche11 179 179 001
Coulter ISOTON II DiluentBeckman Coulter844 80 11Diluent II
Coulter Z1, Cell CounterCoulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble AgarBD DifcoBD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo)LonzaCC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-AldrichD6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2Lonza190860
Ethidium homodimerSigma-Aldrich46043
Fetal Calf Serum (FCS)Thermo Fisher ScientificSH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)Thermo Fisher ScientificSH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FALeica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redGibco14175053
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial CellsLonzaCC-2517
ImageJNational Institute of Health, USAWayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67Cell Marque275R-16monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscopeLeica MicrosystemsM205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)GibcoS003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell lineClinic for Gynecology, University Hospital ZurichProvived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plateThermo Fisher Scientific174925
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1xGibco10010015
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Protein Lysis BufferCell Signaling, Danvers, USA9803
Quick-RNA Miniprep KitZymo ResearchR1055
RNA Lysis BufferZymo ResearchR1060-1-100Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R CentrifugeHettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLFalcon352003
SonicatorBandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate readerTecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75TPP90076
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT3924

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