Визуализация молекулярной адгезии в клеточной прокатке с помощью анализа адгезионного следа

Резюме

В этом протоколе представлены экспериментальные процедуры для выполнения анализа адгезионного следа для изображения событий адгезии во время быстрой клеточной скользящей адгезии.

Аннотация

Скользящая адгезия, облегчаемая селектин-опосредованными взаимодействиями, представляет собой высокодинамичную, пассивную подвижность при наборе лейкоцитов к месту воспаления. Это явление происходит в посткапиллярных венулах, где кровоток толкает лейкоциты в скользящем движении по эндотелиальным клеткам. Стабильная прокатка требует тонкого баланса между образованием адгезионных связей и их механически управляемой диссоциацией, что позволяет ячейке оставаться прикрепленной к поверхности во время прокатки в направлении потока. В отличие от других процессов адгезии, происходящих в относительно статических средах, адгезия качения очень динамична, поскольку клетки качения перемещаются на тысячи микрон со скоростью десятки микрон в секунду. Следовательно, обычные методы механобиологии, такие как микроскопия силы тяги, непригодны для измерения отдельных событий адгезии и связанных с ними молекулярных сил из-за короткой временной шкалы и требуемой высокой чувствительности. Здесь мы описываем нашу последнюю реализацию анализа адгезионного следа для изображения P-селектина: взаимодействия PSGL-1 в адгезии качения на молекулярном уровне. Этот метод использует необратимые тросы натяжения на основе ДНК для получения постоянной истории событий молекулярной адгезии в виде флуоресцентных дорожек. Эти дорожки могут быть изображены двумя способами: (1) сшивание тысяч изображений с дифракционным ограничением для создания большого поля зрения, что позволяет извлекать адгезионный след каждой скользящей клетки длиной более тысяч микрон, (2) выполнение DNA-PAINT для реконструкции изображений со сверхвысоким разрешением флуоресцентных дорожек в небольшом поле зрения. В этом исследовании анализ адгезионного следа использовался для изучения клеток HL-60, катящихся при различных напряжениях сдвига. При этом мы смогли изобразить пространственное распределение взаимодействия P-селектина: PSGL-1 и получить представление об их молекулярных силах через интенсивность флуоресценции. Таким образом, этот метод обеспечивает основу для количественного исследования различных взаимодействий между клеткой и поверхностью, участвующих в адгезии качения на молекулярном уровне.

Введение

Каскад скользящей адгезии описывает, как циркулирующие клетки привязываются к стенке кровеносного сосуда и катятся вдоль ^нее1. Пассивная прокатка в основном опосредована селектинами, основным классом молекул клеточной адгезии (CAMs)¹. Под сдвиговым потоком крови лейкоциты, экспрессирующие Р-селектин гликопротеин лиганд-1 (PSGL-1), образуют высокопреходящие связи с Р-селектином, которые могут экспрессироваться на поверхности воспаленных эндотелиальных клеток. Этот процесс имеет решающее значение для того, чтобы лейкоциты мигрировали в место ^{воспаления2}. Кроме того, PSGL-1 также является механочувствительным рецептором, способным запускать последующую стадию твердой адгезии каскада скользящей адгезии при его взаимодействии с P-селектином3.

Генетические мутации, влияющие на функцию CAM, могут серьезно повлиять на иммунную систему, например, при редком заболевании дефицита адгезии лейкоцитов (LAD), где нарушение адгезии молекул, опосредующих прокатку, приводит к сильному ослаблению иммунитета ^лиц4,5,6. Кроме того, было показано, что циркулирующие опухолевые клетки мигрируют после аналогичного процесса прокатки, что приводит к метастазированию7,8. Однако, поскольку клеточная прокатка является быстрой и динамичной, обычные экспериментальные методы механобиологии непригодны для изучения молекулярных взаимодействий во время клеточной прокатки. В то время как одноклеточные и одномолекулярные методы манипулирования, такие как атомно-силовая микроскопия и оптический пинцет, смогли изучить молекулярные взаимодействия, такие как силово-зависимое взаимодействие P-селектина с PSGL-1 на уровне одной ^{молекулы9}, они непригодны для исследования событий живой адгезии во время клеточного качения. Кроме того, взаимодействие, характеризуемое in vitro, не может напрямую ответить на вопрос о молекулярной адгезии in vivo. Например, какой диапазон молекулярного напряжения является биологически значимым, когда клетки функционируют в своей родной среде? Вычислительные методы, такие как моделирование адгезионной ^{динамики10} или простая стационарная ^{модель11,} охватывают определенные молекулярные детали и то, как они влияют на поведение качения, но сильно зависят от точности параметров моделирования и предположений. Другие методы, такие как микроскопия силы тяги, могут обнаруживать силы во время миграции клеток, но не обеспечивают достаточного пространственного разрешения или количественной информации о молекулярном напряжении. Ни один из этих методов не может обеспечить прямые экспериментальные наблюдения за временной динамикой, пространственным распределением и неоднородностью величин молекулярных сил, которые напрямую связаны с функцией и поведением клеток в их родной среде.

Поэтому внедрение датчика молекулярной силы, способного точно измерять селектин-опосредованные взаимодействия, имеет решающее значение для улучшения нашего понимания адгезии при качении. Здесь мы описываем протокол анализа адгезионного ^следа12, где шарики с покрытием PSGL-1 катаются на поверхности, представляющей п-селектин функционализированные тросы датчика напряжения (TGTs)¹³. Эти ТГТ являются необратимыми датчиками силы на основе ДНК, которые приводят к постоянной истории событий разрыва в виде считывания флуоресценции. Это достигается путем разрыва TGT (dsDNA) и последующей маркировки разорванной TGT (ssDNA) флуоресцентно меченой дополнительной нитью. Одним из основных преимуществ этой системы является ее совместимость как с дифракционными ограничениями, так и с изображениями со сверхвысоким разрешением. Флуоресцентно меченая комплементарная нить может быть либо постоянно связанной (>12 bp) для дифракционно-ограниченной визуализации, либо временно связанной (7-9 bp) для визуализации сверхвысокого разрешения через DNA PAINT. Это идеальная система для изучения адгезии при качении, поскольку ТГТ разрываются во время активной прокатки, но показания флуоресценции анализируются после прокатки. Два метода визуализации также предоставляют пользователю больше свободы для исследования адгезии при качении. Как правило, дифракционно-ограниченная визуализация полезна для извлечения силы молекулярного разрыва через интенсивность флуоресценции13, тогда как визуализация со сверхвысоким разрешением позволяет проводить количественный анализ плотности рецепторов. Благодаря возможности исследования этих свойств адгезии качения этот подход обеспечивает перспективную платформу для понимания механизма силовой регуляции молекулярной адгезии клеток качения при сдвиговом потоке.

протокол

1. Маркировка и гибридизация олигонуклеотидов

1. Восстановление дисульфидных связей белка G
   1. Растворите 10 мг белка G (ProtG) в 1 мл сверхчистой воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белок G здесь модифицирован одним остатком цистеина на С-конце и N-концевой полигистидовой меткой.
   2. Буферный обмен ≥20 мкл ProtG (10 мг/мл) на 1x PBS (pH 7,2) со колонкой P6.
   3. Измерьте концентрацию белка после буферного обмена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация 7-8 мг/мл.
   4. Готовят 120 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), растворяя 3 мг TCEP в 90 мкл 1x PBS (рН 7,2) с последующим 10 мкл 0,5 M ЭДТА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TCEP должен быть свежеприготовленным.
   5. Добавьте 4 мкл 120 мМ TCEP (480 нмоль) к 20 мкл ProtG (4-5 нмоль).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь к молярному соотношению ~100:1 TCEP к белку.
   6. Дайте реакции продолжаться в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
   7. Удалите избыток TCEP из восстановленного ProtG с помощью колонки P6 (буфер, обмениваемый в 1x PBS, pH 7,2).
   8. Измерьте концентрацию восстановленного ProtG с помощью спектрофотометра UV/Vis и сохраните спектры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация 3,5-4,5 мг/мл.
2. Амино-меченая реакция сдНК с сульфо-SMCC
   1. Растворяют меченую амином ssDNA (amine-ssDNA) в воде, свободной от нуклеаз, до концентрации 1 мМ. Проверьте концентрацию пряди с помощью спектрофотометра UV/Vis.
   2. Готовят 11,5 мМ сульфо-SMCC (гетеро-бифункциональный сшивающий ликер с сульфо-NHS эфиром и малеимидом) раствор в свежем виде, растворяя 2 мг сульфо-SMCC в 400 мкл сверхчистой воды и вихре для смешивания.
   3. Добавьте 6 мкл 1 мМ амина-ссДНК (6 нмоль) к 5,2 мкл 11,5 мМ сульфо-SMCC (60 нмоль) и 88,8 мкл 1x PBS (рН 7,2). Вихрь в течение 5 с с последующим центрифугированием при 8600 х г в течение 3 мин.
   4. Дайте реакции продолжаться в течение 30 мин при РТ.
   5. Удалить избыток сульфо-SMCC из конъюгированной амино-ssDNA (mal-ssDNA) со колонкой P6 (буфер, обмениваемый в 1x PBS, pH 7,2).
   6. Измерьте концентрацию mal-ssDNA с помощью спектрофотометра UV/Vis и сохраните спектры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация 35-45 мкМ.
3. Конъюгация ПротГ-ссДНК
   1. Добавьте 21 мкл 4,5 мг/мл восстановленного ПротГ (3 нмоль) к mal-ssDNA (~4-5 нмоль).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы и концентрации здесь являются типичными значениями. Регулировка в соответствии с индивидуальными экспериментальными измерениями. Всегда обеспечивайте избыточное количество mal-ssDNA над ProtG в соотношении ~ 1,5: 1.
   2. Вихрь в течение 5 с и дайте реакции продолжаться в течение 3 ч при RT.
4. Очистка и характеристика ПротГ-ссДНК
   1. Очищают конъюгированную ProtG-ssDNA с помощью изоляции его метки магнитными шариками никель-нитрилотриаценовой кислоты (Ni-NTA).
   2. Удалите избыток имидазола (буфер элюирования Ni-NTA) из продукта с помощью колонки P6 (буфер, обмениваемый в 1x PBS, pH 7,2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для количественной оценки конъюгации, так как имидазол обладает значительным поглощением при 280 нм.
   3. Используйте спектрофотометр UV/Vis для записи спектров продукта ProtG-ssDNA, а также буфер элюирования Ni-NTA (1x).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная абсорбция ProtG-ssDNA при 260 нм и 280 нм составляет 0,8 и 0,6 соответственно.
   4. Чтобы определить эффективность сопряжения и отношение ProtG к ssDNA, используйте специально написанный скрипт MATLAB (Supplemental Coding File 1) для разложения спектра конечного продукта на основе трех спектров, собранных ранее (ProtG, SMCC-thread, Ni-NTA бусинный элюционный буфер).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вкратце, код работает так, как описано в шагах 1.4.5-1.4.8. Типичная концентрация составляет 4 мкМ ПротГ-ссДНК с ПротГ и сдНК при молярном соотношении ~1:1 (Рисунок 2А).
   5. Вход ProtG, SMCC-цепи, буфер элюирования шариков Ni-NTA и спектры ProtG-ssDNA UV/Vis в скрипт MATLAB
   6. Выполнение многомерной неограниченной нелинейной минимизации для реконструкции спектров ProtG-ssDNA из спектров источника (спектры буфера элюирования ProtG, SMCC и Ni-NTA бусин)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция минимизации выводит три коэффициента преобразования, по одному для каждого исходного спектра.
   7. Реконструируйте спектры ProtG-ssDNA, умножив спектры на соответствующий им множитель и объединив преобразованные спектры источника.
   8. Умножьте начальную концентрацию ProtG и SMCC-цепи на соответствующие коэффициенты трансформации, чтобы определить концентрации SMCC-цепи и ProtG в продукте ProtG-ssDNA.
   9. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Запустите собственную страницу PAGE в соответствии с рисунком 2B , чтобы убедиться, что каждый компонент и шаг работают должным образом.
5. Гибридизация TGT
   1. Гибридизация ProtG-ssDNA (верхняя нить) с биотинилированной нижней нитью в молярном соотношении 1,2:1 с концентрациями 240 нМ и 200 нМ соответственно в буфере T50M5 (10 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 5 мМ _MgCl2) для гибридизации полной конструкции TGT. Дайте гибридизации при RT ≥1 ч.

2. Поверхностное пегилирование

1. Очистка поверхностей
   1. Очистите одну колбу Erlenmeyer и две банки для окрашивания на каждые 8 обложек. Наполните каждый контейнер 1 М РАСТВОРОМ КОН и ультразвуком в течение 1 ч на RT. Тщательно вымойте каждый контейнер сверхчистой водой и высушите _N2 или в духовке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните KOH сверху, чтобы коснуться крышки, чтобы они также были очищены.
   2. Тщательно промойте каждую крышку сверхчистой водой и поместите их в одну из очищенных банок для окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что они не прилипли друг к другу или к стенке окрашивающих банок.
   3. В вытяжке свежеприготовите раствор пираньи, добавив 30 мл перекиси водорода (30%) до 90 мл концентрированной (95%-98%) серной кислоты в стакан объемом 250 мл.
      ВНИМАНИЕ: Концентрированная серная кислота обладает высокой коррозионной активностью. Добавьте перекись водорода очень медленно в серную кислоту и осторожно закрутите, чтобы перемешать.
   4. Полностью опустите крышки в банку для окрашивания раствором пираньи. Оставьте крышки у пираньи на 30 мин в вытяжке.
      ВНИМАНИЕ: Охладите раствор пираньи до температуры не более 80 °C перед заливкой, чтобы предотвратить растрескивание банки для окрашивания.
   5. Выбросьте раствор пираньи в стакан емкостью 1000 мл и нейтрализуйте 1 М КОН от очистки стекла.
   6. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Повторите очистку пираньи (этапы 2.1.3-2.1.5) свежим раствором пираньи.
   7. Промойте крышки обильным количеством сверхчистой воды, чтобы удалить весь остаточный раствор пираньи. Осторожно встряхивайте банку для окрашивания во время каждого подъема, чтобы облегчить удаление (рекомендуется 10 полосканий).
   8. Промойте крышки метанолом 3 раза, чтобы удалить воду с поверхности крышки и сохранить крышки погруженными в метанол.
2. Силанизация поверхности
   1. Приготовьте 1% раствор аминосилана, тщательно смешивая 94 мл метанола, 1 мл аминосилана и 5 мл ледниковой уксусной кислоты в очищенной и высушенной колбе Эрленмейера. Перелейте во вторую очищенную и высушенную банку для ^{окрашивания14}.
   2. Переложите крышки, погруженные под раствор метанола, в банку для окрашивания, содержащую 1% раствор аминосилана, и держите банку закрытой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания покровов при переходе на аминосилан, чтобы ограничить воздействие воздуха на поверхность стекла.
   3. Инкубировать в ^{духовке15} кувшин для окрашивания, содержащую крышки в аминосилане, в течение 1 ч при 70 °С.
   4. Осторожно выбросьте раствор аминосилана в отдельную емкость для отходов и промойте крышки в банке для окрашивания метанолом 5 раз, чтобы удалить раствор аминосилана.
   5. Промойте крышки в банке для окрашивания сверхчистой водой 5 раз и высушите их _N2.
   6. Выпекать высушенные крышки в банке для окрашивания в духовке при 110 °C в течение 20 мин. Дайте крышкам остыть до RT, затем поместите их на стойку PEGylation.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте банку для окрашивания крышкой во время выпечки, чтобы свести к минимуму особое и химическое осаждение на ^{поверхности15}.
3. Приготовление раствора ПЭГ
   1. Оттаивание ПЭГ (полиэтиленгликоля) и ПЭГ-биотина до РТ в течение примерно 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг сводит к минимуму конденсацию влаги, которая может ухудшить эфир NHS на ПЭГ.
   2. Сделайте буфер ПЭГ, добавив 84 мг бикарбоната натрия в 10 мл сверхчистой воды. Этот состав должен обеспечивать буфер при рН 8,4.
   3. Для 8 обложек, каждый с одной ПЭГилированной стороной с 20:1 ПЭГ:ПЭГ-биотином: измерьте 100 мг ПЭГ и 5 мг ПЭГ-биотина, чтобы добавить к 400 мкл буфера ПЭГ. Вихрь раствора в течение 30 с и центрифуга в течение 1 мин на максимальной скорости (≥18000 х г).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап чувствителен ко времени, так как гидролиз эфира SVA NHS начинается немедленно и имеет период полураспада 34 мин при рН 8,0 с более коротким периодом полураспада при рН 8,4.
4. Инкубация ПЭГ и хранение крышек
   1. Установите камеру влажности и поместите крышки внутрь.
   2. Добавьте 90 мкл раствора ПЭГ в крышку в камере влажности и поместите второй крышку поверх раствора ПЭГ, используя пинцет, удерживающий крышку, чтобы равномерно распределить раствор ПЭГ.
   3. Убедитесь, что в растворе нет пузырьков, опущенных на крышку. Опустите один конец второго обтекателя на первый обтекатель и медленно опустите другой конец, чтобы между чехлами не было пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки приведут к тому, что некоторые области будут плохо обработаны PEGylat.
   4. Повторяйте до тех пор, пока все крышки не будут иметь PEG (т.е. 8 обложек = 4 сэндвича PEG). Инкубируйте растворы ПЭГ в течение ночи (~12 ч) при РТ в камере влажности в темное время ^суток16.
   5. Отделите пары крышек и поместите их в банку для окрашивания. Обратите внимание на PEGylated стороны.
   6. Тщательно промойте крышки сверхчистой водой и высушите _N2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удерживайте крышки пинцетом и продувайте _N2 по поверхности по направлению к пинцуту, чтобы предотвратить высыхание загрязняющих веществ на поверхности.
   7. Пометьте не-PEGylated сторону точкой в углу с помощью перманентного маркера или алмазной ручки.
   8. Поместите 2 ПЭГилированных крышки в почтовые трубки с ПЭГилированными сторонами, обращенными друг к другу, чтобы помочь идентифицировать ПЭГилированную сторону перед использованием.
   9. Пропылесосьте трубку в течение 5 мин и засыпьте обратно _N2. Запечатайте трубку парапленкой.
   10. Храните полиэтиленовые крышки при температуре -20 °C в герметичных почтовых трубках до 6 месяцев.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Прогрейте трубки хранения до RT перед сборкой чипа. Конденсация на крышках во время уплотнения приведет к утечке.

3. Подготовка проточной камеры

1. Сборка стружки
   1. Тонко распределите небольшое количество эпоксидной смолы по обеим сторонам двухсторонней лентой с лезвием бритвы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком много эпоксидной смолы может распространиться в канал во время сборки.
   2. Лазерная резка ленты с эпоксидным покрытием для создания 4 каналов. Создайте проточную стружку, зажав эпоксидную ленту между 4-отверстием слайда и крышкой PEG (рисунок 1A).
   3. Используя наконечник пипетки, приложите мягкое давление по всей длине каналов, чтобы создать хорошее уплотнение. Отверждение эпоксидной смолы в течение ≥1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не сдвигайте стекло, чтобы избежать скольжения по эпоксидной смоле.
2. Сборка камер
   1. Выровняйте чип так, чтобы открытие каждого канала располагалось в центрах адаптера (рисунок 1А). Поместите две прозрачные акриловые прокладки поверх чипа, приложите сильное давление в середине блока и вкрутите два винта по 4-40 на концах каждой распорки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимайте на винт и не надавливайте слишком сильно на распорки, иначе стружка может треснуть.
   2. С другой стороны кронштейна вкрутите входные отверстия в резьбовые отверстия. Следите за состоянием уплотнения через прозрачный акриловый блок.
   3. Когда трубка вступает в контакт с отверстием стружки, запечатайте соединение, осторожно повернув трубку по часовой стрелке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерно затянутые входные отверстия могут привести к блокировке потока, в то время как свободные контакты вызовут утечку.

4. Подготовка поверхности

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к рисунку 1B для общего рабочего процесса.

1. Блокирующие агенты для предотвращения неспецифического связывания
   1. Используйте пипетку для подачи 200 мкл промывочного буфера (10 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 5 мМ _MgCl2 и 2 мМ _CaCl2, 0,05% Tween 20) в камеру для проверки утечки. Если пузырьки образуются в канале, агрессивно протолкните дополнительные 200 мкл, чтобы удалить пузырьки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большие пузырьки воздуха, не удаленные на этом этапе, могут вытеснить и разрушить функционализацию поверхности позже.
   2. Добавьте 40 мкл BSA (1% мас./об.) в проточную камеру для предотвращения неспецифического связывания и инкубируйте в течение 10 мин.
   3. Убедитесь, что в течение каждого инкубационного периода добавляется достаточно объема для заполнения проточных камер и образования капель на входах и выходах. Отрегулируйте объемы инкубации соответствующим образом и выполните все инкубации в камере влажности.
   4. Добавьте 40 мкл Tween 20 (5% v/v) в проточную камеру. Инкубировать в течение 10 мин для дальнейшего уменьшения неспецифического связывания.
   5. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Проверьте поверхность на наличие адекватной пассивации путем протекания полистирольных шариков через канал. Добавьте 40 мкл полистирольных шариков с покрытием ProtG (0,01% мас./об.) и нанесите изображение с помощью микроскопа темного поля с 10-кратным объективом. Если бусины не прилипают к поверхности, переходите к следующему шагу.
   6. Промывайте канал 200 мкл буфера для промывки, чтобы удалить все пассиваторы.
2. Функционализация поверхности камеры
   1. Добавьте 40 мкл стрептавидина (100 мкг/мл) в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 мин. Затем промыть 200 мкл промывочного буфера.
   2. Добавьте 40 мкл гибридизированного ProtG-TGT (100 нМ) в проточную камеру и инкубируйте в течение 20 мин. Затем промыть с помощью промывочного буфера объемом 200 мкл.
   3. Добавьте 40 мкл верхней пряди ProtG-TGT (100 нМ) в течение 20 минут, чтобы завершить любую негибридизированную нижнюю прядь TGT на поверхности. Промывайте 200 мкл буфера для стирки.
   4. Добавьте 40 мкл P-селектина-Fc (10 мкг/мл) в проточную камеру и инкубируйте в течение 60 мин. Затем промыть 200 мкл промывочного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность инкубации имеет решающее значение.

5. Эксперимент и визуализация

1. Настройка проточной системы
   1. Наполните стеклянный шприц 5 мл прокатным буфером (HBSS с 2 мМ _CaCl2, 2 мМ _MgCl2, 10 мМ HEPES, 0,1% BSA). Убедитесь, что в шприце нет пузырьков воздуха, постукивая по сторонам шприца, чтобы выбить пузырьки и выталкивая их, когда они плывут к кончику.
   2. Вставьте стерильную иглу (26 г, длина 5/8 дюйма) в полиэтиленовую трубку диаметром ~200 мм (I.D: 0,38 мм; O.D: 1,09 мм) и подключите иглу к стеклянному шприцу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что воздух не задерживается где-либо в разъеме иглы.
   3. Закрепите шприц на шприцевом насосе и наклоните шприцевой насос так, чтобы сторона плунжера была приподнята, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в канал. Вставьте конец трубки во входное отверстие проточной камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте контакт жидкости с жидкостью при соединении, положив капли на входные отверстия и имея капли в конце шприцевой трубки. Убедитесь, что пузырьки воздуха не попадают в канал, позволив небольшому падению образоваться на конце трубки шприца перед введением его во входное отверстие.
   4. Вставьте один конец другой 200 мм полиэтиленовой трубки в выпускное отверстие, а другой конец погружают в стакан для отходов.
2. Настройка на прокатку ячеек
   1. Выращивайте клетки HL-60 в вентилируемых культуральных колбах объемом ^{25 см2} в средах IMDM, дополненных 20% фетальной бычьей сывороткой и 1% антибиотиками при 37 °C с 5% _CO2. Поддерживайте плотность клеток от 1 x ^105-2 × ¹⁰⁶ клеток/мл.
   2. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Дифференцировать клетки HL-60 в полной среде IMDM, содержащей 1,25% DMSO при начальной плотности 2 x ¹⁰⁵ клеток/мл. Инкубировать клетки, чтобы они были наиболее активными в течение 5-6 дней.
   3. Возьмите образец (1-2 мл) из клеточной суспензии и центрифуги (200 х г, 3 мин) для гранулирования клеток.
   4. Извлеките среду и аккуратно повторно суспендируйте ячейки в 500 мкл качающегося буфера. Повторите этап стирки дважды, чтобы удалить клеточный мусор.
   5. Измерьте плотность клеток с помощью гемоцитометра. Повторное суспендирование гранул ячейки с буфером качения до плотности 2 х ¹⁰⁵ клеток/мл.
   6. Осторожно отсоедините трубку от входных/выходных отверстий и пипетки 40 мкл клеточной суспензии в проточной камере. Повторно подключите трубку, как описано ранее, убедитесь, что пузырьки не введены в канал потока.
   7. Начните эксперимент с клеточной прокаткой, запустив шприцевой насос с желаемой скоростью потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность флуоресцентных дорожек зависит от напряжения сдвига, и более низкая скорость сдвига ячейки напряжение / скорость ячейки обычно создают более тусклые дорожки (рисунок 4A). Избегайте высокой плотности ячеек на поверхности или чрезмерной продолжительности качения, чтобы обеспечить разделимость одноэлементных дорожек (рисунок 4B, C).
   8. Используйте микроскоп темного поля с 10-кратным объективом, чтобы обеспечить наблюдение за катком клеток.
   9. Как только эксперимент будет завершен, удалите клетки из канала, вливая буфер качения со скоростью 100 мл / ч до тех пор, пока поверхность не станет бесклеточной.
3. Визуализация локальных треков с помощью «Накопления точек на основе ДНК для визуализации в наноразмерной топографии» (DNA-PAINT)
   1. Добавьте в канал 40 мкл цепи тепловизора DNA-PAINT (500 пМ) в буфер ДНК-PAINT (0,05% Tween-20, 5 мМ Tris, 75 мМ _MgCl2, 1 мМ ЭДТА).
   2. Выполните флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения (TIRF) с использованием 100-кратной масляной объективной линзы TIRF. Получите более 40000 кадров со временем экспозиции 25 мс на кадр при коэффициенте усиления электрон-умножения (EM) 300 с помощью камеры электронно-умножающего зарядовую связь (EMCCD).
   3. Используйте программный пакет ^Picasso17 для локализации и рендеринга изображений со сверхвысоким разрешением (рисунок 4D), следуя шагам 5.3.4-5.3.5.
   4. Загрузите фильм DNA-PAINT в программу Localize, чтобы определить локализацию каждого флуорофора в каждом кадре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте длину стороны коробки и параметры минимального чистого градиента до тех пор, пока не будут точно отслеживаться только флуорофоры. Минимальный параметр net Gradient часто может превышать 100000 для достижения оптимального отслеживания. Настройка посадки: MLE, интегрированный метод Гаусса дает наилучший результат. Наконец, если фильм слишком длинный, разделите его на стопки по 10000 кадров, чтобы отслеживание предварительного просмотра в Localize работало должным образом, прежде чем перекомбинировать их в окончательный файл hdf5.
   5. Затем загрузите полученный файл hdf5 в программу Render для выполнения коррекции дрейфа и рендеринга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните множественную коррекцию дрейфа с помощью Undrift by RCC для улучшения конечного результата.
4. Визуализация длинных дорожек с помощью постоянной маркировки
   1. Добавьте постоянную прядь тепловизора и инкубируйте в течение 120 с в буфере T50M5. Промыть канал, влив 200 мкл промывочного буфера.
   2. Запишите изображение с выключенным лазером возбуждения, чтобы получить фоновый шум камеры. Изображение большой площади в виде сетки с помощью микроскопии TIRF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующего сшивания рекомендуется перекрытие рамы на раму ≥10%.
   3. Запрограммируйте микроскоп на сканирование на площади 400 х 50 изображений (всего 20000 изображений). Используя программу FIJI, разделите необработанные данные на отдельные файлы tiff, каждый из которых содержит максимум 10000 изображений.
   4. Сгладьте все изображения с помощью профиля освещения (рисунок 3A-C) следуя шагам 5.4.5-5.4.7.
   5. Вычтите фоновый шум камеры из каждого кадра. Получите проекцию среднего стека (профиль освещения) каждого кадра, вычитаемого из фона.
   6. Нормализуйте профиль освещения по его максимальному значению. Разделите каждый вычитаемый фоном кадр на нормализованный профиль освещения.
   7. Перемасштабируйте скорректированные кадры до соответствующего диапазона для соответствующей битовой глубины.
   8. Используйте ^MIST18 для сшивания изображений (рисунок 3D, E).

Результаты

В приведенном выше протоколе описывается экспериментальная процедура анализа адгезионного следа. Общий рабочий процесс эксперимента проиллюстрирован на рисунке 1, от сборки проточной камеры (рисунок 1A) до функционализации поверхности (рису...

Обсуждение

Анализ адгезионного следа позволяет визуализировать события молекулярной адгезии между PSGL-1 и P-селектином во время клеточной скользящей адгезии. Этот процесс инициируется P-селектин-опосредованным захватом с последующей прокаткой под текучим напряжением сдвига. Потенциальные пробл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-channel drill guide	Custom made		3D printed with ABS filament
4-holes slide	Custom made		Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
Acetone	VWR	BDH1101-4LP
Acrylic spacer	Custom made		Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holder	Custom made		Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
Aminosilane	AlfaAesar	L14043	CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solution	Cytiva HyClone	SV3007901	Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyrene	Spherotech	PGP-60-5
Bovine serum albumin	VWR	332
Buffer, DNA PAINT			0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M5			10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, Rolling			HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash			10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chloride	VWR	BDH9224
Cell culture flasks	VWR	10062-868
Concentrated sulfuric acid	VWR	BDH3072-2.5LG	95-98%
Coverslip holding tweezers	Techni-Tool	758TW150
Diamond-coated drill bits	Abrasive technology	C5250510	0.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand)	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)	IDT DNA	Custom oligo	/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINT	IDT DNA	Custom oligo	GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labelling	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tape	Scotch	237	3/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTA	Thermofisher	15575020	0.5 M EDTA, pH 8.0
Epoxy	Gorilla	42001	5 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-085
GelGreen	Biotium	41005
Glacial acetic acid	VWR	BDH3094-2.5LG
Glass, Coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
Glass, Microscope slide	VWR	48300-026	75 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jar	VWR	74830-150	Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)	Lonza	04-315Q
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
Humidity chamber slide support	Custom made		3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxide	VWR	BDH7690-1	30%
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Inlets/outlets	Custom made		Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	Lonza	12-722F
Magnesium chloride	VWR	BDH9244
Magnetic Ni-NTA beads	Invitrogen	10103D
Mailer tubes	EMS	EMS71406-10
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns	Biorad	7326200	In SSC Buffer
PEG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
PEG-biotin	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxide	VWR	470302-132
Protein, Protein G	Abcam	ab155724	N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-Fc	R&D System	137-PS	Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, Streptavidin	Cedarlane	CL1005-01-5MG
Pump Syringe	Harvard Apparatus	704801
Sodium bicarbonate	Ward’s Science	470302-444
Sodium chloride	VWR	97061-274
Sulfo-SMCC	Thermofisher	22322
Syringe	Hamilton	81520	Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needles	BD	305115	Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris	VWR	BDH4502-500GP
Tubing, Adaptor	Tygon	ABW00001	Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, Polyethylene	BD Intramedic	427406	Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773