JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية لإجراء فحص بصمة الالتصاق لتصوير أحداث التصاق أثناء التصاق سريع بالخلايا.

Abstract

التصاق المتداول ، الذي تسهله التفاعلات بوساطة selectin ، هو حركة ديناميكية وسلبية للغاية في تجنيد الكريات البيض إلى موقع الالتهاب. تحدث هذه الظاهرة في عدد الخلايا الجنوية بعد الشعيرات الدموية ، حيث يدفع تدفق الدم الكريات البيض في حركة متجددة على الخلايا البطانية. يتطلب المتداول المستقر توازنا دقيقا بين تكوين رابطة التصاق وانفصالها المدفوع ميكانيكيا ، مما يسمح للخلية بالبقاء ملتصقة بالسطح أثناء الدوران في اتجاه التدفق. وخلافا لعمليات الالتصاق الأخرى التي تحدث في بيئات ثابتة نسبيا، الالتصاق المتداول ديناميكية للغاية كما الخلايا المتداول السفر عبر الآلاف من ميكرون في عشرات ميكرون في الثانية الواحدة. وبالتالي، فإن أساليب علم الأحياء الميكانيكية التقليدية مثل المجهر قوة الجر غير مناسبة لقياس أحداث الالتصاق الفردية والقوى الجزيئية المرتبطة بها بسبب النطاق الزمني القصير والحساسية العالية المطلوبة. هنا، ونحن نصف لدينا أحدث تنفيذ قياس بصمة الالتصاق لتصوير P-selectin: PSGL-1 التفاعلات في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي. تستخدم هذه الطريقة الحبال مقياس التوتر المستندة إلى الحمض النووي لا رجعة فيه لإنتاج تاريخ دائم من أحداث الالتصاق الجزيئي في شكل مسارات مضان. يمكن تصوير هذه المسارات بطريقتين: (1) خياطة الآلاف من الصور المحدودة الحيود لإنتاج مجال رؤية كبير ، مما يتيح استخراج بصمة التصاق لكل خلية متجددة على آلاف الميكرونات في الطول ، (2) أداء DNA-PAINT لإعادة بناء صور فائقة الدقة للمسارات الفلورية داخل مجال صغير من الرؤية. في هذه الدراسة، تم استخدام فحص بصمة الالتصاق لدراسة خلايا HL-60 المتداول في ضغوط القص المختلفة. وبذلك، تمكنا من تصوير التوزيع المكاني ل P-selectin: تفاعل PSGL-1 واكتساب نظرة ثاقبة على قواهم الجزيئية من خلال كثافة الفلورسينس. وهكذا، توفر هذه الطريقة الأساس للتحقيق الكمي لمختلف التفاعلات بين الخلايا والسطح المشاركة في التصاق المتداول على المستوى الجزيئي.

Introduction

تصف سلسلة التصاق المتداول كيف ترتبط الخلايا المتداولة بحائط الأوعية الدموية ولفه على طوله1. يتم التوسط في المقام الأول المتداول السلبي من قبل selectins ، وهي فئة رئيسية من جزيئات الالتصاق الخلوي (CAMs)1. تحت تدفق القص من الدم، الكريات البيض التعبير عن P-selectin جليكبروتين ليغند-1 (PSGL-1) تشكل روابط عابرة للغاية مع P-selectin، والتي يمكن التعبير عنها على سطح الخلايا البطانية الملتهبة. هذه العملية حاسمة بالنسبة للخلايا البيض للهجرة إلى موقع الالتهاب2. وبالإضافة إلى ذلك، سان جيرمان-1 هو أيضا مستقبلات حساسة ميكانيكية قادرة على تحريك مرحلة الالتصاق الشركة اللاحقة من سلسلة التصاق المتداول عند مشاركتها مع P-selectin3.

الطفرات الوراثية التي تؤثر على وظيفة CAM يمكن أن تؤثر بشدة على الجهاز المناعي، كما هو الحال في المرض النادر لنقص التصاق الكريات البيض (LAD)، حيث يؤدي خلل جزيئات الالتصاق التي تتوسط المتداول إلى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة الشديد4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن الخلايا السرطانية المتداولة تهاجر بعد عملية المتداول مماثلة ، مما يؤدي إلى الانبثاث7،8. ومع ذلك ، لأن المتداول الخلية سريعة وديناميكية ، والأساليب التجريبية التقليدية الميكانيكية غير مناسبة لدراسة التفاعلات الجزيئية أثناء المتداول الخلية. في حين أن أساليب التلاعب أحادية الخلية وجزيء واحد مثل المجهر القوة الذرية وملاقط البصرية كانت قادرة على دراسة التفاعلات الجزيئية مثل التفاعل P-selectin تعتمد على القوة مع PSGL-1 على مستوى جزيء واحد9، فهي غير مناسبة للتحقيق في أحداث الالتصاق الحية أثناء المتداول الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن للتفاعل المميز في المختبر الإجابة مباشرة على السؤال حول الالتصاق الجزيئي في الجسم الحي. على سبيل المثال، ما هو نطاق التوتر الجزيئي ذي الصلة بيولوجيا عندما تعمل الخلايا في بيئتها الأصلية؟ وقد استولت الأساليب الحاسوبية مثل محاكاة ديناميات لاصقة10 أو بسيطة ثابتة الحالة11 بعض التفاصيل الجزيئية وكيف تؤثر على السلوك المتداول ولكن تعتمد اعتمادا كبيرا على دقة المعلمات والافتراضات النمذجة. ويمكن لتقنيات أخرى مثل الفحص المجهري لقوة الجر الكشف عن القوى أثناء هجرة الخلايا ولكنها لا توفر دقة مكانية كافية أو معلومات كمية عن التوتر الجزيئي. لا يمكن لأي من هذه التقنيات أن توفر ملاحظات تجريبية مباشرة للديناميكيات الزمنية والتوزيع المكاني وعدم التجانس في القوى الجزيئية ، والتي ترتبط مباشرة بوظيفة الخلية وسلوكها في بيئتها الأصلية.

لذلك ، فإن تنفيذ مستشعر القوة الجزيئية القادر على قياس التفاعلات بوساطة selectin بدقة أمر بالغ الأهمية لتحسين فهمنا للالتصاق المتداول. هنا، ونحن نصف بروتوكول لacesay12 بصمة الالتصاق حيث يتم تدحرجت الخرز المغلفة PSGL-1 على سطح تقديم ف selectin الحبال قياس التوتر الوظيفية (TGTs)13. هذه TGTs هي أجهزة استشعار قوة تعتمد على الحمض النووي لا رجعة فيها والتي تؤدي إلى تاريخ دائم من أحداث التمزق في شكل قراءات مضان. ويتحقق ذلك من خلال تمزق TGT (dsDNA) ومن ثم وضع العلامات اللاحقة لTGT الممزق (ssDNA) مع حبلا تكميلية وصفت الفلورسنت. إحدى المزايا الرئيسية لهذا النظام هي توافقه مع كل من التصوير محدود الحيود والتصوير فائق الدقة. يمكن ربط الخيط التكميلي المسمى بالفلورسنت إما بشكل دائم (>12 نقطة أساس) للتصوير المحدود الحيود أو ملزم بشكل عابر (7-9 bp) للتصوير فائق الدقة من خلال DNA PAINT. هذا هو نظام مثالي لدراسة التصاق المتداول كما تمزق TGTs أثناء المتداول النشط، ولكن يتم تحليل قراءات مضان بعد المتداول. كما توفر طريقتان للتصوير للمستخدم المزيد من الحرية للتحقيق في التصاق المتداول. عادة، التصوير محدود الحيود مفيد لاستخراج قوة التمزق الجزيئي من خلال كثافة الفلورسينس13، في حين أن التصوير فائق الدقة يسمح بالتحليل الكمي لكثافة المستقبلات. مع القدرة على التحقيق في هذه الخصائص من التصاق المتداول، وهذا النهج يوفر منصة واعدة لفهم آلية تنظيم القوة على الالتصاق الجزيئي للخلايا المتداول تحت تدفق القص.

Protocol

1. الوسم Oligonucleotide والتهجين

  1. تخفيض الروابط ثنائي كبريتيد البروتين G
    1. حل 10 ملغ من البروتين G (ProtG) في 1 مل من المياه فائقة البور.
      ملاحظة: يتم تعديل البروتين G هنا مع بقايا السيستين واحد في C-terminus وعلامة بولي هيستيدين N-terminus.
    2. تبادل المخزن المؤقت ≥20 ميكرولتر من ProtG (10 ملغم / مل) إلى 1x PBS (درجة الحموضة 7.2) مع عمود P6.
    3. قياس تركيز البروتين بعد تبادل العازلة.
      ملاحظة: تركيز نموذجي من 7-8 ملغم / مل.
    4. إعداد 120 mM تريس (2-carboxyethyl)فوسفين (TCEP) عن طريق حل 3 ملغ من TCEP إلى 90 ميكرولتر من 1x PBS (درجة الحموضة 7.2) تليها 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
      ملاحظة: يجب أن تكون TCEP معدة حديثا.
    5. أضف 4 ميكرولتر من 120 مللي متر من التسيب (480 نانومول) إلى 20 ميكرولتر من بروت جي (4-5 نانومول).
      ملاحظة: تهدف إلى نسبة الضرس من ~ 100:1 TCEP إلى البروتين.
    6. السماح لرد الفعل على المضي قدما لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    7. إزالة TCEP الزائدة من ProtG مخفضة مع عمود P6 (المخزن المؤقت تبادلها في برنامج تلفزيوني 1x، pH 7.2).
    8. قياس تركيز ProtG انخفاض مع الأشعة فوق البنفسجية / فيس الطيف وحفظ الأطياف.
      ملاحظة: تركيز نموذجي من 3.5-4.5 ملغم/ مل.
  2. رد فعل SSDNA المسمى أمين مع سولفو-SMCC
    1. حل الأمين المسمى ssDNA (أمين-ssDNA) في المياه الخالية من النيوكليز إلى تركيز 1 mM. تحقق من تركيز حبلا مع الأشعة فوق البنفسجية / فيس الطيف.
    2. إعداد 11.5 mM sulfo-SMCC (وصلة متقاطعة ثنائية الوظائف مع إستر sulfo-NHS وmalimide) حل جديد عن طريق حل 2 ملغ من sulfo-SMCC في 400 ميكرولتر من المياه فائقة الشراء ودوامة لخلط.
    3. إضافة 6 ميكرولتر من 1 mM أمين-ssDNA (6 نانومول) إلى 5.2 ميكرولتر من 11.5 mM sulfo-SMCC (60 نانومول) و 88.8 ميكرولتر من 1x PBS (pH 7.2). دوامة لمدة 5 ق تليها الطرد المركزي في 8600 × ز لمدة 3 دقائق.
    4. السماح لرد الفعل على المضي قدما لمدة 30 دقيقة في RT.
    5. إزالة sulfo-SMCC الزائدة من SMCC اقتران أمين-ssDNA (mal-ssDNA) مع عمود P6 (المخزن المؤقت المتبادل في 1x PBS, pH 7.2).
    6. قياس تركيز سوء ssDNA مع الأشعة فوق البنفسجية / فيس الطيف وحفظ الأطياف.
      ملاحظة: تركيز نموذجي من 35-45 ميكرومتر.
  3. اقتران بروتيج-SsDNA
    1. إضافة 21 ميكرولتر من 4.5 ملغ / مل خفض ProtG (3 نانومول) إلى سوء ssDNA (~ 4-5 نانومول).
      ملاحظة: الأحجام والتركيزات هنا هي قيم نموذجية. ضبط وفقا لقياس تجريبي الفردية. ضمان دائما كمية زائدة من سوء ssDNA على ProtG بنسبة ~ 1.5:1.
    2. دوامة لمدة 5 ق والسماح لرد الفعل على المضي قدما لمدة 3 ساعة في RT.
  4. بروتج-ssDNA تنقية وتوصيف
    1. تنقية بروتج-ssDNA المقترنة من خلال عزلته العلامة مع حمض النيكل والنتريلوترياستيك المغناطيسي (ني-NTA) الخرز.
    2. إزالة imidazole الزائدة (ني NTA elution العازلة) من المنتج مع عمود P6 (المخزن المؤقت تبادلها في برنامج تلفزيوني 1x، PH 7.2).
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لقياس مقدار التلازم، حيث أن الإميدازول لديه امتصاص كبير عند 280 نانومتر.
    3. استخدم مطياف الأشعة فوق البنفسجية/العدسات لتسجيل أطياف المنتج ProtG-ssDNA وكذلك المخزن المؤقت ل Elution Ni-NTA (1x).
      ملاحظة: نموذجية بروتغ-ssDNA امتصاص في 260 نانومتر و 280 نانومتر هو 0.8 و 0.6، على التوالي.
    4. لتحديد كفاءة ونسبة اقتران ProtG إلى ssDNA ، استخدم برنامج MATLAB المكتوب خصيصا (ملف الترميز التكميلي 1) لتحليل طيف المنتج النهائي استنادا إلى الأطياف الثلاثة التي تم جمعها سابقا (ProtG ، SMCC-strand ، ني-NTA حبة elution العازلة).
      ملاحظة: Briefly، التعليمات البرمجية يعمل كما هو موضح في الخطوات 1.4.5-1.4.8. التركيز النموذجي هو 4 ميكرومتر من ProtG-ssDNA مع ProtG و ssDNA بنسبة 1:1 مولر ~(الشكل 2A).
    5. إدخال ProtG، SMCC-حبلا، ني-NTA حبة elution العازلة، وبروتج-ssDNA الأشعة فوق البنفسجية / فيس الأطياف في السيناريو MATLAB
    6. إجراء تقليل غير خطي متعدد الأبعاد لإعادة بناء أطياف ProtG-ssDNA من أطياف المصدر (أطياف بروتج، SMCC-strand، وأطياف العازلة لخرزة ني-NTA)
      ملاحظة: ناتج الدالة التصغير ثلاثة عوامل التحويل، واحد لكل أطياف المصدر.
    7. إعادة بناء أطياف ProtG-ssDNA عن طريق ضرب الأطياف بعاملها المقابل والجمع بين أطياف المصدر المحولة.
    8. مضاعفة التركيز الأولي من بروتج وSMCC-حبلا من عوامل التحول المقابلة لتحديد تركيزات SMCC-حبلا وProG في المنتج ProtG-ssDNA.
    9. (اختياري) تشغيل الصفحة الأصلية وفقا الشكل 2B للمساعدة في ضمان كل مكون وخطوة يعمل كما هو متوقع.
  5. التهجين TGT
    1. تهجين ProtG-ssDNA (حبلا العلوي) مع حبلا القاع البيوتينيلات في نسبة الضرس من 1.2:1 مع تركيزات من 240 nM و 200 nM على التوالي في T50M5 العازلة (10 mM تريس, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) لتهجين بناء TGT الكامل. السماح للتهجين في RT ≥1 ساعة.

2. سطح PEGylation

  1. تنظيف السطح
    1. تنظيف قارورة Erlenmeyer واحدة وجرارتين تلطيخ لكل 8 coverlips. ملء كل حاوية مع 1 M كوه الحل و sonicate لمدة 1 ساعة في RT. غسل جيدا كل حاوية مع المياه فائقة البور والجافة مع N2 أو في الفرن.
      ملاحظة: ملء كوه إلى الأعلى للمس الغطاء، بحيث يتم تنظيفها أيضا.
    2. شطف جيدا كل coverslip مع المياه فائقةبور ووضعها في واحدة من الجرار تلطيخ تنظيفها.
      ملاحظة: تأكد من أنها ليست عالقة لبعضها البعض أو إلى جدار الجرار تلطيخ.
    3. في غطاء الدخان، قم بإعداد محلول البيرانا حديثا بإضافة 30 مل من بيروكسيد الهيدروجين (30٪) إلى 90 مل من حمض الكبريتيك المركز (95٪-98٪) في كوب 250 مل.
      تنبيه: حمض الكبريتيك المركز شديد التآكل. إضافة بيروكسيد الهيدروجين ببطء شديد إلى حمض الكبريتيك ودوامة بعناية لخلط.
    4. غمر كامل الأغطية في جرة تلطيخ مع محلول البيرانا. اترك الأغطية في البيرانا لمدة 30 دقيقة في غطاء الدخان.
      تنبيه: تهدئة محلول البيرانا إلى ما لا يزيد عن 80 درجة مئوية قبل صب لمنع تكسير جرة تلطيخ.
    5. تجاهل محلول البيرانا في كوب 1000 مل وتحييد مع كوه 1 M من تنظيف الزجاج.
    6. (اختياري) كرر تنظيف أسماك البيرانا (الخطوات 2.1.3-2.1.5) مع محلول البيرانا الطازج.
    7. شطف الأغطية مع كميات وفيرة من المياه فائقة البور لإزالة جميع محلول البيرانا المتبقية. هز بلطف جرة تلطيخ خلال كل ارتفاع لتسهيل إزالة (ينصح 10 شطف).
    8. شطف الأغطية بالميثانول 3 مرات لإزالة الماء من سطح الغطاء والحفاظ على الأغطية المغمورة بالميثانول.
  2. السيلانة السطحية
    1. إعداد محلول أمينوسيلين 1٪ عن طريق خلط تماما 94 مل من الميثانول، 1 مل من أمينوسيلين، و 5 مل من حمض الخليك الجليدي في قارورة إرلينماير تنظيفها والمجففة. صب في الثانية تنظيفها والمجففة تلطيخ jar14.
    2. نقل الأغطية المغمورة تحت محلول الميثانول إلى جرة تلطيخ تحتوي على محلول أمينوسيلين 1٪ والحفاظ على جرة مغطاة.
      ملاحظة: لا تسمح للأغطية بالجفاف أثناء نقلها إلى أمينوسيلين للحد من التعرض السطحي الزجاجي للهواء.
    3. احتضان جرة تلطيخ تحتوي على الأغطية في أمينوسيلين لمدة 1 ساعة في 70 درجة مئوية في الفرن15.
    4. تجاهل بعناية محلول أمينوسيلين في حاوية نفايات منفصلة وشطف الأغطية في جرة تلطيخ مع الميثانول 5 مرات لإزالة محلول أمينوسيلين.
    5. شطف الأغطية في جرة تلطيخ مع المياه فائقة الشراء 5 مرات وتجفيفها مع N2.
    6. خبز الأغطية المجففة في جرة تلطيخ في فرن في 110 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. السماح للأغطية لتبرد إلى RT، ثم وضعها على رف PEGylation.
      ملاحظة: قم بتغطية جرة التلطيخ بغطاء أثناء الخبز لتقليل ترسب معين و كيميائي على السطح15.
  3. إعداد حل PEG
    1. إذابة PEG (بولي إيثيلين غليكول) و PEG-biotin إلى RT لمدة 30 دقيقة تقريبا.
      ملاحظة: تقلل هذه الخطوة من تكثيف الرطوبة الذي يمكن أن يحط من إستر NHS على PEG.
    2. جعل PEG العازلة بإضافة 84 ملغ من بيكربونات الصوديوم إلى 10 مل من المياه فائقة البور. يجب أن توفر هذه الصيغة المخزن مؤقت عند 8.4 pH.
    3. ل8 coverlips، مع كل جانب PEGylated واحد مع 20:1 PEG: PEG-البيوتين: قياس 100 ملغ من PEG و 5 ملغ من PEG-البيوتين لإضافة إلى 400 ميكرولتر من العازلة PEG. دوامة الحل لمدة 30 ق والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في السرعة القصوى (≥18000 س غ).
      ملاحظة: هذه الخطوة حساسة للوقت، حيث يبدأ التحلل المائي SVA NHS-ester على الفور ولديه نصف عمر 34 دقيقة عند pH 8.0، مع نصف عمر أقصر عند pH 8.4.
  4. حضانة PEG وتخزين غطاء الغطاء
    1. إعداد غرفة الرطوبة ووضع الأغطية داخل.
    2. إضافة 90 ميكرولتر من محلول PEG إلى غطاء في غرفة الرطوبة ووضع غطاء ثاني على رأس محلول PEG باستخدام ملاقط عقد coverslip لنشر حل PEG بالتساوي.
    3. تأكد من عدم وجود فقاعات في الحل انخفض على coverslip. انخفاض نهاية واحدة من coverlip الثاني على coverlip الأولى وإسقاط ببطء الطرف الآخر بحيث لا توجد فقاعات تقع بين coverlips.
      ملاحظة: سوف تتسبب الفقاعات في ضعف PEGylated بعض المناطق.
    4. كرر حتى يكون جميع الأغطية PEG (أي 8 coverslips = 4 السندويشات PEG). احتضان حلول PEG بين عشية وضحاها (~ 12 ساعة) في RT في غرفة الرطوبة في dark16.
    5. فصل أزواج غطاء ووضعها في جرة تلطيخ. لاحظ الجوانب PEGylated.
    6. شطف الأغطية جيدا مع المياه فائقة البور وجافة مع N2.
      ملاحظة: أمسك الأغطية بالملاقط وانفخ N2 عبر السطح باتجاه الملاقط لمنع الملوثات من التجفيف على السطح.
    7. وضع علامة على الجانب غير PEGylated مع نقطة في زاوية باستخدام علامة دائمة أو قلم الماس.
    8. ضع 2 غطاء PEGylated في أنابيب بريدية مع الجانبين PEGylated تواجه بعضها البعض للمساعدة في تحديد الجانب PEGylated قبل الاستخدام.
    9. فراغ أنبوب لمدة 5 دقائق والردم مع N2. ختم أنبوب مع البارافيلم.
    10. تخزين الأغطية PEGylated في -20 درجة مئوية في أنابيب البريد مختومة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      ملاحظة: قم بتدفئة أنابيب التخزين إلى RT قبل تجميع الشريحة. التكثيف على الأغطية أثناء الختم سوف يسبب تسرب.

3. تدفق غرفة إعداد

  1. تجميع رقاقة
    1. نشر رقيقة كمية صغيرة من الايبوكسي على كلا الجانبين من الشريط على الوجهين مع شفرة حلاقة.
      ملاحظة: قد ينتشر الكثير من الايبوكسي في القناة أثناء التجميع.
    2. الليزر قطع الشريط المغلفة الايبوكسي لإنشاء 4 قنوات. إنشاء رقاقة تدفق عن طريق شطيرة الشريط الايبوكسي بين شريحة من 4 حفرة وأغطية PEG (الشكل 1A).
    3. باستخدام طرف ماصة، وتطبيق ضغط لطيف على طول القنوات لخلق ختم جيدة. علاج الايبوكسي لمدة ≥1 ساعة.
      ملاحظة: لا قص الزجاج لتجنب الانزلاق ضد الايبوكسي.
  2. جمعية الغرفة
    1. قم بمحاذاة الشريحة بحيث يتم وضع فتحة كل قناة في مراكز المحول (الشكل 1A). وضع اثنين من الفواصل الاكريليك شفافة على رأس رقاقة، وتطبيق ضغط ثابت في منتصف الكتلة، والمسمار في اثنين من مسامير 4-40 في نهايات كل فاصل.
      ملاحظة: لا تفرض المسمار أو اضغط بقوة على الفواصل، أو قد الكراك رقاقة.
    2. على الجانب الآخر من قوس، المسمار مداخل في الثقوب مترابطة. مراقبة حالة الختم من خلال كتلة الاكريليك شفافة.
    3. كما الأنابيب يجعل الاتصال مع فتح رقاقة، ختم الاتصال عن طريق التواء بلطف الأنابيب في اتجاه عقارب الساعة.
      ملاحظة: قد تتسبب المداخل المحكمة في انسداد التدفق، بينما تتسبب الاتصالات الفضفاضة في حدوث تسرب.

4. إعداد السطح

ملاحظة: الرجوع إلى الشكل 1B لسير العمل الكلي.

  1. منع العوامل لمنع الربط غير المحدد
    1. استخدام ماصة لتدفق 200 ميكرولتر من العازلة غسل (10 mM تريس، 50 م م NaCl، 5 م MgCl2 و 2 MM CaCl2، 0.05٪ توين 20) في الغرفة للتحقق من وجود تسرب. إذا تشكلت الفقاعات في القناة، ادفع بقوة 200 ميكرولتر إضافية لإزالة الفقاعات.
      ملاحظة: فقاعات الهواء الكبيرة التي لم تتم إزالتها في هذه الخطوة يمكن أن تزيح وتدمر التشغيل السطحي لاحقا.
    2. أضف 40 ميكرولتر من BSA (1٪ ث /v) إلى غرفة التدفق لمنع الربط غير المحدد واحتضان لمدة 10 دقائق.
    3. تأكد من إضافة حجم كاف خلال كل فترة حضانة لملء غرف التدفق وتشكيل قطرات في المداخل والمنافذ. ضبط أحجام الحضانة وفقا لذلك وإجراء جميع الحضانات في غرفة الرطوبة.
    4. أضف 40 ميكرولتر من توين 20 (5٪ v/v) إلى غرفة التدفق. احتضان لمدة 10 دقيقة لزيادة الحد من الربط غير محددة.
    5. (اختياري) تحقق من السطح للحصول على كمية كافية من الخرز البوليسترين المتدفقة من خلال القناة. إضافة 40 ميكرولتر من حبات البوليسترين المغلفة ProtG (0.01٪ ث / v) والصورة باستخدام المجهر darkfield مع هدف 10x. إذا كانت الخرز لا تلتزم السطح، انتقل إلى الخطوة التالية.
    6. اغسل القناة مع 200 ميكرولتر من عازل الغسيل لإزالة جميع عوامل السلب.
  2. عملية سطح الغرفة
    1. أضف 40 ميكرولتر من الستريبتافيدين (100 ميكروغرام/مل) إلى غرفة التدفق واحتضن لمدة 20 دقيقة. ثم، يغسل مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل.
    2. أضف 40 ميكرولتر من ProtG-TGT المهجن (100 nM) إلى غرفة التدفق واحتضن لمدة 20 دقيقة. ثم، يغسل مع 200 ميكرولتر غسل العازلة.
    3. إضافة 40 ميكرولتر من حبلا بروتغ-TGT الأعلى (100 nM) لمدة 20 دقيقة لإكمال أي حبلا TGT السفلي غير المثمر على السطح. غسل مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل.
    4. إضافة 40 ميكرولتر من P-selectin-Fc (10 ميكروغرام / مل) إلى غرفة التدفق واحتضان لمدة 60 دقيقة. ثم، يغسل مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل.
      ملاحظة: مدة الحضانة أمر بالغ الأهمية.

5. التجربة والتصوير

  1. إعداد نظام التدفق
    1. ملء حقنة زجاجية 5 مل مع المخزن المؤقت المتداول (HBSS مع 2 MM CaCl2، 2 mM MgCl2، 10 MM HEPES، 0.1٪ BSA). تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الحقنة عن طريق النقر على جانبي الحقنة لطرد الفقاعات ودفعها إلى الخارج أثناء تعويمها نحو الطرف.
    2. أدخل إبرة معقمة (26 جم، 5/8 بوصة طول) في 200 مم من أنابيب البولي إيثيلين (I.D: 0.38 مم؛ O.D: 1.09 مم) وربط الإبرة إلى حقنة الزجاج.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود هواء في أي مكان في موصل الإبرة.
    3. إصلاح المحاقن على مضخة حقنة وإمالة مضخة حقنة بحيث يتم رفع الجانب المكبس لمنع فقاعات الهواء من دخول القناة. أدخل نهاية الأنبوب في مدخل غرفة التدفق.
      ملاحظة: تأكد من الاتصال السائل إلى السائل عند إجراء الاتصال عن طريق إيداع قطرات على المداخل وجود قطرات في نهاية أنابيب الحقنة. تأكد من عدم دخول فقاعات الهواء إلى القناة عن طريق السماح بإفلات صغير للتشكل في نهاية أنابيب الحقنة قبل إدخالها في المدخل.
    4. أدخل نهاية واحدة من 200 مم أخرى من أنابيب البولي إيثيلين في المنفذ ، والطرف الآخر غارقة في كوب من النفايات.
  2. الإعداد للخلية المتداول
    1. تنمو خلايا HL-60 في 25 سم2 قوارير الثقافة التهوية في وسائل الإعلام IMDM تكملها 20٪ مصل البقر الجنين و 1٪ المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. الحفاظ على كثافات الخلايا بين 1 × 105-2 × 106 خلايا / مل.
    2. (اختياري) تمييز خلايا HL-60 في وسيط IMDM كامل يحتوي على 1.25٪ DMSO في كثافة أولية من 2 × 105 خلايا / مل. احتضان الخلايا لتكون الأكثر نشاطا لمدة 5-6 أيام.
    3. خذ عينة (1-2 مل) من تعليق الخلية والطرد المركزي (200 × ز، 3 دقائق) لكريه الخلايا.
    4. إزالة المتوسطة وإعادة إنفاق الخلايا بلطف في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المتداول. كرر خطوة الغسيل مرتين لإزالة الحطام الخلوي.
    5. قياس كثافة الخلية مع مقياس الدم. إعادة تركيب الكريات الخلية مع المتداول العازلة إلى كثافة 2 × 105 خلايا / مل.
    6. قطع بعناية الأنابيب من مداخل / منفذ وماصة 40 ميكرولتر من تعليق الخلية في غرفة التدفق. إعادة توصيل الأنابيب كما هو موضح سابقا، وضمان عدم إدخال فقاعات في قناة التدفق.
    7. بدء تجربة المتداول الخلية عن طريق بدء مضخة حقنة بمعدلات التدفق المطلوب.
      ملاحظة: تعتمد كثافة المسارات الفلورية على إجهاد القص، كما أن إجهاد/سرعة القص بسرعات الخلية المنخفضة سينتج عموما مسارات باهتة (الشكل 4A). تجنب كثافة الخلايا العالية على السطح أو المدة الزائدة للدرفلة لضمان مسارات أحادية الخلية قابلة للفصل (الشكل 4B، C).
    8. استخدام المجهر darkfield مع هدف 10x لضمان رصد المتداول الخلية.
    9. بمجرد الانتهاء من التجربة، قم بإزالة الخلايا من القناة عن طريق غرس المخزن المؤقت المتداول عند 100 مل/ساعة حتى يصبح السطح خاليا من الخلايا.
  3. تصوير المسارات المحلية من خلال "تراكم النقاط المستندة إلى الحمض النووي للتصوير في تضاريس النانو" (DNA-PAINT)
    1. إضافة 40 ميكرولتر من حبلا صور الحمض النووي-PAINT (500 pM) في مخزن الحمض النووي-PAINT (0.05٪ توين-20، 5 مللي متر تريس، 75 mM MgCl2، 1 mM EDTA) إلى القناة.
    2. إجراء المجهر الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) باستخدام عدسة هدف TIRF 100x الغمر النفط. احصل على إطارات 40000+ مع وقت تعرض 25 مللي ثانية لكل إطار عند كسب 300 (EM) من الإلكترونات المتكاثرة باستخدام كاميرا جهاز الشحن المقترن بالإلكترونات (EMCCD).
    3. استخدم حزمة برامج Picasso17 لترجمة الصور فائقة الدقة (الشكل 4D) وتقديمها باتباع الخطوات 5.3.4-5.3.5.
    4. تحميل الفيلم DNA-PAINT في برنامج توطين لتحديد توطين كل الفلوروفوري في كل إطار.
      ملاحظة: تحسين طول مربع الجانب و Min. Net Gradient المعلمات حتى يتم تعقب الفلوروفوريس فقط بدقة. Min. صافي معامل التدرج يمكن أن تذهب في كثير من الأحيان فوق 100000 لتحقيق تتبع الأمثل. الإعداد صالح: MLE، طريقة غاوسية متكاملة تنتج أفضل نتيجة. وأخيرا، إذا كان الفيلم طويل جدا، تقسيمه إلى أكوام من 10000 إطار من أجل تتبع المعاينة في التعرييب للعمل بشكل صحيح قبل إعادة دمجها في ملف hdf5 النهائي.
    5. ثم قم بتحميل الملف hdf5 الناتجة في برنامج تقديم لتنفيذ تصحيح الانجراف وتقديم.
      ملاحظة: تنفيذ تصحيح الانجراف متعددة عبر Undrift بواسطة RCC لتحسين النتيجة النهائية.
  4. تصوير المسارات الطويلة عن طريق وضع العلامات الدائمة
    1. أضف خيط الصور الدائم واحتضنه لمدة 120 s في المخزن المؤقت T50M5. اغسل القناة عن طريق غرس 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت.
    2. تسجيل صورة مع ليزر الإثارة قبالة للحصول على ضجيج الكاميرا الخلفية. صورة مساحة كبيرة في نمط الشبكة بواسطة المجهر TIRF.
      ملاحظة: يوصى بتراكب الإطارات الزائدة عن الإطار ≥10٪ للخياطة اللاحقة.
    3. برمجة المجهر لمسح أكثر من مساحة 400 × 50 صورة (20000 صور في المجموع). باستخدام برنامج فيجي، تقسيم البيانات الخام إلى ملفات tiff الفردية، تحتوي كل منها على 10000 صورة كحد أقصى.
    4. قم بتسوية جميع الصور باستخدام ملف الإضاءة (الشكل 3A-C) باتباع الخطوات 5.4.5-5.4.7.
    5. طرح ضجيج الكاميرا الخلفية من كل إطار. الحصول على إسقاط مكدس المتوسط (ملف تعريف الإضاءة) من كل إطار طرح الخلفية.
    6. تطبيع ملف تعريف الإضاءة بقيمتها القصوى. تقسيم كل إطار الخلفية طرحها من قبل التشكيل الجانبي الإضاءة تطبيع.
    7. إعادة زيادة حجم الإطارات المصححة إلى النطاق المناسب لعمق البت المطابق.
    8. استخدام MIST18 لغرزة الصور (الشكل 3D، E).

النتائج

يصف البروتوكول أعلاه الإجراء التجريبي لمقايسة بصمة الالتصاق. يوضح سير عمل التجربة العامة في الشكل 1، بدءا من تجميع غرفة التدفق (الشكل 1A) إلى التشغيل السطحي (الشكل 1B) وخطوات التجربة والتصوير (الشكل 1C).

Discussion

يتيح فحص بصمة الالتصاق تصور أحداث التصاق الجزيئي بين PSGL-1 و P-selectin أثناء التصاق التدحرج الخلوي. يتم بدء هذه العملية عن طريق التقاط P-selectin بوساطة تليها المتداول تحت إجهاد القص السائل. عادة ما تنطوي المشكلات المحتملة أثناء التجربة على مسارات فلورية ضعيفة أو مفقودة حتى عندما تتدحرج الخلايا بشك...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الكندية للابتكار (CFI 35492)، ومجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا منحة ديسكفري (RGPIN-2017-04407)، وصندوق الحدود الجديدة في البحوث (NFRFE-2018-00969)، ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية (SCH-2020-0559)، وصندوق جامعة كولومبيا البريطانية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-channel drill guideCustom made3D printed with ABS filament
4-holes slideCustom madeDrill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
AcetoneVWRBDH1101-4LP
Acrylic spacerCustom madeCut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holderCustom madeMachine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
AminosilaneAlfaAesarL14043CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solutionCytiva HyCloneSV3007901Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyreneSpherotechPGP-60-5
Bovine serum albuminVWR332
Buffer, DNA PAINT0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M510mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, RollingHBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chlorideVWRBDH9224
Cell culture flasksVWR10062-868
Concentrated sulfuric acidVWRBDH3072-2.5LG95-98%
Coverslip holding tweezersTechni-Tool758TW150
Diamond-coated drill bitsAbrasive technologyC52505100.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand)IDT DNACustom oligoCCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)IDT DNACustom oligo/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINTIDT DNACustom oligoGAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labellingIDT DNACustom oligoCCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tapeScotch2373/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTAThermofisher155750200.5 M EDTA, pH 8.0
EpoxyGorilla420015 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-085
GelGreenBiotium41005
Glacial acetic acidVWRBDH3094-2.5LG
Glass, CoverslipsFisher Scientific12-548-5P
Glass, Microscope slideVWR48300-02675 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jarVWR74830-150Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)Lonza04-315Q
HemocytometerSigma-AldrichZ359629-1EA
HL-60 cellsATCCCCL-240
Humidity chamber slide supportCustom made3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxideVWRBDH7690-130%
ImidazoleSigma-AldrichI2399
Inlets/outletsCustom madeDrill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)Lonza12-722F
Magnesium chlorideVWRBDH9244
Magnetic Ni-NTA beadsInvitrogen10103D
Mailer tubesEMSEMS71406-10
MethanolVWRBDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel ColumnsBiorad7326200In SSC Buffer
PEGLaysan BioMPEG-SVA-5000
PEG-biotinLaysan BioBiotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxideVWR470302-132
Protein, Protein GAbcamab155724N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-FcR&D System137-PSRecombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, StreptavidinCedarlaneCL1005-01-5MG
Pump SyringeHarvard Apparatus704801
Sodium bicarbonateWard’s Science470302-444
Sodium chlorideVWR97061-274
Sulfo-SMCCThermofisher22322
SyringeHamilton81520Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needlesBD305115Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEPSigma-AldrichC4706-2G
TrisVWRBDH4502-500GP
Tubing, AdaptorTygonABW00001Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, PolyethyleneBD Intramedic427406Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20Sigma-Aldrich93773

References

  1. McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
  4. Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
  5. van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
  6. Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
  7. Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
  8. Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
  9. Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
  10. Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
  11. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
  12. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
  13. Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
  14. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
  15. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  16. Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  17. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  18. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
  19. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  20. Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
  21. Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
  22. Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
  23. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  24. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175 selectin P selectin 1 PSGL 1 TGT DNA PAINT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved