JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O crosstalk entre células epiteliais mamárias e células endoteliais contribui importantemente para a progressão do câncer de mama, crescimento do tumor e metástase. Neste estudo, os esferoides foram feitos a partir de células cancerígenas de mama juntamente com células endoteliais vasculares e/ou linfáticas e demonstram sua aplicabilidade como um sistema in vitro para pesquisa de câncer de mama.

Resumo

O câncer de mama é a principal causa de mortalidade em mulheres. O crescimento das células cancerígenas de mama e sua metástase subsequente é um fator-chave para sua progressão. Embora os mecanismos envolvidos na promoção do crescimento do câncer de mama tenham sido intensamente estudados utilizando monoculturas de células cancerígenas de mama, como as células MCF-7, a contribuição de outros tipos celulares, como células endoteliais vasculares e linfáticas que estão intimamente envolvidas no crescimento do tumor, não tem sido investigada em profundidade. A interação célula-célula desempenha um papel fundamental no crescimento e progressão do tumor. A neoangiogênese, ou o desenvolvimento de vasos, é essencial para o crescimento do tumor, enquanto o sistema linfático serve como um portal para a migração de células cancerígenas e metástase subsequente. Estudos recentes fornecem evidências de que células endoteliais vasculares e linfáticas podem influenciar significativamente o crescimento de células cancerosas. Essas observações implicam a necessidade de desenvolver modelos in vitro que reflitam de forma mais realista os processos de crescimento do câncer de mama in vivo. Além disso, as restrições na pesquisa animal exigem o desenvolvimento de modelos ex vivo para elucidar melhor os mecanismos envolvidos.

Este artigo descreve o desenvolvimento de esferoides de câncer de mama compostos tanto de células cancerígenas de mama (células mcf-7 positivas do receptor de estrogênio) quanto de células endoteliais vasculares e/ou linfáticas. O protocolo descreve uma abordagem detalhada passo a passo na criação de esferoides de células duplas usando duas abordagens diferentes, queda suspensa (padrão ouro e barato) e placas de fundo U de 96 poços (caras). Instruções aprofundadas são fornecidas para como captar delicadamente os esferoides formados para monitorar o crescimento através do dimensionamento microscópico e avaliando a viabilidade usando manchas de células mortas e vivas. Além disso, são delineados procedimentos para fixação dos esferoides para secção e coloração com anticorpos específicos para o crescimento para diferenciar padrões de crescimento em esferoides. Além disso, são fornecidos detalhes para a preparação de esferoides com células transfectadas e métodos para extrair RNA para análise molecular. Em conclusão, este artigo fornece instruções aprofundadas para a preparação de esferoides multicelulares para a pesquisa do câncer de mama.

Introdução

O uso de animais para experimentos tem limitações. Estudos em animais não podem imitar com precisão a progressão da doença em humanos, e animais e humanos não têm respostas idênticas a patógenos. Além disso, restrições na experimentação animal devido a preocupações com o sofrimento animal e problemas éticos1,2 cada vez mais restringe programas de pesquisa. In vitro sistemas têm sido amplamente desenvolvidos para contornar o uso de animais; além disso, o uso de células humanas fez in vitro modelos mais relevantes para a investigação fisiofisiológica e terapêutica. Culturas celulares monocamadas convencionais (2D) são amplamente utilizadas porque imitam tecidos humanos até certo ponto. No entanto, as monoculturas 2D não imitam órgãos humanos, e as monoculturas 2D são incapazes de simular o microambiente complexo dos órgãos originais e imitar o in vivo situação3,4,5,6. Além disso, nas culturas de células monocamadas, os tratamentos medicamentosos podem facilmente destruir/danificar todas as células. É importante ressaltar que algumas dessas limitações podem ser superadas mudando para culturas celulares tridimensionais multicamadas (3D)7,8. De fato, modelos de cultura 3D têm sido mostrados para refletir melhor a estrutura celular, layout e função das células nos tecidos primários. Essas culturas 3D podem ser formadas usando uma variedade de linhas celulares, semelhantes a um órgão funcional. Na verdade, existem dois modelos de culturas 3D. Um modelo produz esferoides de células agregadas que formam clusters e as reorganizam em esferas (modelos livres de andaimes). O segundo produz organoides, que possuem uma estrutura mais complexa e consistem em combinações de múltiplas células específicas de órgãos, que são consideradas como uma versão em miniatura de órgãos9,10. Devido a isso, os sistemas de cultura 3D representam uma tecnologia inovadora com muitas aplicações biológicas e clínicas. Assim, esferoides e organoides têm inúmeras aplicações para modelagem de doenças e estudos relacionados à medicina regenerativa, rastreamento de medicamentos e estudos toxicológicos6,11,12,13,14,15. Esferoides cancerígenos, derivados da tecnologia 3D, recriam a morfologia e o fenótipo de tipos celulares relevantes, imitam o in vivo microambiente tumoral, e modelo de comunicações celulares e vias de sinalização que estão operacionais durante o desenvolvimento do tumor16,17,18. Além disso, para melhorar a compreensão da biologia do câncer, os esferoides/organoides tumorais também podem ser usados para identificar uma potencial terapia anticâncer específica do paciente (personalizada) e avaliar sua eficácia, toxicidade e efeitos a longo prazo19,20,21,22. Esferoides abriram oportunidades proeminentes para investigar a fisiopatologia, modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos devido à sua capacidade de preservar a arquitetura celular e tridimensional do tecido, a capacidade de imitar o in vivo situação, e as interações célula-célula. No entanto, deve-se também estar atento às limitações desse sistema, como a falta de componente vascular/sistêmico, sistema imunológico funcional ou nervoso, e o sistema representa uma abordagem reducionista em relação aos modelos animais. De fato, ao contrário dos modelos animais, as estruturas 3D fornecem apenas uma aproximação da biologia dentro de um corpo humano. Entender as limitações do método 3D pode ajudar os pesquisadores a projetar processos mais refinados e válidos para a produção de esferoides que melhor representam um órgão em maior escala23,24,25.

O câncer é a principal causa de morte em todo o mundo, e o câncer de mama é o câncer mais comum em mulheres26,27,28. Para imitar o complexo microambiente do câncer de mama, os esferoides do câncer de mama devem ser cultivados usando células que desempenham um papel proeminente nos tumores mamários, ou seja, células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos e/ou células imunes. Além disso, para um esferoide representando o câncer de mama, a expressão dos receptores hormonais femininos (receptores de estrogênio/progesterona), a capacidade de conservar o tumor do paciente status histológico e a capacidade de imitar a resposta à terapia também devem ser consideradas. Estudos têm demonstrado que os sistemas de cocultura 3D possuem uma organização celular semelhante à do tecido primário in vivo,têm a capacidade de reagir em tempo real a estímulos, e possuem receptores andrógenos funcionais29,30,31,32. Assim, uma abordagem semelhante poderia ser útil para imitar um tumor de mama in vitro. O objetivo do protocolo atual é estabelecer um novo método de geração de esferoides de câncer de mama. Este método utiliza células MCF-7 receptores estrógenos positivos (uma linha celular humana imortalizada de células epiteliais) e células endoteliais vasculares (HUVECs) ou células endoteliais linfáticas (HMVEC-DNeo) para criar um modelo que imita ou reflete de perto as interações entre essas células dentro de um tumor. Embora as células MCF-7 (responsivas ao estrogênio) e as células endoteliais tenham sido usadas para desenvolver esferoides no presente estudo, outras células, como os fibroblastos que representam ~80% da massa tumor do mama, também poderiam ser combinadas no futuro para representar e imitar melhor o tumor mamário.

Existem vários métodos para formar esferoides, tais como: 1) o método de gotícula suspensa que emprega a gravidade33,34; 2) o método de levitação magnética que utiliza nanopartículas magnéticas expostas a um ímã externo35, e 3) o método de microplaca esferoide que é realizado por células semeadas em placas de baixa fixação36,37. Com base nos métodos existentes, que utilizam apenas um tipo de célula, o presente protocolo tem sido otimizado utilizando células epiteliais e endoteliais para melhor imitar as condições de crescimento dos tumores de câncer de mama in vivo38,39,40,41. Este método pode ser facilmente alcançado em laboratório a um baixo custo e com requisitos mínimos de equipamento. Com base na necessidade/objetivos do laboratório, diferentes abordagens foram utilizadas para formar esferoides e obter material celular relevante a partir desses esferoides. Neste contexto, para análise de DNA, RNA ou proteína, os esferoides 3D são produzidos por células endoteliais e epiteliais com o método de queda suspensa. No entanto, para estudos funcionais, por exemplo, para monitorar o crescimento celular após transfecção de interferência curta (siRNA) e/ou tratamento hormonal, os esferoides são gerados usando placas de fundo U.

O objetivo deste protocolo técnico é fornecer uma descrição detalhada passo a passo para 1) formação de esferoides multicelulares do câncer de mama, 2) preparando amostras para coloração histológica e 3) coleta de células para extração de RNA, DNA e proteínas. Tanto o método de queda de suspensão barato quanto as placas inferiores U mais caras são usadas para formar esferoides. Aqui, é fornecido um protocolo de preparação (fixação) de esferoides para secção e imunostenção subsequente com marcadores para avaliar a proliferação celular, apoptose e distribuição de células epiteliais e endoteliais dentro de um esferoide. Além disso, este protocolo mostra uma análise completa passo a passo dos dados histológicos usando o software ImageJ. A interpretação dos dados biológicos varia dependendo do tipo de experimento e dos anticorpos utilizados. A secção de esferoides fixos e a posterior coloração das seções foram realizadas por um laboratório de patologia de rotina (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Cultura celular

NOTA: Conduzir o manuseio da célula em condições estéreis.

  1. Subcultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)
    1. Cubra 75 cm2 frascos com colágeno (5 μg/cm2) (rabo-de-rato) durante a noite (ON) à temperatura ambiente (RT) ou 2-3 h a 37 °C, enxágue com água e deixe o frasco secar.
    2. Crescer HUVECs em meio de crescimento (EBM-2, Endotelial Basal Medium-2) suplementados com glutamina (1x = 2 mM), solução antibiótico-antimicótica (AA; 100 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de penicilina e 0,025 μg/mL de anfotericina B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL de hidrocortisona, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano, 3 ng/mL do fator de crescimento do fibroblasto básico humano, 10 μg/mL de heparina) e 10% FCS (Soro de Bezerro Fetal) em condições padrão de cultura tecidual (37 °C, 5% CO2). Troque o meio a cada 2 dias até que as células atinjam 70%-80% de confluência.
    3. Lave as culturas subcontraentes com 5 mL de HBSS (sem Ca2+ e Mg2+) e adicione 3 mL de trippsina (0,25% diluída em HBSS (sem Ca2+ e Mg2+).
      NOTA: O HBSS também pode ser substituído por PBS.
    4. Incubar as células a 37 °C por 2 min (verificar microscopicamente se as células estão separadas e arredondadas) e parar a reação de desapego adicionando 6 mL de 10% de meio FCS (DMEM-F12 ou EBM-2, 10% FCS).
    5. Centrifugar a suspensão celular a 250 x g por 5 min no RT e descartar o supernascedor.
    6. Suspenda as células em meio de crescimento e sementes em frascos de 75 cm2 ou pratos de cultura.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, células de adenocarcinoma de mama humana) subcultura
    1. Cultivar linhas de células cancerígenas de mama humanas em frascos de 75 cm2 em meio de crescimento (médio DMEM/F12 suplementado com glutamina comercial (1x), solução antibiótico-antimycótica (AA; 100 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de penicilina e 0,025 μg/mL de anfotericina B), e 10% FCS em condições padrão de cultura tecidual (37 °C, 5% CO2). Troque o meio a cada 2-3 dias.
    2. Lave as culturas celulares subconfluentes (70%-80% de confluência) com 5 mL de HBSS (sem Ca2+ e Mg2+) e adicione 3 mL de trippsina (0,5% diluída em HBSS (sem Ca2+ e Mg2+) a 37 °C por 5 min (verifique microscopicamente se as células são separadas).
      NOTA: O HBSS também pode ser substituído por PBS.
    3. Adicione 8 mL de meio FCS de 10% para parar a reação de desapego, centrífuga a 250 x g por 5 min em RT e descarte o supernaspetivo.
    4. Suspenda a pelota em meio de crescimento e placa em frascos de 75 cm2 ou pratos de cultura.

2. Formação esferoide

  1. Placa 5 x 105 células/mL (HUVECs e MCF-7) em um prato redondo de 3,5 cm e cultura por 48 h.
  2. Trate ou transfete as células banhadas por 24 h ou conforme desejado.
  3. Etapa opcional realizada em placa de fundo U de 96 poços: Lave as células com 1 mL de HBSS (Ca2+ e Mg2+) e colora HUVECs usando um corante azul (0,5 μg/mL) e células MCF-7 utilizando um corante verde (0,5 μM) diluídas no respectivo meio de crescimento e colocadas em uma incubadora de CO2 de 37 °C e 5% por 30-40 min.
  4. Lave as células com 1 mL de HBSS (sem Ca2+ e Mg2+),adicione 1 mL de reagente de descolamento enzimático (0,25% trypsin para HUVEC e 0,5% trypsin para MCF-7) a cada prato redondo usando uma pipeta P1000, e depois incubar por 2-5 min até que as células sejam separadas.
  5. Colete cada tipo de célula separadamente em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL e adicione 1 mL de meio FCS 10% usando uma pipeta P1000 para parar a reação enzimática. Centrifugar as suspensões celulares a 250 x g por 5 min.
  6. Aspire cuidadosamente o supernaente e suspenda as células em 1 mL de meio livre de esteroides (EBM-2, glutamina, antibiótico-antimíctico, 0,4% FCS sf (despojado de carvão)).
    NOTA: O meio sem esteroides pode ser substituído por meio de crescimento normal.
  7. Use 100 μL de cada suspensão celular diluída com 10 mL de Diluente II (ver Tabela de Materiais) para determinar o número total da célula e calcular a quantidade de meio de tratamento (EBM-2, glutamina, antibiótico-antimicomíntico, 0,4% FCS sf, veículo/Tratamento) necessário para obter uma suspensão celular de 5 x 103 células/mL ou 3,4 x 105 células/mL por tipo de célula.
    1. Contagem celular
      1. Ligue a máquina e lave pressionando os botões Function and Start (configuração S3), com solução Diluent II em um frasco de contador de células.
      2. Use configurar S4 e pressione Comece a medir o branco com a solução Diluent II fresca.
      3. Altere o frasco de cintilação com 100 μL de suspensão celular em 10 mL de solução Diluent II e meça as amostras: configurar S4 e pressionar Start.
      4. Observe o número de células por mL no visor digital.
        NOTA: A contagem de células também pode ser realizada usando outros sistemas manuais ou automáticos: linhas de grade hemocitâmica, tecnologia de contagem de células de dispersão de luz, impedância elétrica, sistemas baseados em imagens usando coloração celular, por exemplo, azul trypan.
    2. Placas de fundo U de 96 poços
      1. Prepare 5 mL de cada suspensão celular (5 x 103 células/mL) e misture-as para obter um volume final de 10 mL na proporção de 1:1.
      2. Use uma pipeta de repetição manual para pipeta de 100 μL da suspensão da célula em cada poço das placas inferiores U de 96 poços.
      3. Coloque a placa em uma incubadora em condições padrão de cultura tecidual e verifique se há formação de esferoides após 48 h.
      4. Passo opcional: Tire fotos dos esferoides (40x) usando um microscópio estéreo de fluorescência.
        NOTA: Este método gera 96 esferoides (um esferoide/bem) após 48 h (área 1-2 pixel2), e geralmente é usado para estudos de crescimento.
    3. Queda de enforcamento
      1. Misture as suspensões celulares (3,4 x 105 células/mL) em uma proporção de 1:1 para obter um volume final de 2 mL.
      2. Use uma pipeta P20 para semear a mistura celular na forma de gotas de 15 μL na tampa invertida de uma placa de Petri de 10 cm.
      3. Inverta a tampa com as gotas e adicione 5 mL de meio base (EBM-2) na parte inferior do prato para evitar a evaporação das gotas.
        NOTA: Este método gera um esferoide/queda após 48 h. Certifique-se de que as gotas estão suficientemente separadas umas das outras, para que elas não se fundam ao trocar a tampa. Use mais de uma placa de Petri de 10 cm, se necessário.

3. Estudo de crescimento esferoide

  1. Placa 100 μL de HUVECs e mistura de células MCF-7 (5 x 102 células/bem) em placas de fundo U de 96 poços e colocá-los na incubadora.
  2. 48 h após o revestimento, verifique se há formação de esferoides com um microscópio invertido (campo brilhante). Tire fotos (pelo menos seis fotos por tratamento, 40x) a 96 h de cultura.
  3. Abra as imagens usando um software de processamento de imagem e processe a imagem a 300 pixels/polegada e salve a imagem como um arquivo de tiff.
  4. Baixe o software ImageJ e abra-o. Clique na opção Arquivo e vá para Abrir.
  5. Converter as áreas de interesse em áreas negras saturadas de forma uniforme para ter uma imagem binária (preto e branco). Para isso, selecione a opção Imagem, escolha Digite | de 8 bits. Agora, a imagem é em preto e branco.
  6. Use a Ferramenta de Seleção à Mão Livre para desenhar a borda dos esferoides.
  7. Para calcular a área de interesse e separar o objeto ou os pixels do primeiro plano dos pixels de fundo, use a função limiar: Selecione a opção Imagem, escolha Ajustar e clicar em Limiar.
  8. Agora uma janela pop-up Threshold será aberta. A barra superior indica o valor mínimo do limiar: defina o valor em zero. A barra inferior indica o valor máximo do limiar: mova a barra até que a área de interesse fique completamente vermelha.
    NOTA: Se a cor não estiver vermelha, selecione Vermelho na janela Limiar.
  9. Vá para Analisar | Definir medidas e selecionar Área e Perímetro.
  10. Para medir a área de interesse, selecione a opção Analisar e use a ferramenta Analisar partículas. Na janela Analisar partículas, defina o Tamanho para medir (0,00003-Infinito ou 3-Infinito, dependendo do tamanho dos esferoides), selecione Resumo e Resultados de Exibição. Em seguida, clique em OK.
  11. Os resultados aparecerão em um gráfico. Copie as medições em uma planilha para analisar os dados.
    NOTA: A área é calculada como o número de pixels totais; usar a Área Total para cálculo.

4. Estudo de imunohistoquímica spheróide

  1. Preparação da amostra
    1. Aplaque a mistura celular de HUVECs e MCF-7 (5 x 103 células/bem) em placas de fundo U de 96 poços em meio de crescimento HUVEC por 96 h.
    2. Colete aproximadamente 50 esferoides em um tubo de 1,5 mL com uma ponta de corte de uma pipeta P200 μL; permitir que eles se acomodem na parte inferior do tubo pela gravidade, e depois descartar o supernatante.
    3. Fixar os esferoides com 500 μL de 4% PFA por 1 h, RT.
    4. Ferva 2% da solução Nobel Agar em PBS usando uma placa quente com um agitador magnético por 3-5 minutos para dissolver completamente o pó de agarose e esfriar até cerca de 60 °C.
    5. Remova o PFA com uma pipeta P1000, lave os esferoides com 500 μL de PBS e deixe-os sedimentares. Descarte o supernatante.
    6. Pipeta cuidadosamente 600 μL de solução agarose no tubo de 1,5 mL com esferoides e coloque o tubo imediatamente em uma centrífuga com um rotor horizontal a 177 x g por 2 min.
    7. Adicione uma corda curta no meio da solução agarose para remover facilmente o plugue do tubo.
    8. Solidificar agarose plug no gelo ou a 4 °C. Adicione 500 μL de PBS no tubo de 1,5 mL para evitar secar a pelota.
      NOTA: As amostras estão prontas para posterior desidratação, incorporação de parafina, secção, transferência para os slides do microscópio e coloração de IHC (realizada pelo Sophistolab).
  2. Aquisição e processamento de imagens
    1. Adquira imagens de seções esferoides usando um estereótipo.
    2. Salve três imagens para cada amostra à medida que .jpg arquivos.
    3. Abra o software ImageJ. Abra a imagem JPEG, clique em Arquivo e, em seguida, em Abrir.
    4. Selecione Desconvolução de cores e cores na opção Imagem.
    5. Selecione vetores H DAB na janela Deconvolução de cores 1.7 e as três imagens aparecem.
      NOTA: As três imagens são: A cor 1 representa apenas a mancha de Hematoxilina (azul/roxo), e a Cor 2 representa apenas a coloração DAB (marrom). A cor 3 não é necessária para a análise da imagem com duas manchas.
    6. Selecione a janela Cor 1 e defina o Limiar: vá para Imagem | Ajuste e clique em Limiar. A janela Limiar aparece.
    7. Deixe o valor mínimo do limiar definido em zero e ajuste o valor máximo do limiar para remover o sinal de fundo sem influenciar o sinal verdadeiro. Clique em Aplicar.
      1. Medição da área
        1. Clique em Analisar,escolha definir medição. Selecione Área, Valor cinza Médioe valor cinza Min e Max e clique em OK para confirmar.
        2. Meça o tamanho do núcleo usando a opção Analisar e selecione Medir.
          NOTA: A janela Resultados dá o nome da imagem (Rótulo), tamanho da imagem (Área), a intensidade média do pixel da imagem IHC (Média) e os valores cinzentos mínimos e máximos (Min, Max). Use o valor médio para cálculo.
        3. Repetir as etapas 4.2.6-4.7.1.2 para a janela Cor 2 (e Cor 3 se houver coloração dupla).
      2. Quantificação celular
        1. Clique em Processar,escolha a opção Binário e selecione Watershed para separar células.
        2. Vá para Analisar e clique em Analisar partículas. Na janela de pop-up Analyze Particles, defina o tamanho das células para excluir partículas inespecíficas. Em seguida, na opção Mostrar, clique na caixa de entrega e selecione Contornos. Em seguida, clique em OK.
        3. Repetir as etapas 4.2.6-4.2.7 e as etapas de quantificação celular (seção 4.2.7.2) para a janela Cor 2 (e Cor 3, se houver coloração dupla).
          NOTA: Agora aparecerão três janelas: 1) Resultados sumários (número de células contadas, área total, tamanho médio, % de área e média), 2) Resultados (respectivos para as células que são contadas) e 3) Janela de desenho (imagem retratada das células que são contadas).

5. Manchas vivas/mortas em Esferoides

  1. Prepare 4 mM soluções de estoque de Calcein AM em DMSO (manchas vivas verdes) e 2 mM de homodimer de Ethidium em DMSO (manchas de células mortas vermelhas) em tubos de 1,5 mL.
  2. Calcule a quantidade de solução necessária para adicionar 10 μL/poço de uma mistura de Calcein AM e Ethidium homodimer diluído 1:50 em EBM-2.
  3. Adicione a mistura de coloração aos esferoides e coloque a placa na incubadora em condições padrão de cultura tecidual por 30-60 min.
  4. Adquira imagens (40x) usando o microscópio estéreo fluorescência.

6. Isolamento da proteína e do RNA de Spheroid

  1. Prepare as suspensões celulares a 3,4 x 105 células/mL por tipo de célula, misture-as a uma razão de 1:1 e semee a mistura celular usando uma pipeta P20 na forma de gotas de 15 μL na tampa de uma placa de Petri de 10 cm. Inverta a tampa e coloque-a na incubadora em condições padrão de cultura tecidual por 96 h.
  2. Use 5-6 mL de PBS para coletar esferoides em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 15 mL usando pipetas de poliestireno estéreis de 5 mL.
    NOTA: Também é possível usar tubos cônicos de 15 mL.
  3. Centrifugar a suspensão dos esferoides a 250 x g por 5 min e, em seguida, aspirar cuidadosamente o supernatante.
  4. Adicione 500 μL de trippsina (100%) e pipeta para cima e para baixo usando uma pipeta P1000 por 30 s para desagregar esferoides, conseguindo uma suspensão celular.
  5. Neutralizar trippsina com 10% de meio FCS, centrifugar os tubos a 250 x g por 5 min, e aspirar o supernante.
  6. De acordo com o protocolo do fabricante (kit específico para isolamento de RNA sem DNA), use 300 μL de tampão de RNA para lise a pelota celular.
    NOTA: O tampão de lise também pode ser adicionado diretamente aos esferoides intactos (sem necessidade de etapa de trippsina) para extrair RNA. Adicione 300 μL do tampão de lise aos esferoides pelleted, coloque tubos no gelo e tritura 10 vezes usando uma pipeta P200. Posteriormente, isole o RNA como acima. A dissociação esferoide pode ser necessária se a recuperação do RNA for baixa devido à interferência matricial.
  7. Alternativamente, use 70 μL do tampão de lise para isolamento de proteínas. Homogeneize para 2-4 s por sônica e determine a concentração de proteína de acordo com o protocolo do fabricante usando um Kit de Ensaio BCA.
    NOTA: Para o isolamento da proteína, os esferoides pelleted podem ser diretamente lysed em tampão de lise seguido de sonicação. Use 25 μg de proteína total para realizar a mancha ocidental.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

O modelo de esferoides usando coculturas epiteliais e endoteliais é necessário para imitar de perto as condições in vivo dos tumores mamários para experimentos in vitro. O esquema na Figura 1 retrata o protocolo para formar esferoides com células epiteliais de câncer de mama e células endoteliais vasculares ou linfáticas(Figura 1). Cada tipo de célula é semeada separadamente em um prato redondo de 3,5 cm e tratada com estimuladores/i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Em comparação com as culturas celulares 2D, a revolucionária tecnologia de cultura esferoide 3D é uma ferramenta melhor e mais poderosa para reconstruir o microambiente de um órgão, interações células-células e respostas medicamentosas in vitro. Este é o primeiro protocolo que descreve a formação de esferoides a partir de linhas celulares multicelulares (epiteliais e endoteliais) para a pesquisa do câncer de mama. Este protocolo garante o crescimento 3D esferoidal de esferoides por até 5 dias, e o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pela Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 para rkd e National Institute of Health grant DK079307 to EKJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishesCorningCLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture DishFalcon353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, SterileFalcon357543
Adobe PhotoshopVersion: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955
Calcein-AMSigma-Aldrich17783
CD31 (cluster of differentiation 31)Cell Marque131M-95monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)InvitrogenC7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)DBSMob189-05monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted MicroscopeOlympus Life ScienceOlympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3Cell Signaling9661Lpolyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)Roche11 179 179 001
Coulter ISOTON II DiluentBeckman Coulter844 80 11Diluent II
Coulter Z1, Cell CounterCoulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble AgarBD DifcoBD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo)LonzaCC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-AldrichD6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2Lonza190860
Ethidium homodimerSigma-Aldrich46043
Fetal Calf Serum (FCS)Thermo Fisher ScientificSH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)Thermo Fisher ScientificSH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FALeica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redGibco14175053
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial CellsLonzaCC-2517
ImageJNational Institute of Health, USAWayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67Cell Marque275R-16monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscopeLeica MicrosystemsM205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)GibcoS003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell lineClinic for Gynecology, University Hospital ZurichProvived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plateThermo Fisher Scientific174925
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1xGibco10010015
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Protein Lysis BufferCell Signaling, Danvers, USA9803
Quick-RNA Miniprep KitZymo ResearchR1055
RNA Lysis BufferZymo ResearchR1060-1-100Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R CentrifugeHettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLFalcon352003
SonicatorBandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate readerTecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75TPP90076
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT3924

Referências

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285(2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97(2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460(2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116(2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720(2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955(2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Pesquisa do C ncerQuest o 173c ncer de mamatumoresferoidesneovasculariza ovasos linf ticoscrescimento tumoralc lulas endoteliaisc lulas epiteliaisprolifera o celular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados