접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

요약

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

초록

셀렉틴 매개 상호 작용에 의해 촉진되는 압연 접착은 염증 부위에 백혈구를 모집하는 데 매우 역동적이고 수동적인 운동성입니다. 이 현상은 혈액 흐름이 내피 세포에 압연 운동에 백혈구를 밀어 하는 포스트 모세관 정맥에서 발생합니다. 안정적인 롤링은 접착 결합 형성과 기계적으로 구동되는 해리 사이의 섬세한 균형을 필요로 하며, 이는 셀이 흐름 방향으로 굴러가면서 표면에 부착된 상태를 유지할 수 있도록 합니다. 상대적으로 정적 환경에서 발생하는 다른 접착 공정과 달리 압연 세포가 초당 수십 미크론에서 수천 미크론을 이동함에 따라 압연 접착력이 매우 역동적입니다. 따라서, 견인력 현미경검사법과 같은 종래의 메카노생물학 방법은 짧은 시간 스케일 및 고감도로 인해 개별 접착 이벤트 및 관련 분자력을 측정하기에 적합하지 않다. 여기서는 P-selectin: PSGL-1 상호작용을 분자 수준에서 롤링 접착을 이미지화하기 위한 접착 발자국 분석의 최신 구현을 설명합니다. 이 방법은 돌이킬 수 없는 DNA 기반 장력 게이지 테더를 사용하여 형광 트랙의 형태로 분자 접착 이벤트의 영구 역사를 생성합니다. 이 트랙은 두 가지 방법으로 이미지화 될 수있다 : (1) 큰 시야를 생성하기 위해 회절 제한 이미지의 수천을 함께 스티치, 길이의 수천 미크론을 통해 각 롤링 셀의 접착 발자국의 추출을 가능하게, (2) DNA-PAINT를 수행하여 작은 시야 내에서 형광 트랙의 초해상도 이미지를 재구성. 이 연구에서는, 접착 발자국 분석은 다른 전단 응력에서 압연하는 HL-60 세포를 연구하기 위하여 이용되었습니다. 이 과정에서 우리는 P-셀렉틴의 공간 분포를 이미지화할 수 있었습니다: PSGL-1 상호 작용및 형광 강도를 통해 그들의 분자 력에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다. 따라서, 이러한 방법은 분자 수준에서 압연 접착에 관여하는 다양한 세포 표면 상호작용의 정량적 조사를 위한 기초를 제공한다.

서문

롤링 접착 캐스케이드는 순환 세포가 혈관 벽을 따라 밧줄을 타고 굴리는 방법을 설명^합니다1. 수동 압연은 주로 셀룰러 접착 분자 (CAM)¹의 주요 클래스인 셀렉틴에 의해 매개됩니다. 혈액의 전단 흐름하에서, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)을 발현하는 백혈구는 염증이 있는 내피 세포의 표면에 발현될 수 있는 P-selectin과 매우 일시적인 결합을 형성한다. 이 과정은 백혈구가 염증의 사이트로 이동하는 것이 중요합니다². 또한, PSGL-1은 P-selectin3와의 교전시 압연 접착의 후속 회사 접착 단계를 발동할 수 있는 메카노감감충수용체이다.

CAM 기능에 영향을 미치는 유전 돌연변이는 백혈구 접착 결핍 (LAD)의 희귀 질환과 같은 면역 체계에 가혹하게 영향을 미칠 수 있으며, 압연을 중재하는 접착 분자의 오작동이 심각하게 면역 손상 된 개인^4,5,6로 이어집니다. 또한, 순환 종양 세포는 유사한 압연 과정에 따라 이동하여 전이^7,8로 이어지는 것으로 나타났다. 그러나 세포 압연은 빠르고 역동적이기 때문에 기존의 실험 적인 메카노생물학 방법은 세포 압연 중 분자 상호 작용을 연구하기에 적합하지 않습니다. 원자력 현미경 및 광학 트위저와 같은 단일 세포 및 단일 분자 조작 방법은 단일 분자 레벨⁹에서 PSGL-1과 P-selectin의 힘에 의존하는 상호 작용과 같은 분자 상호 작용을 연구할 수 있었지만, 세포 압연 중 살아있는 접착 이벤트를 조사하기에 적합하지 않습니다. 추가적으로, 시험관 내 특징의 상호 작용은 생체 내의 분자 접착에 관하여 질문에 직접 대답할 수 없습니다. 예를 들면, 세포가 그들의 네이티브 환경에서 작동할 때 어떤 분자 장력 범위는 생물학으로 관련있습니까? 접착제 역학 시뮬레이션¹⁰ 또는 간단한 정상 상태 ^model11과 같은 계산 방법은 특정 분자 세부 사항과 롤링 거동에 미치는 영향을 캡처했지만 모델링 매개 변수 및 가정의 정확도에 크게 의존합니다. 견인력 현미경과 같은 그밖 기술은 세포 이동 도중 힘을 검출할 수 있습니다 그러나 분자 장력에 충분한 공간 해상도 또는 정량적인 정보를 제공하지 않습니다. 이러한 기술 중 어느 것도 자신의 네이티브 환경에서 세포 기능 및 행동과 직접 관련이 분자 력의 측두역학, 공간 분포 및 크기 이질성의 직접적인 실험 적 관찰을 제공 할 수 없습니다.

따라서 선택 매개 상호 작용을 정확하게 측정할 수 있는 분자력 센서를 구현하는 것은 압연 접착에 대한 이해를 향상시키는 데 매우 중요합니다. 여기서는 PSGL-1 코팅 구슬이 p-selectin 기능화 장력 게이지 테더(TGT)¹³을 제시하는 표면에 압연되는 접착 발자국 분석¹²프로토콜을 설명합니다. 이 TGT는 형광 판독의 형태로 파열 사건의 영구적 인 역사를 초래 돌이킬 수없는 DNA 기반 힘 센서입니다. 이는 TGT(dsDNA)의 파열과 형광으로 표기된 보완 가닥으로 파열된 TGT(ssDNA)의 후속 라벨링을 통해 달성된다. 이 시스템의 한 가지 주요 장점은 회절 제한 및 초해상도 이미징과의 호환성입니다. 형광으로 표지된 보완 적 가닥은 DNA PAINT를 통한 초분해능 이미징을 위해 회절 제한 이미징 또는 과도 바인딩(7-9bp)에 영구적으로 > 결합될 수 있다. 이것은 TG가 활성 압연 도중 파열되기 때문에 압연 접착을 연구하기 위한 이상적인 시스템입니다, 그러나 형광 판독은 압연 후 분석됩니다. 두 가지 이미징 방법은 또한 사용자에게 압연 접착력을 조사할 수 있는 더 많은 자유를 제공합니다. 전형적으로, 회절 제한 화상 진찰은 형^{광 강도를 통해} 분자 파열 력을 추출하는 데 유용하지만, 초해상도 이미징은 수용체 밀도의 정량적 분석을 허용한다. 압연 접착의 이러한 특성을 조사하는 기능으로, 이 접근법은 전단 흐름 하에서 압연 세포의 분자 접착에 대한 강제 조절 메커니즘을 이해하기 위한 유망한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

1. 올리고뉴클레오티드 라벨링 및 혼성화

1. 단백질 G 이황화물 결합 감소
   1. 1mL의 초순수에 10 mg의 단백질 G(ProtG)를 녹입니다.
      참고: 여기에 단백질 G는 C-terminus및 N-종자 폴리 히스티딘 꼬리표에 있는 단 하나 시스테인 잔류물로 변형됩니다.
   2. 완충 교환≥20 μL 의 ProtG (10 mg/mL)를 P6 컬럼이있는 1 x PBS (pH 7.2)로 합니다.
   3. 완충교환 후 단백질 농도를 측정한다.
      참고: 7-8 mg/mL의 전형적인 농도.
   4. 120mM Tris(2-carboxyethyl)인 포스핀(TCEP)을 1x PBS(pH 7.2)의 90 μL로 3mg의 TCEP를 용해한 다음 0.5M EDTA의 10μL을 준비한다.
      참고 : TCEP는 갓 준비해야합니다.
   5. 120mM TCEP(480nmol)의 4μL을 프로트G(4-5nmol)의 20μL에 추가합니다.
      참고: 단백질에 ~100:1 TCEP의 어금니 비율을 목표로 합니다.
   6. 상온(RT)에서 30분 동안 반응을 진행할 수 있도록 한다.
   7. P6 열(1x PBS, pH 7.2로 교환된 버퍼)을 통해 감소된 ProtG에서 초과 TCEP를 제거합니다.
   8. UV/비스 분광계로 감소된 프로트G의 농도를 측정하고 스펙트럼을 저장합니다.
      참고: 3.5-4.5 mg/mL의 전형적인 농도.
2. 설포-SMCC를 가진 아민 표지sDNA 반응
   1. 핵이 없는 물에 아민 라벨sDNA(아민-ssDNA)를 1mM의 농도로 용해하십시오. UV/비스 분광계로 가닥 농도를 확인합니다.
   2. 11.5 mM sulfo-SMCC(설포-NHS 에스테르및 말리미드를 사용하는 이종염 크로스링커) 용액을 400μL의 초순수수및 소용돌이에 2 mg의 설포-SMCC를 용해하여 신선하게 준비한다.
   3. 1mM 아민-ssDNA(6nmol)의 6μL을 11.5m 설포-SMCC(60nmol)와 88.8 μL의 1x PBS(pH 7.2)의 5.2 μL에 추가한다. 5초의 소용돌이가 3분 동안 8600 x g 에서 원심분리를 합니다.
   4. RT에서 30분 동안 반응을 진행할 수 있습니다.
   5. P6 컬럼(1x PBS, pH 7.2로 교환된 버퍼)을 가진 SMCC 컨쥬게이드 아민-ssDNA(말-ssDNA)에서 과도한 설포-SMCC를 제거한다.
   6. UV/비스 분광계로 말-ssDNA의 농도를 측정하고 스펙트럼을 저장합니다.
      참고: 35-45 μM의 일반적인 농도.
3. 프로트G-ssDNA 컨쥬게이션
   1. 말-ssDNA(~4-5nmol)에 4.5 mg/mL 감소된 ProtG(3nmol)의 21 μL을 추가합니다.
      참고: 볼륨과 농도는 일반적인 값입니다. 개별 실험 측정에 따라 조정합니다. 항상 ~ 1.5:1의 비율로 ProtG를 통해 말-ssDNA의 초과 금액을 확인합니다.
   2. 5 s에 대한 소용돌이와 반응이 RT에서 3 시간 동안 진행되도록 허용합니다.
4. ProtG-ssDNA 정제 및 특성화
   1. 자기 니켈-니트리로트리아세산(Ni-NTA) 구슬로 태그 절연을 통해 공주된 ProtG-ssDNA를 정화합니다.
   2. P6 컬럼(1x PBS, pH 7.2로 교환된 버퍼)을 가진 제품으로부터 과도한 imidazole(Ni-NTA 용출 버퍼)을 제거합니다.
      참고: 이미다졸은 280nm에서 상당한 흡수를 하기 때문에 이 단계는 연상을 정량화하는 데 필수적입니다.
   3. UV/Vis 분광광계를 사용하여 제품 ProtG-ssDNA의 스펙트럼과 Ni-NTA 용출 버퍼(1x)를 기록합니다.
      참고: 260 nm 및 280 nm에서 의 전형적인 ProtG-ssDNA 흡광도는 각각 0.8 및 0.6입니다.
   4. ProtG에서 ssDNA에 대한 ProtG의 결합 효율과 비율을 결정하려면 이전에 수집된 세 가지 스펙트럼(ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA 비드 용출 버퍼)에 따라 최종 제품 스펙트럼을 분해하기 위해 맞춤형 MATLAB 스크립트(보충 코딩 파일 1)를 사용합니다.
      참고: 간단히 말해서 코드는 1.4.5-1.4.8 단계에 설명된 대로 작동합니다. 일반적인 농도는 프로트G와 ssDNA를 가진 ProtG-ssDNA의 4 μM이다 ~1:1 어어 비(도 2A).
   5. 입력 프로트G, SMCC-가닥, Ni-NTA 비드 용출 버퍼, 그리고 MATLAB 스크립트에 ProtG-ssDNA UV/Vis 스펙트럼
   6. 소스 스펙트럼(ProtG, SMCC-strand 및 Ni-NTA 비드 용출 버퍼 스펙트럼)에서 ProtG-ssDNA 스펙트럼을 재구성하기 위해 다차원 비제한 비선형 최소화를 수행합니다.
      참고: 최소화 함수는 각 소스 스펙트럼에 대해 하나씩 세 가지 변환 요소를 출력합니다.
   7. 해당 계수에 해당하는 스펙트럼을 곱하고 변형된 소스 스펙트럼을 결합하여 ProtG-ssDNA 스펙트럼을 재구성합니다.
   8. ProtG-ssDNA 제품에서 SMCC-strand 및 ProtG의 농도를 결정하기 위해 해당 변환 인자에 의해 ProtG 및 SMCC-strand의 초기 농도를 곱한다.
   9. (선택 사항) 그림 2B 에 따라 네이티브 PAGE를 실행하여 각 구성 요소와 단계가 예상대로 작동하는지 확인합니다.
5. TGT 혼성화
   1. T50M5 버퍼(10mM Tris, 50mM NaCl, 5m _MgCl2)의 농도가 각각 240nM 및 200 nM의 다름 비율로 바이오티니징 바닥 가닥을 가진 하이브리드화 ProtG-ssDNA(상단 가닥)는 전체 TGT 구조를 혼성화한다. RT ≥1h에서 혼성화하십시오.

2. 표면 PEGylation

1. 표면 청소
   1. 8개의 커버립마다 에를렌마이어 플라스크 1개와 염색 항아리 2개를 청소하십시오. 각 용기를 1M KOH 용액으로 채우고 RT에서 1시간 동안 초음파 처리합니다.
      참고 : 뚜껑을 만지도록 KOH를 상단에 채우기 때문에 청소됩니다.
   2. 각 커버슬립을 초순수물로 철저히 헹구고 청소된 염색 항아리 에 넣습니다.
      참고: 서로 붙어 있지 않았는지 또는 염색 된 항아리의 벽에 붙어 있지 않은지 확인하십시오.
   3. 연기 후드에서는 250mL 비커에 과산화수소 30mL(30%)를 농축(95%-98%)의 황산에 90mL에 추가하여 피라냐 용액을 신선하게 준비한다.
      주의: 농축 황산은 부식성이 높습니다. 과산화수소는 황산에 매우 천천히 추가하고 조심스럽게 소용돌이 섞습니다.
   4. 피라냐 용액으로 염색 된 항아리의 커버립을 완전히 잠급합니다. 연기 후드에 30 분 동안 피라냐에 커버립을 둡니다.
      주의: 피라냐 용액을 80°C 이하로 식히고 붓는 병을 방지하십시오.
   5. 피라냐 용액을 1000mL 비커로 버리고 유리 청소에서 1M KOH로 중화하십시오.
   6. (선택 사항) 신선한 피라냐 용액으로 피라냐 세척(2.1.3-2.1.5단계)을 반복합니다.
   7. 커버립을 풍부한 양의 초순수로 헹구어 잔류 피라냐 용액을 모두 제거합니다. 각 상승 시 염색 항아리를 부드럽게 흔들어 제거를 용이하게합니다 (10 개의 헹구는 것이 좋습니다).
   8. 커버슬립 표면에서 물을 제거하고 커버립을 메탄올로 3번 헹구고 커버립을 메탄올에 담근 상태로 유지합니다.
2. 표면 격리
   1. 94mL의 메탄올, 아미노실란 1mL, 빙하 아세트산 5mL을 세척 및 건조된 에렌마이어 플라스크에 철저히 혼합하여 1% 아미노실용액을 준비한다. 두 번째 세척 및 건조 된 염색 ^jar14에 붓습니다.
   2. 메탄올 용액 아래에 잠긴 커버립을 1% 아미노시란 용액을 함유한 염색 항아리로 옮기고 항아리를 덮어 보관합니다.
      참고: 아미노인으로 옮기는 동안 커버립이 건조되는 것을 허용하지 말고 공기에 유리 표면 노출을 제한합니다.
   3. 오븐¹⁵에서 70°C에서 1시간 동안 아미노실레인의 커버립을 함유한 염색 항아리를 배양한다.
   4. 아미노아일란 용액을 별도의 폐기물 용기에 조심스럽게 버리고 염색 항아리에 커버립을 메탄올5번 헹구어 아미노시란 용액을 제거합니다.
   5. 염색 항아리에 초순수 수를 5번 헹구고 _N2로 건조시다.
   6. 말린 커버립을 110°C에서 오븐에 넣고 20분간 굽습니다. 커버립을 RT로 식힌 다음 PEGylation 랙에 놓습니다.
      참고: 변곡 중에 염색 항아리를 뚜껑으로 덮어 표면의 특정 및 화학 적 침착을 최소화합니다¹⁵.
3. PEG 솔루션 준비
   1. THaw PEG (폴리에틸렌 글리콜) 및 PEG 비오틴에 약 30 분 동안 RT.
      참고: 이 단계는 PEG의 NHS 에스테르를 저하시킬 수 있는 수분 응축을 최소화합니다.
   2. 초순수 10mL에 중탄산나트륨 84mg을 첨가하여 PEG 버퍼를 만드세요. 이러한 제형은 pH 8.4에서 버퍼를 제공해야 한다.
   3. 8 커버립의 경우, 각 페이지드 측에 20:1 PEG:PEG-biotin: 측정 100 PEG 의 mg과 5 PEG-비오틴의 mg 을 측정 하여 400 μL의 PEG 버퍼를 추가합니다. 최대 속도(≥18000 x g)에서 1분 동안 30s 및 원심분리기용 용액을 소용돌이시킵니다.
      참고: 이 단계는 SVA NHS-에스테르 가수분해가 즉시 시작되고 pH 8.0에서 34분의 반감기를 가지며 pH 8.4에서 더 짧은 반감기를 가지므로 시간에 민감합니다.
4. PEG 인큐베이션 및 커버슬립 스토리지
   1. 습도 챔버를 설정하고 커버립을 내부에 배치합니다.
   2. 90 μL의 PEG 용액을 습도 챔버의 커버슬립에 추가하고 페그 용액을 고르게 확산하기 위해 핀셋을 들고 있는 커버슬립을 사용하여 PEG 솔루션 위에 두 번째 커버슬립을 놓습니다.
   3. 용액에 덮개 슬립에 떨어뜨린 거품이 없는지 확인합니다. 첫 번째 커버슬립의 두 번째 커버슬립의 하단을 낮추고 다른 쪽 끝을 천천히 떨어뜨려 커버립 사이에 거품이 끼워 있지 않도록 합니다.
      참고: 거품으로 인해 특정 영역이 제대로 페자이드되지 않습니다.
   4. 모든 커버립이 PEG(예: 8개의 커버립 = PEG 샌드위치 4개)가 있을 때까지 반복합니다. 다크¹⁶의 습도 챔버에서 RT에서 하룻밤(~12시간)에 PEG 솔루션을 배양합니다.
   5. 커버슬립 쌍을 분리하고 염색 된 항아리에 넣습니다. PEGylated 측면을 참고하십시오.
   6. 커버를 초순수물로 철저히 헹구고 _N2로 건조시다.
      참고: 핀셋으로 커버립을 잡고 표면을 가로질러 _N2 를 트위저쪽으로 날려 오염물질이 표면에 건조되는 것을 방지합니다.
   7. 영구 마커 또는 다이아몬드 펜을 사용하여 모서리에 점으로 비 PEGylated 측면을 표시합니다.
   8. 2 PEGylated 커버립을 우편물 튜브에 배치하여 PEGylated 측이 서로 마주보고 있기 때문에 사용하기 전에 PEGylated 측면을 식별하십시오.
   9. 튜브를 5분 동안 진공 청소기로 청소하고 _N2로 백필하십시오. 파라필름으로 튜브를 밀봉합니다.
   10. PEGylated 커버립을 밀봉 된 우체 튜브에 -20 °C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
       참고: 칩 조립 전에 저장 튜브를 RT로 데우십시오. 밀봉 하는 동안 커버립에 응축 누출 발생 합니다.

3. 플로우 챔버 준비

1. 칩 어셈블리
   1. 면도날이 있는 양면 테이프 양쪽에 소량의 에폭시를 얇게 펴고 있습니다.
      참고: 너무 많은 에폭시가 조립 중에 채널로 확산될 수 있습니다.
   2. 에폭시 코팅 테이프를 레이저로 잘라 4 개의 채널을 만듭니다. 4홀 슬라이드와 PEG 커버슬립 사이에 에폭시 테이프를 끼여 유동 칩을 만듭니다(그림 1A).
   3. 파이펫 팁을 사용하여 채널 의 길이에 따라 부드러운 압력을 적용하여 좋은 씰을 만듭니다. ≥1h용 에폭시를 치료한다.
      참고: 에폭시에 대 한 슬라이딩 을 피하기 위해 유리를 전단 하지 마십시오.
2. 챔버 어셈블리
   1. 칩을 정렬하여 각 채널의 개구부가 어댑터의 중심에 배치되도록 합니다(그림 1A). 두 개의 투명 아크릴 스페이서를 칩 위에 놓고 블록 중간에 단단한 압력을 가하고 각 스페이서 끝에 있는 4-40 나사 2개에 나사를 놓습니다.
      참고: 나사를 강제로 던지거나 스페이서에 너무 강하게 누르거나 칩이 깨질 수 있습니다.
   2. 브래킷의 반대편에 는 입구를 나사 구멍에 나사로 연결합니다. 투명 아크릴 블록을 통해 밀봉 상태를 모니터링합니다.
   3. 튜브가 칩의 개구부와 접촉할 때, 튜브를 시계 방향으로 부드럽게 비틀어 연결을 밀봉합니다.
      참고: 과도하게 조여진 입구는 흐름 막힘을 일으킬 수 있으며 느슨한 접촉은 누출을 유발합니다.

4. 표면 준비

참고: 전체 워크플로우의 그림 1B 를 참조하십시오.

1. 비특이적 바인딩을 방지하기 위해 에이전트 차단
   1. 파이펫을 사용하여 200 μL의 세척 버퍼(10m Tris, 50m NaCl, 5mM _MgCl2 및 2mM _CaCl2, 0.05% Tween 20)를 챔버로 플로우하여 누출 여부를 확인합니다. 채널에서 거품이 형성되면 200 μL을 추가로 밀어 거품을 제거합니다.
      참고: 이 단계에서 제거되지 않은 큰 기포는 나중에 표면 기능화를 제거하고 파괴할 수 있습니다.
   2. BSA의 40 μL(1% w/v)을 유량 챔버에 추가하여 비특이적 결합을 방지하고 10분 동안 배양합니다.
   3. 각 인큐베이션 기간 동안 충분한 부피를 추가하여 유입실과 콘센트에서 유량 챔버를 채우고 액적형태를 형성해야 합니다. 그에 따라 배양 량을 조정하고 습도 챔버에서 모든 배양을 수행합니다.
   4. 플로우 챔버에 40 μL의 Tween 20 (5 % v /v)를 추가합니다. 비특이적 결합을 더 줄이기 위해 10분 동안 배양합니다.
   5. (선택 사항) 채널을 통해 폴리스티렌 구슬을 흐르면 표면을 적절한 통과 여부를 확인하십시오. ProtG 코팅 폴리스티렌 구슬 40 μL (0.01 % w /v) 및 10 배 목표를 가진 암장 현미경을 사용하여 이미지를 추가합니다. 구슬이 표면에 부착되지 않으면 다음 단계로 진행합니다.
   6. 모든 통과제를 제거하기 위해 200 μL의 세척 버퍼로 채널을 세척합니다.
2. 챔버 표면 기능화
   1. 스테렙타비딘(100 μg/mL)의 40μL을 유량 챔버에 넣고 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 200 μL의 세척 버퍼로 세척하십시오.
   2. 혼성 ProtG-TGT(100 nM)의 40 μL을 유량 챔버에 넣고 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 200 μL 세척 버퍼로 세척하십시오.
   3. ProtG-TGT 상단 가닥(100 nM)의 40μL을 20분 간 추가하여 표면에 비혼화된 TGT 바닥 가닥을 완성합니다. 워시 버퍼 200μL로 씻으시다.
   4. P 셀렉틴 Fc(10 μg/mL)의 40μL을 유량 챔버에 넣고 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 200 μL의 세척 버퍼로 세척하십시오.
      참고: 인큐베이션 지속 시간은 매우 중요합니다.

5. 실험 및 이미징

1. 흐름 시스템 설정
   1. 압연 버퍼(2mM _CaCl2, 2m _MgCl2, 10mM HEPES, 0.1% BSA)로 5mL 유리 주사기를 채웁니다. 주사기의 측면을 눌러 거품을 빼내고 끝을 향해 떠있을 때 밀어 내밀어 주사기에 기포가 없는지 확인하십시오.
   2. 멸균 바늘(26G, 5/8 인치 길이)을 ~200mm의 폴리에틸렌 튜브(I.D: 0.38 mm)에 삽입합니다. O.D: 1.09 mm) 및 유리 주사기에 바늘을 연결합니다.
      참고: 바늘 커넥터의 아무 공기도 갇혀 있지 않도록 하십시오.
   3. 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 플런저 측이 상승하여 기포가 채널에 유입되는 것을 방지하기 위해 주사기 펌프를 기울입니다. 튜브의 끝을 유량 챔버 입구에 삽입합니다.
      참고: 액적방울을 입구에 증착하고 주사기 튜브 끝에 액적물방울을 가두어 연결시 액체 접촉에 액체를 보장하십시오. 유입구에 삽입하기 전에 주사기 튜브 끝에 작은 방울이 형성되도록 하여 기포가 채널에 들어가지 않도록 하십시오.
   4. 폴리에틸렌 튜브의 다른 200mm의 한쪽 끝을 콘센트에 삽입하고 다른 쪽 끝은 폐기물 비커에 잠겨 있습니다.
2. 셀 롤링을 위한 설정
   1. IMDM 배지에서 25cm2 의 환기 배양 플라스크에서 HL-60 세포를 성장시키고 5% _CO2로 37°C에서 20%의 태아 소 혈청과 1%의 항생제를 보충한다. 1 x ^105-2 × ¹⁰⁶ 세포/mL 사이의 세포 밀도를 유지합니다.
   2. (선택 사항) 2 x ¹⁰⁵ 셀/mL의 초기 밀도에서 1.25% DMSO를 함유하는 완전한 IMDM 배지에서 HL-60 셀을 분화한다. 5-6 일 동안 가장 활성화 될 세포를 배양한다.
   3. 세포 현탁액 및 원심분리기(200 x g, 3분)로부터 세포를 펠릿으로 샘플(1-2mL)을 채취한다.
   4. 배지를 제거하고 롤링 버퍼의 500 μL에서 셀을 부드럽게 다시 분리합니다. 셀룰러 이물질을 제거하기 위해 세척 단계를 두 번 반복합니다.
   5. 혈종계로 세포 밀도를 측정합니다. 압연 버퍼로 세포 펠릿을 2 x ¹⁰⁵ 세포/mL의 밀도로 재축합니다.
   6. 셀 서스펜션의 입구/콘센트 및 파이펫 40 μL에서 튜브를 조심스럽게 분리하여 유량 챔버로 연결합니다. 앞서 설명한 대로 튜브를 다시 연결하여 흐름 채널에 거품이 유입되지 않도록 합니다.
   7. 원하는 유량에서 주사기 펌프를 시작하여 셀 롤링 실험을 시작합니다.
      참고: 형광 트랙의 강도는 전단 응력에 따라 다르며, 낮은 세포 속도 전단 응력/세포 속도는 일반적으로 조광선(그림 4A)을 생성합니다. 분리 가능한 단일 셀 트랙을 보장하기 위해 표면의 높은 셀 밀도 또는 과도한 압연 지속 시간을 피하십시오(그림 4B, C).
   8. 세포 압연이 관찰되도록 10배 의 목표를 가진 암장 현미경을 사용합니다.
   9. 실험이 완료되면 표면이 셀프리가 될 때까지 100mL/h의 롤링 버퍼를 주입하여 채널에서 셀을 제거합니다.
3. "나노 스케일 지형에서 이미징을위한 DNA 기반 포인트 축적"(DNA-PAINT)에 의한 지역 트랙 이미징
   1. DNA 페인트 버퍼(0.05% Tween-20, 5m Tris, 75 mM _MgCl2, 1 mM EDTA)에 DNA-PAINT 이미저 가닥(500 pM)의 40μL을 추가합니다.
   2. 100x 오일 침지 TIRF 객관적렌즈를 사용하여 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 을 수행합니다. 전자곱충전장치(EMCCD) 카메라를 사용하여 300의 전자곱(EM) 게인에서 프레임당 25ms 노출 시간으로 400000+ 프레임을 획득합니다.
   3. Picasso 소프트웨어 ^package17 을 사용하여 5.3.4-5.3.5 단계에 따라 초해상도 이미지(그림 4D)를 현지화하고 렌더링합니다.
   4. DNA-PAINT 영화를 로컬라이제이시 프로그램에 로드하여 각 프레임의 각 플루오로포어의 현지화를 결정합니다.
      참고: 형광만 정확하게 추적할 때까지 상자 측면 길이와 최소 및 최소 그라데이션 매개 변수를 최적화합니다. 최소. 넷 그라데이션 매개 변수는 최적의 추적을 달성하기 위해 100000 이상을 초과할 수 있습니다. 맞춤 설정: MLE, 통합 가우시안 방법은 최상의 결과를 생성합니다. 마지막으로 동영상이 너무 길면 로컬화에서 미리 보기 추적이 제대로 작동하기 위해 10000 프레임의 스택으로 분할한 후 최종 HDf5 파일로 재조합합니다.
   5. 그런 다음 결과 HDf5 파일을 Render 프로그램에 로드하여 드리프트 보정 및 렌더링을 수행합니다.
      참고: 최종 결과를 개선하기 위해 RCC의 드리프트 해제 를 통해 여러 드리프트 보정을 수행합니다.
4. 영구 라벨링으로 긴 트랙 이미징
   1. T50M5 버퍼에서 영구 이미저 가닥을 추가하고 120s에 대한 인큐베이션을 추가합니다. 200 μL의 세척 버퍼를 주입하여 채널을 세척하십시오.
   2. 배경 카메라 소음을 얻기 위해 흥분 레이저끄기로 이미지를 기록합니다. TIRF 현미경 검사법에 의해 그리드 패턴의 넓은 영역을 이미지합니다.
      참고: 프레임 오버프레임 오버랩은 ≥10%의 오버랩을 후속 스티치에 권장합니다.
   3. 현미경을 프로그래밍하여 400 x 50 이미지(총 20000개의 이미지)를 스캔합니다. FIJI 프로그램을 사용하여 원시 데이터를 개별 tiff 파일로 분할하여 각각 최대 10000개의 이미지를 포함합니다.
   4. 5.4.5-5.4.7 단계에 따라 조명 프로파일(그림 3A-C)을 사용하여 모든 이미지를 병합합니다.
   5. 모든 프레임에서 배경 카메라 노이즈를 뺍니다. 모든 배경 빼기 프레임의 평균 스택 프로젝션(조명 프로파일)을 가져옵니다.
   6. 최대 값으로 조명 프로파일을 정규화합니다. 모든 배경 빼기 프레임을 정규화된 조명 프로파일로 나눕니다.
   7. 수정된 프레임을 해당 비트 깊이에 대해 적절한 범위로 다시 조정합니다.
   8. ^MIST18을 사용하여 이미지를 스티치합니다(그림 3D, E).

결과

위의 프로토콜은 접착 발자국 분석기의 실험 적 절차를 설명합니다. 일반적인 실험 워크플로우는 도 1, 유량 챔버 어셈블리(도 1A)에서 표면 기능화(도 1B) 및 실험 및 이미징 단계(도 1C)에 도시되어 있다.

도 2 는 ProtG-ssDNA 생체 경련 특성화에 대한 대표적인 결과입니...

토론

접착 발자국 분석은 세포 압연 접착 시 PSGL-1과 P-selectin 사이의 분자 접착 이벤트를 시각화할 수 있습니다. 이 과정은 P-selectin 매개 캡처에 의해 시작되며 유체 전단 응력하에서 압연됩니다. 실험 도중 잠재적인 문제점은 일반적으로 세포가 잘 굴러도 가난한 세포 압연 또는 누락된 형광 선트랙을 관련시킵니다. 이러한 문제는 문제 해결 테이블(표 1)에 나열된 프로토콜의 중요한 단계?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-channel drill guide	Custom made		3D printed with ABS filament
4-holes slide	Custom made		Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
Acetone	VWR	BDH1101-4LP
Acrylic spacer	Custom made		Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holder	Custom made		Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
Aminosilane	AlfaAesar	L14043	CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solution	Cytiva HyClone	SV3007901	Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyrene	Spherotech	PGP-60-5
Bovine serum albumin	VWR	332
Buffer, DNA PAINT			0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M5			10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, Rolling			HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash			10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chloride	VWR	BDH9224
Cell culture flasks	VWR	10062-868
Concentrated sulfuric acid	VWR	BDH3072-2.5LG	95-98%
Coverslip holding tweezers	Techni-Tool	758TW150
Diamond-coated drill bits	Abrasive technology	C5250510	0.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand)	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)	IDT DNA	Custom oligo	/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINT	IDT DNA	Custom oligo	GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labelling	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tape	Scotch	237	3/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTA	Thermofisher	15575020	0.5 M EDTA, pH 8.0
Epoxy	Gorilla	42001	5 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-085
GelGreen	Biotium	41005
Glacial acetic acid	VWR	BDH3094-2.5LG
Glass, Coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
Glass, Microscope slide	VWR	48300-026	75 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jar	VWR	74830-150	Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)	Lonza	04-315Q
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
Humidity chamber slide support	Custom made		3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxide	VWR	BDH7690-1	30%
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Inlets/outlets	Custom made		Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	Lonza	12-722F
Magnesium chloride	VWR	BDH9244
Magnetic Ni-NTA beads	Invitrogen	10103D
Mailer tubes	EMS	EMS71406-10
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns	Biorad	7326200	In SSC Buffer
PEG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
PEG-biotin	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxide	VWR	470302-132
Protein, Protein G	Abcam	ab155724	N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-Fc	R&D System	137-PS	Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, Streptavidin	Cedarlane	CL1005-01-5MG
Pump Syringe	Harvard Apparatus	704801
Sodium bicarbonate	Ward’s Science	470302-444
Sodium chloride	VWR	97061-274
Sulfo-SMCC	Thermofisher	22322
Syringe	Hamilton	81520	Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needles	BD	305115	Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris	VWR	BDH4502-500GP
Tubing, Adaptor	Tygon	ABW00001	Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, Polyethylene	BD Intramedic	427406	Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773