乳腺上皮和内皮细胞球状体作为乳腺癌研究的潜在功能 体外 模型

摘要

乳腺上皮细胞和内皮细胞之间的串扰对乳腺癌进展、肿瘤生长和转移有重要贡献。在这项研究中，球状体是由乳腺癌细胞与血管和/或淋巴内皮细胞一起制成的，并证明了它们作为乳腺癌研究 的体外 系统的适用性。

摘要

乳腺癌是女性死亡的主要原因。乳腺癌细胞的生长及其随后的转移是其进展的关键因素。尽管使用MCF-7细胞等乳腺癌细胞的单一培养物对促进乳腺癌生长的机制进行了深入研究，但尚未深入研究其他细胞类型（例如密切参与肿瘤生长的血管和淋巴内皮细胞）的贡献。细胞 - 细胞相互作用在肿瘤生长和进展中起着关键作用。新血管生成或血管的发育对于肿瘤生长至关重要，而淋巴系统则是癌细胞迁移和随后转移的门户。最近的研究提供了证据表明，血管和淋巴内皮细胞可以显着影响癌细胞的生长。这些观察结果意味着需要开发体 外 模型，以更真实地反映 体内乳腺癌的生长过程 。此外，动物研究的限制要求开发 离体 模型，以更好地阐明所涉及的机制。

本文描述了由乳腺癌细胞（雌激素受体阳性MCF-7细胞）和血管和/或淋巴内皮细胞组成的乳腺癌球体的发展。该协议描述了使用两种不同的方法创建双细胞球体的详细分步方法，即悬挂式下降（黄金标准和便宜）和96孔U底板（昂贵）。提供了有关如何通过显微镜定量和使用死细胞和活细胞染色评估活力来精细拾取形成的球体以监测生长的深入说明。此外，还描述了用生长特异性抗体固定球体以进行切片和染色以区分球体中生长模式的程序。此外，还提供了用转染细胞制备球体的详细信息以及提取RNA进行分子分析的方法。总之，本文为制备用于乳腺癌研究的多细胞球体提供了深入的说明。

引言

使用动物进行实验有局限性。动物研究无法准确模拟人类的疾病进展，动物和人类对病原体的反应也不尽相同。此外，由于担心动物的痛苦和道德问题，动物实验受到限制^1,2 越来越限制研究项目。 In vitro 系统已被广泛开发，以规避动物的使用;而且，利用人体细胞已经使 in vitro 与病理生理学和治疗学研究更相关的模型。传统的单层（2D）细胞培养物被广泛使用，因为它们在某种程度上模仿人体组织。然而，2D单一培养无法模仿人体器官，2D单一培养无法模拟原始器官的复杂微环境并模仿 in vivo 情况^3,4,5,6.此外，在单层细胞培养物中，药物治疗很容易破坏/损伤所有细胞。重要的是，可以通过切换到多层三维（3D）细胞培养物来克服其中一些限制。^7,8.事实上，3D培养模型已被证明可以更好地反映原代组织中细胞的结构，布局和功能。这些3D培养物可以使用各种细胞系形成，类似于功能器官。事实上，有两种3D文化模型。一种模型产生聚集细胞的球体，这些细胞形成簇并将它们重组为球体（无支架模型）。第二种产生类器官，其具有更复杂的结构，由多个器官特异性细胞的组合组成，这些细胞被认为是器官的微型版本。^9,10.因此，3D培养系统代表了一种具有许多生物学和临床应用的创新技术。因此，球状体和类器官在疾病建模和与再生医学，药物筛选和毒理学研究相关的研究中具有许多应用。^{6,11,12,13,14,15}.源自3D技术的致癌球体，重建相关细胞类型的形态和表型，模仿 in vivo 肿瘤微环境，并对肿瘤发展过程中可操作的细胞通信和信号通路进行建模^16,17,18.此外，为了提高对癌症生物学的理解，肿瘤球状体/类器官还可用于识别潜在的患者特异性抗癌疗法（个性化）并评估其疗效，毒性和长期影响。^19,20,21,22.球状体为研究病理生理学，疾病建模和药物筛选提供了突出的机会，因为它们能够保存细胞和三维组织结构，能够模仿 in vivo 情况，以及细胞 - 细胞相互作用。然而，人们还必须意识到该系统的局限性，例如缺乏血管/全身成分，功能性免疫或神经系统，并且与动物模型相比，该系统代表了还原论的方法。事实上，与动物模型相比，3D结构仅提供人体内生物学的近似值。了解3D方法的局限性可能有助于研究人员设计更精细和有效的过程，以产生在更大尺度上更好地代表器官的球体。^23,24,25.

癌症是全世界死亡的主要原因，而乳腺癌是女性中最常见的癌症26、27、28。为了模拟乳腺癌的复杂微环境，应使用在乳腺肿瘤中起突出作用的细胞（即上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞和/或免疫细胞）培养乳腺癌球状体。此外，对于代表乳腺癌的球状体，还应考虑女性激素受体（雌激素/孕激素受体）的表达，保存患者肿瘤组织学状态的能力以及模仿治疗反应的能力。研究表明，3D共培养系统具有与体内原代组织相似的细胞组织，具有对刺激实时反应的能力，并具有功能性雄激素受体29、30、31、32。因此，类似的方法可能有助于在体外模拟乳腺肿瘤 。当前方案的目的是建立一种产生乳腺癌球体的新方法。该方法利用雌激素受体阳性MCF-7细胞（上皮细胞的永生化人细胞系）和血管内皮细胞（HUVECs）或淋巴内皮细胞（HMVEC-DNeo）来创建模拟或密切反映肿瘤内这些细胞之间相互作用的模型。虽然MCF-7（雌激素反应性）和内皮细胞在本研究中已被用于发展球状体，但其他细胞，如占乳腺肿瘤质量约80%的成纤维细胞，也可以在未来结合，以更好地代表和模仿乳腺肿瘤。

形成球体的方法有几种，例如:1）采用重力^33，34的悬挂液滴法;2）利用磁性纳米颗粒暴露于外部磁铁的磁悬浮法^35，以及3）通过在低附着板上接种细胞来执行的球状微孔板法36，37。在仅使用一种细胞类型的现有方法的基础上，对本方案已利用上皮细胞和内皮细胞进行了优化，以更好地模拟乳腺癌肿瘤在体内38、39、40、41的生长条件。这种方法可以在实验室中以低成本和最低的设备要求轻松实现。根据实验室的需求/目标，使用不同的方法来形成旋转体并从这些旋转体中获得相关的细胞材料。在这种情况下，对于DNA，RNA或蛋白质分析，3D球体是通过与悬挂滴法共培养内皮和上皮细胞来产生的。然而，对于功能研究，例如，为了监测短干扰（siRNA）转染和/或激素处理后的细胞生长，使用U底板生成球状体。

该技术方案的目的是为1）形成乳腺癌多细胞型球体，2）制备用于组织学染色的样品以及3）收集用于提取RNA，DNA和蛋白质的细胞提供详细的分步描述。廉价的悬挂式下降方法和更昂贵的U底板都用于形成球体。在这里，提供了制备（固定）球体的方案，用于切片和随后的免疫染色，并用标记物评估细胞增殖，凋亡以及球体内上皮和内皮细胞的分布。此外，该协议显示了使用ImageJ软件对组织学数据的完整分步分析。生物数据的解释因实验类型和所用抗体而异。固定球体的切片和随后的切片染色由常规病理学实验室（Sophistolab:info@sophistolab.ch）进行

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研究方案

1. 细胞培养

注意:在无菌条件下进行细胞处理。

1. 人脐静脉内皮细胞 （HUVECs） 传代培养
   1. 在室温（RT）下用胶原蛋白（5μg/ cm 2）（大鼠尾巴）在75^{cm 2}烧瓶中涂布过夜（ON）或在37°C下涂覆2-3小时，用水冲洗，并让烧瓶干燥。
   2. 在补充谷氨酰胺（1x = 2 mM），抗生素 - 抗真菌溶液（AA;100μg/ mL链霉素，100μg/ mL青霉素和0.025μg/ mL两性霉素B），LSGS（2%v / v FCS，1μg/ mL氢化可的松，10ng / mL人表皮生长因子，3ng / mL人碱性成纤维细胞生长因子）中培养HUVECs， 10μg/ mL肝素）和10%FCS（胎儿小牛血清）在标准组织培养条件（37°C，5%CO_2）下。每2天更换培养基，直到细胞达到70%-80%汇合。
   3. 用5 mL HBSS（不含Ca 2 +和Mg^{2 +）}洗涤亚汇合培养物，并加入3mL胰蛋白酶（在HBSS中稀释0.25%（不含Ca^{2 +}和Mg^{2 +））。}
      注意:HBSS也可以用PBS代替。
   4. 将细胞在37°C下孵育2分钟（显微镜检查细胞是否分离并四舍五入），并通过加入6mL的10%FCS培养基（DMEM-F12或EBM-2，10%FCS）停止分离反应。
   5. 在室温下以250×g离心细胞悬浮液5分钟，并弃去上清液。
   6. 将细胞悬浮在生长培养基中，种子放入75 cm² 烧瓶或培养皿中。
2. 密歇根癌症基金会-7（MCF-7，人乳腺癌细胞）传代培养
   1. 在生长培养基（补充有商业谷氨酰胺（1x）的DMEM / F12培养基，抗生素 - 抗真菌溶液（AA; 100μg/ mL链霉素，100μg/ mL青霉素和0.025μg/ mL两性霉素B）和10%FCS的生长培养基中培养人乳腺癌细胞系，并在标准组织培养条件下（37°C，5%CO_2）下培养10%FCS。每2-3天更换一次培养基。
   2. 用5mL HBSS（不含Ca 2 +和Mg^{2 +）}洗涤亚汇合细胞培养物（70%-80%汇合），并在37°C下加入3mL胰蛋白酶（在HBSS中稀释0.5%（不含Ca^{2 +}和Mg^{2 +）5}分钟（显微镜验证细胞是否分离）。
      注意:HBSS也可以用PBS代替。
   3. 加入8mL10%FCS培养基以停止分离反应，在室温下以250×g离心5分钟并弃去上清液。
   4. 将沉淀悬浮在生长培养基中，并将平板放入75 cm² 烧瓶或培养皿中。

2. 球体形成

1. 在^3.5 厘米圆形培养皿中平板5×10 5个细胞/mL（HUVECs和MCF-7）并培养48小时。
2. 处理或转染接种的细胞24小时或根据需要。
3. 在96孔U底板中执行的可选步骤:用1mL HBSS（Ca^{2 +} 和Mg^{2 +）}洗涤细胞，并使用蓝色染料（0.5μg/ mL）染色HUVECs，并使用绿色染料（0.5μM）稀释在相应生长培养基中的MCF-7细胞，并置于37°C和5%CO₂ 培养箱中30-40分钟。
4. 使用P1000移液管用1mL HBSS（不含Ca^{2 +} 和Mg^{2 +）}洗涤细胞，加入1mL酶分离试剂（HUVEC为0.25%胰蛋白酶，MCF-7为0.5%胰蛋白酶）到每个圆形培养皿中，然后孵育2-5分钟，直到细胞分离。
5. 将每种细胞类型分别收集在5 mL圆底聚苯乙烯管中，并使用P1000移液管加入1mL10%FCS培养基以停止酶促反应。将细胞悬浮液以250×g离心5分钟。
6. 小心地吸出上清液并将细胞悬浮在1mL无类固醇培养基（EBM-2，谷氨酰胺，抗生素抗真菌剂，0.4%FCS sf（木炭剥离））中。
   注意:无类固醇培养基可以用正常的生长培养基代替。
7. 使用100μL用10mL稀释剂II稀释的每个细胞悬浮液（见 材料表）来确定总细胞数并计算获得5 x 10³ 个细胞/ mL或3.4 x 10⁵ 个细胞/ mL每种细胞类型所需的处理培养基（EBM-2，谷氨酰胺，抗生素 - 抗真菌剂，0.4%FCS sf，载体/处理）的量。
   1. 细胞计数
      1. 打开机器并通过按下"功能"和"开始"按钮（设置S3）冲洗，将稀释剂II溶液放入细胞计数器小瓶中。
      2. 使用设置S4并按 开始 ，用新鲜的稀释剂II溶液测量坯料。
      3. 在10 mL稀释剂II溶液中用100μL细胞悬浮液更换闪烁小瓶并测量样品:设置S4并按 开始。
      4. 记下数字显示屏上每 mL 的细胞数。
         注意:细胞计数也可以使用其他手动或自动系统进行:血细胞计数器网格线，光散射细胞计数技术，电阻抗，使用细胞染色的基于成像的系统，例如台盼蓝。
   2. 96 孔 U 型底板
      1. 准备5 mL每个细胞悬浮液（5 x 10³ 个细胞/ mL）并混合它们以1:1的比例获得10 mL的最终体积。
      2. 使用手动重复移液器将100μL细胞悬浮液移出到96孔U底板的每个孔中。
      3. 将板置于标准组织培养条件下的培养箱中，并在48小时后检查球体形成。
      4. 可选步骤:使用荧光体视显微镜拍摄球体（40x）的照片。
         注意:此方法在48小时后产生96个球体（一个球体/孔）（面积1-2像素^2），通常用于生长研究。
   3. 吊坠
      1. 以1:1的比例混合细胞悬浮液^{（3.4×10 5} 个细胞/ mL），以获得2 mL的最终体积。
      2. 使用P20移液器以15μL滴剂的形式在10cm培养皿的倒盖上接种细胞混合物。
      3. 用滴剂倒盖，在培养皿底部加入5毫升基础培养基（EBM-2），以避免滴剂蒸发。
         注意:此方法在 48 小时后生成一个旋转椭球体/液滴。确保液滴彼此之间足够分开，以便在切换盖子时它们不会合并。如有必要，使用多个10厘米培养皿。

3. 球体生长研究

1. 将100μLHUVECs和MCF-7细胞混合物（5×10² 个细胞/孔）加入96孔U型底板中，并将其置于培养箱中。
2. 电镀后48小时，用倒置显微镜（明场）检查球体的形成。在培养96小时时拍照（每次治疗至少六张照片，40倍）。
3. 使用图像处理软件打开图片，将图像处理为300像素/英寸，并将图像另存为tiff文件。
4. 下载 ImageJ 软件并将其打开。单击"文件"选项，然后转到"打开"。
5. 以统一的方式将感兴趣的区域转换为饱和的黑色区域，以获得二进制图像（黑白）。为此，请选择" 图像 "选项，然后选择 "键入| 8 位"。现在，图像是黑白的。
6. 使用手绘选择工具绘制旋转椭球体的边框。
7. 要计算感兴趣区域并将对象或前景像素与背景像素分开，请使用阈值功能:选择" 图像 "选项，选择" 调整 "，然后单击" 阈值"。
8. 现在将打开一个阈值弹出窗口。顶栏指示最小阈值:将值设置为零。底部条表示最大阈值:移动柱，直到感兴趣区域完全变为红色。
   注意:如果颜色不是红色，请从"阈值"窗口中选择 "红色 "。
9. 转到分析|设置测量值，然后选择"面积和周长"。
10. 要测量感兴趣区域，请选择 分析 选项，然后使用 分析粒子 工具。在 "分析粒子" 窗口中，将 "大小" 设置为测量（0.00003-无穷大或 3-无穷大，具体取决于球体的大小），选择" 汇总 并 显示结果"。然后，单击 确定。
11. 结果将显示在图表中。将测量结果复制到电子表格中以分析数据。
    注意:面积按总像素数计算;使用总面积进行计算。

4. 球状免疫组织化学研究

1. 样品制备
   1. 将HUVECs和MCF-7的细胞混合物（5×10³ 个细胞/孔）在HUVEC生长培养基的96孔U底板中平板96小时。
   2. 将约50个球体收集到1.5mL管中，用P200μL移液器的切割尖端;让它们通过重力沉降到管的底部，然后丢弃上清液。
   3. 用500μL4%PFA固定球体1小时，室温。
   4. 使用带有磁力搅拌器的热板将2%的诺贝尔琼脂溶液在PBS中煮沸3-5分钟，以完全溶解琼脂糖粉末并冷却至约60°C。
   5. 用P1000移液器除去PFA，用500μLPBS洗涤球体，并让它们沉淀。丢弃上清液。
   6. 小心地将600μL琼脂糖溶液移液到带有球体的1.5mL管中，并立即将管放入具有177×g水平转子的离心机中2分钟。
   7. 在琼脂糖溶液的中间加入一根短绳，以轻松从管中取出插头。
   8. 将琼脂糖塞固化在冰上或4°C。 将500μLPBS加入1.5mL管中，以避免从沉淀中干燥。
      注意:样品已准备好进行后续脱水，石蜡包埋，切片，转移到显微镜载玻片上和IHC染色（由Sophistolab进行）。
2. 图像采集和处理
   1. 使用立体显微镜采集球体切片的图像。
   2. 将每个示例的三个图像保存为.jpg文件。
   3. 打开 ImageJ 软件。打开 JPEG 图像，单击"文件"，然后单击"打开"。
   4. 在"图像"选项中选择"颜色"和"颜色反卷积"。
   5. 在"颜色反卷积 1.7"窗口中选择 H DAB 矢量，将显示三个图像。
      注:这三幅图像分别为:颜色1仅代表苏木精染色（蓝色/紫色），颜色2仅代表DAB染色（棕色）。使用两次染色进行图像分析时不需要颜色 3。
   6. 选择" 颜色 1" 窗口并设置"阈值:转到 图像|调整 并单击 阈值。将出现 "阈值 "窗口。
   7. 将最小阈值设置为零，并调整最大阈值以删除背景信号，而不会影响真实信号。单击"应用"。
      1. 面积测量
         1. 单击分析，选择设置测量。选择面积、平均灰度值以及最小和最大灰度值，然后单击确定进行确认。
         2. 使用" 分析 "选项测量原子核的大小，然后选择" 测量"。
            注:" 结果 "窗口提供图像的名称（标签）、图像的大小（面积）、IHC 图像的平均像素强度（平均值）以及最小和最大灰度值（最小值、最大值）。使用平均值进行计算。
         3. 对"颜色 2"（如果有双重染色，则为"颜色 3"）窗口重复步骤4.2.6-4.7.1.2。
      2. 细胞定量
         1. 单击" 处理"，选择" 二进制" 选项，然后选择" 分水岭" 以分隔单元格。
         2. 转到 "分析 "，然后单击" 分析粒子"。在 "分析粒子" 弹出窗口中，设置单元格的大小以排除非特异性粒子。接下来，在 "显示 "选项上，单击下拉框，然后选择 "大纲"。然后，单击 确定。
         3. 对颜色2（如果有双重染色，则为颜色3）窗口重复步骤4.2.6-4.2.2.7和细胞定量步骤（第4.2.7.2节）。
            注意:现在将出现三个窗口:1）摘要结果（计数的单元格数，总面积，平均大小，面积和平均值的百分比），2）结果（分别对应于计数的单元格）和3）绘图窗口（计数单元格的描绘图像）。

5. 球体中的活/死染色

1. 在1.5mL管中制备4mM的CALCEIN AM在DMSO中（将活细胞染成绿色）和在DMSO中制备2mM的乙锭同源二聚体（将死细胞染成红色）的储备溶液。
2. 计算在EBM-2中以1:50稀释的钙绿素AM和锭均聚二聚体混合物中加入10μL/孔所需的溶液量。
3. 将染色混合物加入球体中，并将板置于标准组织培养条件下的培养箱中30-60分钟。
4. 使用荧光体视显微镜获取照片（40倍）。

6. 球体蛋白和RNA分离

1. 以每种细胞类型3.4×10⁵ 个细胞/ mL制备细胞悬浮液，以1:1的比例混合，并使用P20移液器以15μL滴剂的形式在10cm培养皿的盖子上接种细胞混合物。倒置盖子并将其置于标准组织培养条件下的培养箱中96小时。
2. 使用 5-6 mL PBS 使用 5 mL 无菌聚苯乙烯移液器将球体收集到 15 mL 圆底聚苯乙烯管中。
   注意:也可以使用 15 mL 锥形管。
3. 将球体悬浮液以250×g离心5分钟，然后小心地吸出上清液。
4. 加入500μL胰蛋白酶（100%），并使用P1000移液器上下移液30秒以分解球状体，实现细胞悬浮液。
5. 用10%食品接触物质培养基中和胰蛋白酶，以250×g离心管5分钟，并吸出上清液。
6. 根据制造商的协议（用于无DNARNA分离的特定试剂盒），使用300μLRNA裂解缓冲液裂解细胞沉淀。
   注意:裂解缓冲液也可以直接加入到完整的球体中（不需要胰蛋白酶步骤）以提取RNA。向沉淀的球体中加入300μL裂解缓冲液，将试管置于冰中，并使用P200移液器研磨10次。随后，如上所述分离RNA。如果由于基质干扰导致RNA回收率低，则可能需要球体解离。
7. 或者，使用70μL裂解缓冲液进行蛋白质分离。通过超声处理匀浆2-4秒，并使用BCA检测试剂盒根据制造商的方案确定蛋白质浓度。
   注意:对于蛋白质分离，可以直接在裂解缓冲液中裂解沉淀的球体，然后进行超声处理。使用25μg总蛋白进行蛋白质印迹。

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结果

需要使用上皮和内皮共培养物的球状体模型来密切模拟乳腺肿瘤的 体内 条件以进行 体外 实验。 图1 中的方案描述了与乳腺癌上皮细胞和血管或淋巴内皮细胞形成球状体的方案（图1）。将每种细胞类型分别接种在3.5cm的圆形培养皿中，并用生长刺激剂/抑制剂处理或使用脂质聚胺转染寡核苷酸。上皮细胞或内皮细胞的汇合单层在胰蛋白酶?...

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讨论

与2D细胞培养相比，革命性的3D球体培养技术是重建器官微环境，细胞间相互作用和 体外药物反应的更好，更强大的工具。这是描述用于乳腺癌研究的多细胞（上皮和内皮）细胞系中球状体形成的第一个方案。该协议可确保球体的球体3D生长长达5天，并且可以在石蜡包埋，切片和组织学染色后检查球体。有趣的是，球体内的细胞元件仍然表达促进细胞生长的受体，并对增殖和凋亡刺激有反?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes	Corning	CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile	Falcon	357543
Adobe Photoshop			Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	17783
CD31 (cluster of differentiation 31)	Cell Marque	131M-95	monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	Invitrogen	C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)	DBS	Mob189-05	monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope	Olympus Life Science		Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3	Cell Signaling	9661L	polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)	Roche	11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent	Beckman Coulter	844 80 11	Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter	Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar	BD Difco	BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo)	Lonza	CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma-Aldrich	D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2	Lonza	190860
Ethidium homodimer	Sigma-Aldrich	46043
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)	Thermo Fisher Scientific	SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA	Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175053
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Lonza	CC-2517
ImageJ	National Institute of Health, USA		Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit)
Ki67	Cell Marque	275R-16	monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope	Leica Microsystems	M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome		149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Gibco	S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line	Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich		Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate	Thermo Fisher Scientific	174925
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Protein Lysis Buffer	Cell Signaling, Danvers, USA	9803
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055
RNA Lysis Buffer	Zymo Research	R1060-1-100	Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge	Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL	Falcon	352003
Sonicator	Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader	Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75	TPP	90076
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924