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요약

유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.

초록

유방암은 여성의 사망의 주요 원인입니다. 유방암 세포의 성장과 후속 전이의 성장은 진행을위한 핵심 요소입니다. 유방암 성장 촉진에 관여하는 기전은 MCF-7 세포와 같은 유방암 세포의 단일 배양을 사용하여 집중적으로 연구되었지만 종양 성장에 밀접하게 관여하는 혈관 및 림프 내피 세포와 같은 다른 세포 유형의 기여는 깊이 조사되지 않았습니다. 세포 세포 상호 작용은 종양 성장 및 진행에 있는 중요한 역할을 합니다. 신경전증, 또는 혈관의 발달은 종양 성장에 필수적이지만 림프 계는 암 세포 이동 및 후속 전이를위한 포털 역할을합니다. 최근 연구는 혈관 및 림프 내피 세포가 암세포 성장에 크게 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공합니다. 이러한 관측은 생체 내 유방암 성장 과정을 보다 현실적으로 반영하는 체외 모델 개발의 필요성을 암시한다. 또한, 동물 연구의 제한은 관련된 메커니즘을 더 잘 해명하기 위해 전 생체 모델의 개발을 필요로한다.

이 문서는 유방암 세포 (에스트로겐 수용체 양성 MCF-7 세포) 및 혈관 및 /또는 림프 내피 세포로 구성된 유방암 스페로이드의 발달을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 가지 접근 법, 매달려 드롭 (금 본위제 및 저렴한) 및 96 웰 U-바닥 플레이트 (비싼)를 사용하여 듀얼 셀 스페로이드를 만드는 상세한 단계별 접근 방식을 설명합니다. 형성된 스페로이드를 섬세하게 집어 들고 미세한 크기 조정및 죽은 세포 염색을 사용하여 생존 가능성을 평가하는 방법에 대한 심층 지침이 제공됩니다. 더욱이, 스페로이드의 성장 패턴을 차별화하기 위해 성장특이적 항체로 단면화 및 염색을 위한 스페로이드를 고치는 절차가 묘사된다. 또한, 세포분석용 RNA를 추출하는 방법 및 전염된 세포와 함께 스페로이드를 준비하기 위한 세부 사항이 제공된다. 결론적으로, 이 문서는 유방암 연구를 위한 다세포 스페로이드를 준비하기 위한 심층적인 지침을 제공합니다.

서문

실험을 위해 동물을 사용하는 것은 한계가 있습니다. 동물 연구는 인간에 있는 질병 진행을 정확하게 모방할 수 없고, 동물과 인간은 병원체에 동일 반응이 없습니다. 또한, 동물의 고통과 윤리적 문제에 대한 우려로 인한 동물 실험 제한1,2 점점 더 제약 연구 프로그램. In vitro 동물의 사용을 우회하기 위해 널리 개발된 시스템; 더욱이, 인간 세포의 사용은 in vitro 병리학 및 치료 조사에 더 관련성이 있는 모델. 종래의 단층(2D) 세포 배양은 인간 조직을 어느 정도 모방하기 때문에 널리 사용된다. 그러나, 2D 단배양은 인간 장기를 모방하지 못하며, 2D 단배양은 원래 장기의 복잡한 미세 환경을 시뮬레이션할 수 없으며 in vivo 상황3,4,5,6. 추가적으로, 단층 세포 배양에서, 약 처리는 쉽게 파괴/모든 세포를 손상할 수 있었습니다. 중요한 것은, 다층 3차원(3D) 세포 배양으로 전환하여 이러한 한계 중 일부를 극복할 수 있다는 것입니다.7,8. 실제로, 3D 배양 모델은 1차 조직에서 세포의 세포 구조, 레이아웃 및 기능을 더 잘 반영하는 것으로 나타났습니다. 이러한 3D 배양은 기능성 기관과 유사한 다양한 세포주를 사용하여 형성될 수 있다. 실제로 3D 문화권에는 두 가지 모델이 있습니다. 한 모델은 클러스터를 형성하고 구체(스캐폴드 프리 모델)로 재구성하는 집계된 셀의 스페로이드를 생성합니다. 두 번째는 더 복잡한 구조를 가지고 장기 의 소형 버전으로 간주되는 다중 장기 특정 세포의 조합으로 구성된 오르가노이드를 산출합니다.9,10. 이로 인해 3D 배양 시스템은 많은 생물학적 및 임상 응용 분야의 혁신적인 기술을 나타냅니다. 따라서, 스페로이드와 오르가노이드는 재생 의학, 약물 선별 및 독성 연구와 관련된 질병 모델링 및 연구에 대한 수많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다.6,11,12,13,14,15. 3D 기술에서 파생된 발암 성 스페로이드는 관련 세포 유형의 형태와 표현형을 재현하여 모방합니다. in vivo 종양 미세 환경, 및 종양 발달 중에 작동하는 세포 통신 및 신호 경로 모델16,17,18. 또한, 암 생물학 이해를 향상시키기 위하여는, 종양 스페로이드/organoids는 또한 잠재적인 환자 특정 항암 치료 (개인화)를 확인하고 그것의 효험, 독성 및 장기 효력을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다19,20,21,22. 스페로이드는 세포 및 3차원 조직 아키텍처를 보존하는 능력, 모방 능력 으로 인해 병리학, 질병 모델링 및 약물 검진을 조사할 수 있는 두드러진 기회를 열었습니다. in vivo 상황 및 세포 세포 상호 작용. 그러나 혈관/전신 성분의 부족, 기능성 면역 또는 신경계 와 같은 이 시스템의 한계를 알고 있어야 하며, 이 시스템은 동물 모델에 비해 환원주의적 접근법을 나타낸다. 실제로, 동물 모델과는 달리, 3D 구조는 인체 내의 생물학의 근사치만을 제공합니다. 3D 방법의 한계를 이해하면 연구원들이 더 큰 규모의 장기를 더 잘 나타내는 스페로이드를 생산하기 위한 보다 세련되고 유효한 프로세스를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다.23,24,25.

암은 전 세계적으로 사망의 주요 원인이며, 유방암은 여자26,27,28에서가장 흔한 암이다. 유방암의 복잡한 미세 환경을 모방하기 위하여는, 유방암 스페로이드는 유방 종양, 즉 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및/또는 면역 세포에서 중요한 역할을 하는 세포를 사용하여 배양되어야 합니다. 더욱이, 유방암을 대표하는 스페로이드의 경우, 여성 호르몬 수용체(에스트로겐/황체호르몬 수용체)의 발현, 환자 종양 조직 상태를 보존하는 능력, 치료에 대한 반응을 모방하는 능력도 고려해야 한다. 연구에 따르면 3D 공동배양 시스템은 생체 내의1차 조직과 유사한 세포 조직을 가지고 있으며, 자극에 실시간으로 반응할 수 있는 능력을 가지며, 기능성 안드로겐수용체(29,30,31,32)를갖는다. 따라서, 유사한 접근은 시험관내유방 종양을 모방하기 위하여 유용할 수 있었습니다. 현재 프로토콜의 목적은 유방암 스페로이드를 생성하는 새로운 방법을 확립하는 것입니다. 이 방법은 에스트로겐 수용체 양성 MCF-7 세포(상피 세포의 불멸의 인간 세포주) 및 혈관 내피 세포(HUVECs) 또는 림프 내피 세포(HMVEC-DNeo)를 활용하여 종양 내의 이들 세포 간의 상호 작용을 모방하거나 밀접하게 반영하는 모델을 생성한다. MCF-7 (에스트로겐 반응성) 및 내피 세포는 본 연구에서 스페로이드를 개발하는 데 사용되었지만, 유방 종양 질량의 ~80 %를 나타내는 섬유 아세포와 같은 다른 세포는 향후 유방 종양을 더 잘 표현하고 모방하기 위해 결합 될 수 있습니다.

같은 스페로이드를 형성하는 몇 가지 방법이 있습니다: 1) 중력을 사용하는 걸이 액적 방법(33,34; 2) 외부자석(35)및 3) 저부착 플레이트(36,37)에서세포를 파종하여 수행되는 스페로이드 마이크로플레이트 방법을 사용하는 자기 적발 방법. 하나의 세포 유형만을 사용하는 기존 방법에 기초하여, 본 프로토콜은 생체 내 유방암 종양의 성장 조건을 더 잘 모방하기 위해 상피 및 내피 세포를 사용하여 최적화되어 있으며, 생체 내유방암 종양의 성장 조건을 더 잘 모방하였다38,39,40,41. 이 방법은 저렴한 비용으로 최소한의 장비 요구 사항으로 실험실에서 쉽게 달성 할 수 있습니다. 실험실의 필요/목표에 따라, 다른 접근 은 스페로이드를 형성 하 고 이러한 스페로이드에서 관련 된 세포 물질을 얻기 위해 사용 되었다. 이러한 맥락에서, DNA, RNA 또는 단백질 분석을 위해, 3D 스페로이드는 매달려 있는 낙하 방법과 함께 내피 및 상피 세포를 공동 배양하여 생성된다. 그러나, 기능적 연구를 위해, 예를 들어, 짧은 간섭 후 세포 성장을 모니터링 (siRNA) transfection 및/또는 호르몬 치료, 스페로이드는 U-바닥 플레이트를 사용하여 생성된다.

이 기술 프로토콜의 목적은 1) 유방암 다세포 형 스페로이드를 형성하는 1) 형성에 대한 상세한 단계별 설명을 제공하는 것입니다, 2) 조직학적 염색을위한 샘플을 준비, 및 3) RNA의 추출을위한 세포의 수집, DNA, 및 단백질. 저렴한 매달려 드롭 방법과 더 비싼 U-바닥 플레이트모두 스페로이드를 형성하는 데 사용됩니다. 여기서, 세포 증식, 세포 세포 증식, 세포 멸폐, 및 스페로이드 내내피 세포의 분포를 평가하기 위해 마커로 단면화 및 후속 면역스테인링을 위한 스페로이드를 준비하기 위한 프로토콜이 제공된다. 또한 이 프로토콜은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 조직학적 데이터의 전체 단계별 분석을 보여 주습니다. 생물학적 데이터의 해석은 실험의 유형과 사용되는 항체에 따라 다릅니다. 고정 스페로이드의 단면 과 섹션의 후속 염색은 일상적인 병리학 실험실에 의해 수행되었다 (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

프로토콜

1. 세포 배양

참고: 멸균 조건에서 세포 처리를 수행합니다.

  1. 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVECs) 하위 배양
    1. 콜라겐(5 μg/cm2)으로75cm2 플라스크를 실내 온도(RT) 또는 37°C에서 2-3h로 하룻밤(ON)하고 물로 헹구고 플라스크가 건조하도록 허용합니다.
    2. 글루타민(1x = 2mM), 항생제 항진화 용액(AA; 100 μg/mL 의 연쇄상 구균, 페니실린 100 μg/mL 및 0.025 μg/mL 의 amphotericin B), LSGS (2% v/v FCS, 하이드로코르티손 1 μg/mL, 인간 표피 성장 인자 10 ng/mL, 3 ng/mL 의 인간 표피/mL 표준 조직 배양 조건(37°C, 5% CO2)하에서헤파린의 10 μg/mL 및 10% FCS(태아 송아지 혈청). 세포가 70%-80%에 도달할 때까지 매2일마다 배지를 변경합니다.
    3. HBSS (Ca2 + 및 Mg 2+제외) 5 mL로 하위 컨물 재배를 세척하고 트립신 3 mL (0.25 % HBSS에서 희석 (Ca2 + 및 Mg 2+제외)를 추가하십시오.
      참고: HBSS는 PBS로 교체할 수도 있습니다.
    4. 세포를 37°C에서 2분 동안 배양(셀이 분리되고 반올림하는지 현미경으로 확인) FCS 배지(DMEM-F12 또는 EBM-2, 10% FCS)의 6mL을 추가하여 분리 반응을 중지한다.
    5. RT에서 5 분 동안 250 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.
    6. 75cm2 플라스크 또는 배양 접시에 성장 중간 및 종자에서 세포를 중단합니다.
  2. 미시간 암 재단-7 (MCF-7, 인간 유방 선암 세포) 하위 배양
    1. 인간 유방암 세포주를 성장시키는 75cm2 플라스크에서 성장 배지(DMEM/F12 배지는 상업적 글루타민(1x),항생제 항진균용액(AA; 연쇄상 구균의 100 μg/mL, 페니실린 100 μg/mL 및 amphotericin B의 0.025 μg/mL), 표준 조직 배양 조건하에서 10% FCS(37°C, 5%CO2). 매 2-3 일 마다 매체를 변경합니다.
    2. HBSS(Ca 2+ 및 Mg2+제외) 5mL로 하위 세포 배양(70%-80%의 합류)을 세척하고 3mL(Ca2+ 및 Mg 2+제외)에서 3mL(Ca 2+ 및 Mg2+제외)을 37°C에서 5분 동안 추가합니다(셀이 분리되어 있는지 현미경으로 확인).
      참고: HBSS는 PBS로 교체할 수도 있습니다.
    3. 10% FCS 배지의 8mL를 추가하여 분리 반응을 멈추고, RT에서 5분 동안 250 x g의 원심분리기를 제거하고 상체를 폐기하십시오.
    4. 75cm2 플라스크 또는 문화 접시에 성장 중간 및 접시에 펠릿을 중단합니다.

2. 스페로이드 형성

  1. 플레이트 5 x 105 셀/mL(HUVEC 및 MCF-7)을 3.5cm 원형 접시및 배양시 48h.
  2. 도금 된 세포를 24 시간 또는 원하는대로 치료하거나 변형하십시오.
  3. 96웰 U-bottom 플레이트에서 수행되는 선택적 단계: 1mL의 HBSS(Ca2+와 Mg2+)및 스테인 후벡을 사용하여 청색 염료(0.5 μg/mL) 및 MCF-7 셀을 사용하여 각각의 성장 배지에 희석된 37°C및 CO쿠바30분으로 37°C및 50%의 COcubato에 배치하였다.
  4. HBSS 1mL(Ca2+ 및 Mg2+제외)으로 셀을 세척하고, P1000 파이펫을 사용하여 각 라운드 접시에 효소 분리 시약 1mL(HUVEC의 경우 0.25%, MCF-7의 경우 0.5% 트립신)을 추가한 다음, 세포가 분리될 때까지 2-5분 동안 인큐베이트합니다.
  5. 각 셀 타입을 5mL 라운드-하부 폴리스티렌 튜브에서 따로 수집하고 P1000 파이펫을 사용하여 1mL의 1mL를 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 5 분 동안 250 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
  6. 조심스럽게 슈퍼나탄을 흡인시키고 스테로이드없는 배지의 1 mL에서 세포를 일시 중단 (EBM-2, 글루타민, 항생제 항마이코틱, 0.4 % FCS sf (숯 제거)).
    참고: 스테로이드 없는 매체는 정상적인 성장 매체로 대체될 수 있습니다.
  7. 각 셀 서스펜션의 100 μL을 Diluent II의 10mL로 희석하여 총 세포 수를 결정하고 치료 배지의 양을 계산합니다(EBM-2, 글루타민, 항생제 항마이코틱, 0.4% FCS sf, 차량/치료) 셀 현탁액5 x 103 세포/mL 또는 3.5m/10 xL 의 셀 현탁액을 획득하는 데 필요한 세포 현탁액을 갖는다.
    1. 셀 수
      1. 셀 카운터 바이알에 Diluent II 용액을 사용하여 기능 및 시작 버튼(설정 S3)을 눌러 기계를 켜고 플러시합니다.
      2. S4 설정 및 시작 을 눌러 신선한 Diluent II 솔루션으로 공백을 측정합니다.
      3. 딜루엔트 II 용액의 10mL에서 셀 서스펜션 100 μL로 신경환 유리병을 변경하고 샘플을 측정합니다: 설정 S4 및 프레스 스타트.
      4. 디지털 디스플레이의 mL당 셀 수를 기록합니다.
        참고: 세포 계수는 다른 수동 또는 자동 시스템을 사용하여 수행 될 수있다 : 혈변 세포계 격자 라인, 광 산란 세포 계수 기술, 전기 임피던스, 셀 염색을 사용하여 이미징 기반 시스템, 예를 들어, trypan 블루.
    2. 96웰 U-하단 플레이트
      1. 각 셀 서스펜션(5 x 103 셀/mL)의 5mL를 준비하고 이를 혼합하여 1:1의 비율로 10mL의 최종 부피를 얻습니다.
      2. 수동 반복 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션의 100 μL을 96웰 U-바닥 플레이트의 각 웰에 피펫을 피펫합니다.
      3. 표준 조직 배양 조건하에서 인큐베이터에 플레이트를 넣고 48 시간 후에 스페로이드 형성을 확인하십시오.
      4. 선택적 단계: 형광 스테레오 현미경을 사용하여 스페로이드(40x)의 사진을 찍습니다.
        참고: 이 방법은 48h(면적 1-2 픽셀2)후에 96개의 스페로이드(1개의 스페로이드/웰)를 생성하며, 일반적으로 성장 연구에 사용됩니다.
    3. 매달려 드롭
      1. 셀 서스펜션(3.4 x 105 셀/mL)을 1:1 비율로 혼합하여 최종 부피를 2mL로 얻습니다.
      2. P20 파이펫을 사용하여 10cm 페트리 접시의 반전 뚜껑에 15 μL 방울의 형태로 세포 혼합물을 시드한다.
      3. 뚜껑을 방울로 반전시키고 접시 바닥에 5mL의 베이스 미디엄(EBM-2)을 추가하여 방울의 증발을 피하십시오.
        참고: 이 메서드는 48시간 후에 하나의 스페로이드/드롭을 생성합니다. 뚜껑을 전환하는 동안 병합되지 않도록 방울이 서로 충분히 떨어져 있는지 확인합니다. 필요한 경우 10cm 이상의 페트리 요리를 사용하십시오.

3. 스페로이드 성장 연구

  1. 96웰 U-바닥 플레이트에 HUVEC 및 MCF-7 세포 혼합물(5 x 102 셀/웰)의 플레이트 100 μL을 플레이트하고 인큐베이터에 배치합니다.
  2. 도금 후 48 시간, 반전 된 현미경 (밝은 필드)와 스페로이드 형성을 확인합니다. 96h 의 문화에서 사진 (치료 당 적어도 6 장의 사진, 40x)을 촬영하십시오.
  3. 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 사진을 열고 이미지를 300 픽셀 /인치로 처리하고 이미지를 티프 파일로 저장합니다.
  4. ImageJ 소프트웨어를 다운로드하여 엽니다. 파일 옵션을 클릭하고 열립니다.
  5. 관심 영역을 균일한 방식으로 포화 된 검은 영역으로 변환하여 이진 이미지 (흑백)를 갖습니다. 이에 대해 이미지 옵션을 선택하고 비트 | 유형을 선택합니다. 이제 이미지는 흑백입니다.
  6. 프리핸드 선택 도구를 사용하여 스페로이드의 테두리를 그립니다.
  7. 관심 영역을 계산하고 개체 또는 전경 픽셀을 배경 픽셀과 분리하려면 임계값 함수를 사용합니다: 이미지 옵션을 선택하고 조정을 선택하고 임계값을 클릭합니다.
  8. 이제 임계값 팝업 창이 열립니다. 위쪽 막대는 최소 임계값값을 나타냅니다: 값을 0으로 설정합니다. 아래쪽 막대는 최대 임계값값을 나타냅니다: 관심 영역이 완전히 빨갛게 될 때까지 막대를 이동합니다.
    참고: 색상이 빨간색이 아닌 경우 임계값 창에서 빨간색을 선택합니다.
  9. | 분석으로 이동 측정값을 설정하고 영역 및 둘레를선택합니다.
  10. 관심 영역을 측정하려면 분석 옵션을 선택하고 파티클 분석 도구를 사용합니다. 파티클 분석 창에서 측정할 크기를 설정합니다(스페로이드 크기에 따라 0.00003-무한대 또는 3-무한대)를 설정하여 요약 및 표시 결과를선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
  11. 결과는 차트에 표시됩니다. 측정값을 스프레드시트에 복사하여 데이터를 분석합니다.
    참고: 영역은 총 픽셀 수로 계산됩니다. 계산을 위해 총 영역을 사용합니다.

4. 스페로이드 면역히스토화학 연구

  1. 샘플 준비
    1. HUVEC 및 MCF-7(5 x 103 셀/웰)의 세포 혼합물을 96h의 HUVEC 성장 배지에서 96웰 U-바닥 플레이트에 플레이트.
    2. P200 μL 파이펫의 절단 팁으로 약 50개의 스페로이드를 1.5mL 튜브로 수집합니다. 중력으로 튜브 의 바닥에 정착 한 다음 상체를 폐기 할 수 있습니다.
    3. 1 시간, RT에 대한 4 % PFA의 500 μL로 스페로이드를 수정합니다.
    4. PBS에서 2% 노벨 아가용용을 3-5분 간 자기 교반기가 있는 핫 플레이트를 사용하여 아가로즈 분말을 완전히 녹여 60°C로 식힙니다.
    5. P1000 파이펫으로 PFA를 제거하고, PBS의 500 μL로 스페로이드를 세척하고, 퇴적물을 허용합니다. 상부체를 폐기합니다.
    6. 조심스럽게 스페로이드와 1.5 mL 튜브에 아가로즈 용액의 파이펫 600 μL과 2 분 동안 177 x g의 수평 로터와 원심 분리기에 튜브를 배치합니다.
    7. 아가로즈 솔루션 중간에 짧은 문자열을 추가하여 튜브에서 플러그를 쉽게 제거합니다.
    8. 얼음이나 4°C에서 아가로즈 플러그를 단단히 고정시하십시오. 펠릿에서 건조하지 않도록 1.5mL 튜브에 PBS 500 μL을 추가합니다.
      참고: 샘플은 후속 탈수, 파라핀 포함, 단면, 현미경 슬라이드로의 전송 및 IHC 염색(Sophistolab에 의해 수행됨)에 대비합니다.
  2. 이미지 수집 및 처리
    1. 스테레오 현미경을 사용하여 스페로이드 섹션의 이미지를 습득.
    2. 각 샘플에 대해 세 개의 이미지를 .jpg 파일로 저장합니다.
    3. ImageJ 소프트웨어를 엽니다. JPEG 이미지를 열고 파일을 클릭한 다음 열면.
    4. 이미지 옵션에서 색상 및 색상 디폰볼루션을 선택합니다.
    5. 색상 Deconvolution 1.7 창에서 H DAB 벡터를 선택하고 세 이미지가 나타납니다.
      참고: 세 가지 이미지는 색상 1은 헤마톡실린 염색(파란색/보라색)만 나타내며 색상 2는 DAB 염색(갈색)만 나타냅니다. 두 개의 얼룩이 있는 이미지 분석에 색상 3이 필요하지 않습니다.
    6. 색상 1 창을 선택하고 임계값을 설정합니다: 이미지 | 조정 하고 임계값을 클릭합니다. 임계값 창이 나타납니다.
    7. 최소 임계값을 0으로 설정하고 최대 임계값값을 조정하여 실제 신호에 영향을 주지 않고 배경 신호를 제거합니다. 적용을 클릭합니다.
      1. 영역 측정
        1. 분석을클릭하고 측정 설정을 선택합니다. 영역, 평균 회색 값및 최소 및 최대 회색 값을 선택하고 확인을 클릭합니다.
        2. 분석 옵션을 사용하여 핵크기를 측정한 다음 측정값을 선택합니다.
          참고: 결과 창은 이미지(레이블), 이미지 크기(영역), IHC 이미지의 평균 픽셀 강도(평균) 및 최소 및 최대 회색 값(최소 및 최대 값)의 이름을 제공합니다. 계산에 평균 값을 사용합니다.
        3. 색상 2의 경우 4.2.6-4.7.1.2 단계를 반복하고 이중 염색이 있는 경우 색상 3을 반복합니다.
      2. 세포 정량화
        1. 프로세스를클릭하고 옵션 바이너리를 선택하고 분수령을 선택하여 셀을 분리합니다.
        2. 분석하여 파티클 분석을클릭합니다. 파티클 분석 팝업 창에서 셀 크기를 설정하여 특이하지 않은 파티클을 제외합니다. 다음, 쇼 옵션에 드롭 다운 상자를 클릭 하 고 개요를 선택 합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
        3. 색상 2 (및 이중 염색이있는 경우 색상 3)에 대한 4.2.6-4.2.7 및 셀 정량화 단계 (섹션 4.2.7.2)를 반복합니다.
          참고: 이제 세 개의 창이 나타납니다: 1) 요약 결과 (셀 수 계산, 총 면적, 평균 크기, 면적 및 평균의 %), 2) 결과 (계산되는 셀에 각각), 및 3) 그리기 창 (계산된 셀의 묘사 된 이미지).

5. 스페로이드에 라이브 / 죽은 얼룩

  1. DMSO에서 Calcein AM의 4m 스톡 솔루션을 준비 (얼룩 라이브 세포 녹색) 및 1.5 mL 튜브에서 DMSO (얼룩 죽은 세포 빨간색) 에티듐 호모이머의 2 mM.
  2. EBM-2에서 1:50을 희석한 칼신 AM과 에티듐 호모디머의 혼합물의 10 μL/웰을 추가하는 데 필요한 용액의 양을 계산합니다.
  3. 스테인링 혼합물을 스페로이드에 넣고 30-60분 동안 표준 조직 배양 조건하에서 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.
  4. 형광 스테레오 현미경을 사용하여 사진 (40x)을 획득하십시오.

6. 스페로이드의 단백질과 RNA 절연

  1. 세포 유형당 세포 현탁액을 3.4 x 105 셀/mL로 준비하고, 1:1의 비율로 혼합하고, 10cm 페트리 접시의 뚜껑에 15 μL 방울의 형태로 P20 파이펫을 사용하여 세포 혼합물을 시드한다. 뚜껑을 반전시키고 96h에 대한 표준 조직 배양 조건하에서 인큐베이터에 놓습니다.
  2. PBS의 5-6 mL을 사용하여 5mL 멸균 폴리스티렌 파이펫을 사용하여 15mL 라운드 바닥 폴리스티렌 튜브에서 스페로이드를 수집합니다.
    참고: 15mL 원문 튜브도 사용할 수 있습니다.
  3. 스페로이드 서스펜션을 250 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 수퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다.
  4. 트립신(100%)과 파이펫 을 30s에 대고 피펫을 위아래로 추가하여 스페로이드를 분해하여 셀 서스펜션을 달성합니다.
  5. 트립신을 10% FCS 배지로 중화하고, 튜브를 250 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 수퍼나티를 흡인시합니다.
  6. 제조업체의 프로토콜 (DNA없는 RNA 절연을위한 특정 키트)에 따르면, RNA 용해 버퍼300 μL을 사용하여 세포 펠릿을 용해하십시오.
    참고: 리시스 버퍼는 RNA를 추출하기 위해 그대로 스페로이드(트립신 단계가 필요하지 없음)에 직접 첨가할 수 있습니다. 펠리시스 버퍼300 μL을 펠릿 스페로이드에 넣고 튜브를 얼음에 넣고 P200 파이펫을 사용하여 10회 세리라울 수 있습니다. 이어서, RNA를 위와 같이 분리한다. 매트릭스 간섭으로 인해 RNA 회수가 낮은 경우 스페로이드 해리가 필요할 수 있다.
  7. 또는, 단백질 절연을 위해 Lysis 버퍼의 70 μL을 사용하십시오. 초음파 처리에 의해 2-4 s에 대해 균질화하고 BCA 분석 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 단백질 농도를 결정합니다.
    참고: 단백질 절연의 경우, 펠렛 스페로이드는 용해 버퍼에서 직접 용해될 수 있으며 초음파 처리가 가능합니다. 총 단백질 25μg을 사용하여 서부 블롯을 수행하십시오.

결과

상피 및 내피 공동 배양을 사용하는 스페로이드 모델은 체외 실험을 위해 유방 종양의 생체 조건에서 밀접하게 모방하는 데 필요합니다. 도 1의 계획은 유방암 상피 세포 및 혈관 또는 림프 내피 세포를 가진 스페로이드를 형성하는 프로토콜을 묘사한다(도1). 각 세포 유형은 3.5cm 원형 접시에 별도로 시드되고 성장 자극기/억제제로 처리되...

토론

2D 세포 배양에 비해 혁신적인 3D 스페로이드 배양 기술은 기관의 미세 환경, 세포 세포 상호 작용 및 체외에서약물 반응을 재구성하는 더 강력하고 강력한 도구입니다. 이것은 유방암 연구를 위한 다세포 (상피 및 내피) 세포주에서 스페로이드의 대형을 기술하는 첫번째 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 최대 5일 동안 스페로이드의 스페로이드 3D 성장을 보장하고, 파라핀 포함, 단면 및 조직?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 암 연구 재단 / 스위스 암 리그 보조금 KFS-4125-02-2017RKD 및 국립 보건 연구소에 의해 지원되었다 EKJ에.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishesCorningCLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture DishFalcon353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, SterileFalcon357543
Adobe PhotoshopVersion: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955
Calcein-AMSigma-Aldrich17783
CD31 (cluster of differentiation 31)Cell Marque131M-95monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)InvitrogenC7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)DBSMob189-05monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted MicroscopeOlympus Life ScienceOlympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3Cell Signaling9661Lpolyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail)Roche11 179 179 001
Coulter ISOTON II DiluentBeckman Coulter844 80 11Diluent II
Coulter Z1, Cell CounterCoulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble AgarBD DifcoBD 214220
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigma-AldrichD6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2Lonza190860
Ethidium homodimerSigma-Aldrich46043
Fetal Calf Serum (FCS)Thermo Fisher ScientificSH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)Thermo Fisher ScientificSH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FALeica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol redGibco14175053
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial CellsLonzaCC-2517
ImageJNational Institute of Health, USAWayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67Cell Marque275R-16monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)GibcoS003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell lineClinic for Gynecology, University Hospital ZurichProvived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plateThermo Fisher Scientific174925
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1xGibco10010015
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Protein Lysis BufferCell Signaling, Danvers, USA9803
Quick-RNA Miniprep KitZymo ResearchR1055
RNA Lysis BufferZymo ResearchR1060-1-100Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R CentrifugeHettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLFalcon352003
SonicatorBandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate readerTecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75TPP90076
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT3924

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