Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

Riepilogo

Questo protocollo presenta le procedure sperimentali per eseguire il test dell'impronta di adesione per visualizzare gli eventi di adesione durante l'adesione a laminazione rapida delle cellule.

Abstract

L'adesione a rotolamento, facilitata da interazioni mediate dalla selectina, è una motilità passiva altamente dinamica nel reclutamento di leucociti nel sito di infiammazione. Questo fenomeno si verifica nelle venule postcapillari, dove il flusso sanguigno spinge i leucociti in un movimento rotolante sulle cellule endoteliali. La laminazione stabile richiede un delicato equilibrio tra la formazione del legame di adesione e la loro dissociazione guidata meccanicamente, consentendo alla cella di rimanere attaccata alla superficie mentre rotola nella direzione del flusso. A differenza di altri processi di adesione che si verificano in ambienti relativamente statici, l'adesione di rotolamento è altamente dinamica poiché le celle di laminazione viaggiano su migliaia di micron a decine di micron al secondo. Di conseguenza, i metodi convenzionali di meccanobiologia come la microscopia della forza di trazione non sono adatti per misurare i singoli eventi di adesione e le forze molecolari associate a causa del breve lasso di tempo e dell'elevata sensibilità richiesta. Qui, descriviamo la nostra ultima implementazione del test dell'impronta di adesione per visualizzare le interazioni P-selectin: PSGL-1 nell'adesione rolling a livello molecolare. Questo metodo utilizza legami irreversibili di tensometro basati sul DNA per produrre una storia permanente di eventi di adesione molecolare sotto forma di tracce di fluorescenza. Queste tracce possono essere fotografate in due modi: (1) cucire insieme migliaia di immagini limitate alla diffrazione per produrre un ampio campo visivo, consentendo l'estrazione dell'impronta di adesione di ogni cellula di rotolamento su migliaia di micron di lunghezza, (2) eseguire DNA-PAINT per ricostruire immagini a super-risoluzione delle tracce di fluorescenza all'interno di un piccolo campo visivo. In questo studio, il test dell'impronta di adesione è stato utilizzato per studiare le cellule HL-60 che rotolano a diverse sollecitazioni di taglio. In tal modo, siamo stati in grado di visualizzare la distribuzione spaziale dell'interazione P-selectina: PSGL-1 e ottenere informazioni sulle loro forze molecolari attraverso l'intensità della fluorescenza. Pertanto, questo metodo fornisce le basi per l'indagine quantitativa delle varie interazioni cellula-superficie coinvolte nell'adesione a rotolamento a livello molecolare.

Introduzione

La cascata di adesione a rotolamento descrive come le cellule circolanti si legano e rotolano lungo la parete dei vasi ^sanguigni1. Il rotolamento passivo è mediato principalmente dalle selectine, una delle principali classi di molecole di adesione cellulare (CAM)¹. Sotto il flusso di taglio del sangue, i leucociti che esprimono il ligando-1 della glicoproteina P-selectina (PSGL-1) formano legami altamente transitori con la P-selectina, che possono essere espressi sulla superficie delle cellule endoteliali infiammate. Questo processo è fondamentale affinché i leucociti migrino verso un sito di ^{infiammazione2}. Inoltre, PSGL-1 è anche un recettore meccanosensibile in grado di innescare la successiva fase di adesione ferma della cascata di adesione rotolante al momento del suo impegno con P-selectina3.

Le mutazioni genetiche che influenzano la funzione CAM possono influenzare gravemente il sistema immunitario, come nella malattia rara del deficit di adesione leucocitaria (LAD), dove il malfunzionamento delle molecole di adesione che mediano il rolling porta a individui gravemente immunocompromessi4,5,6. Inoltre, è stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti migrano seguendo un processo di rotolamento simile, portando a ^metastasi7,8. Tuttavia, poiché il rotolamento cellulare è veloce e dinamico, i metodi convenzionali di meccanobiologia sperimentale non sono adatti per studiare le interazioni molecolari durante il rotolamento cellulare. Mentre i metodi di manipolazione a singola cellula e singola molecola come la microscopia a forza atomica e la pinzetta ottica sono stati in grado di studiare le interazioni molecolari come l'interazione forza-dipendente di P-selectina con PSGL-1 a livello di singola ^molecola9, non sono adatti per studiare eventi di adesione dal vivo durante il rotolamento cellulare. Inoltre, l'interazione caratterizzata in vitro non può rispondere direttamente alla domanda sull'adesione molecolare in vivo. Ad esempio, quale intervallo di tensione molecolare è biologicamente rilevante quando le cellule funzionano nel loro ambiente nativo? Metodi computazionali come la simulazione della dinamica ^adesiva10 o il semplice modello a stato ^{stazionario11} hanno catturato alcuni dettagli molecolari e il modo in cui influenzano il comportamento di rotolamento, ma dipendono fortemente dall'accuratezza dei parametri e delle ipotesi di modellazione. Altre tecniche come la microscopia a forza di trazione possono rilevare le forze durante la migrazione cellulare, ma non forniscono una risoluzione spaziale sufficiente o informazioni quantitative sulla tensione molecolare. Nessuna di queste tecniche può fornire osservazioni sperimentali dirette delle dinamiche temporali, della distribuzione spaziale e dell'eterogeneità di grandezza delle forze molecolari, che si riferiscono direttamente alla funzione e al comportamento delle cellule nel loro ambiente nativo.

Pertanto, l'implementazione di un sensore di forza molecolare in grado di misurare con precisione le interazioni selectin-mediate è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dell'adesione al rotolamento. Qui descriviamo il protocollo per il test dell'impronta di ^adesione12 in cui le perle rivestite di PSGL-1 vengono laminate su una superficie che presenta cavi di tensometro funzionalizzati p-selectin (TGT)¹³. Questi TGT sono sensori di forza irreversibili basati sul DNA che si traducono in una storia permanente di eventi di rottura sotto forma di lettura della fluorescenza. Ciò si ottiene attraverso la rottura del TGT (dsDNA) e quindi la successiva etichettatura del TGT rotto (ssDNA) con un filamento complementare marcato fluorescentemente. Uno dei principali vantaggi di questo sistema è la sua compatibilità sia con l'imaging a diffrazione limitata che con quella a super-risoluzione. Il filamento complementare marcato fluorescentemente può essere legato in modo permanente (>12 bp) per l'imaging limitato alla diffrazione o legato transitoriamente (7-9 bp) per l'imaging a super-risoluzione attraverso DNA PAINT. Questo è un sistema ideale per studiare l'adesione al rotolamento poiché i TGT si rompono durante la laminazione attiva, ma la lettura della fluorescenza viene analizzata dopo la laminazione. I due metodi di imaging offrono inoltre all'utente una maggiore libertà di indagare sull'adesione a rotolamento. In genere, l'imaging a diffrazione limitata è utile per estrarre la forza di rottura molecolare attraverso l'intensità di ^{fluorescenza13}, mentre l'imaging a super-risoluzione consente l'analisi quantitativa della densità del recettore. Con la capacità di studiare queste proprietà dell'adesione a rotolamento, questo approccio fornisce una piattaforma promettente per comprendere il meccanismo di regolazione della forza sull'adesione molecolare delle cellule di rotolamento sotto flusso di taglio.

Protocollo

1. Marcatura e ibridazione degli oligonucleotidi

1. Riduzione dei legami disolfuro della proteina G
   1. Sciogliere 10 mg di Proteina G (ProtG) in 1 mL di acqua ultrapura.
      NOTA: La proteina G qui è modificata con un singolo residuo di cisteina al C-terminus e un tag di poli-istidina N-terminus.
   2. Scambio tampone ≥20 μL di ProtG (10 mg/mL) in 1x PBS (pH 7,2) con una colonna P6.
   3. Misurare la concentrazione proteica dopo lo scambio tampone.
      NOTA: Concentrazione tipica di 7-8 mg/mL.
   4. Preparare 120 mM di Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) sciogliendo 3 mg di TCEP in 90 μL di 1x PBS (pH 7,2) seguiti da 10 μL di 0,5 M EDTA.
      NOTA: TCEP deve essere preparato al momento.
   5. Aggiungere 4 μL di 120 mM TCEP (480 nmol) a 20 μL di ProtG (4-5 nmol).
      NOTA: Mirare a un rapporto molare di ~ 100: 1 TCEP alle proteine.
   6. Lasciare procedere la reazione per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
   7. Rimuovere il TCEP in eccesso dal ProtG ridotto con una colonna P6 (tampone scambiato in 1x PBS, pH 7,2).
   8. Misurare la concentrazione del ProtG ridotto con uno spettrofotometro UV/Vis e salvare gli spettri.
      NOTA: Concentrazione tipica di 3,5-4,5 mg/ml.
2. Reazione ssDNA marcata con ammina con Sulfo-SMCC
   1. Sciogliere l'ssDNA (amine-ssDNA) etichettato con ammina in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 1 mM. Verificare la concentrazione del filamento con uno spettrofotometro UV/Vis.
   2. Preparare 11,5 mM di sulfo-SMCC (un reticolante etero-bifunzionale con estere sulfo-NHS e maleimmide) soluzione fresca sciogliendo 2 mg di sulfo-SMCC in 400 μL di acqua ultrapura e vortice da miscelare.
   3. Aggiungere 6 μL di 1 mM ammina-ssDNA (6 nmol) a 5,2 μL di 11,5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) e 88,8 μL di 1x PBS (pH 7,2). Vortice per 5 s seguito da centrifugazione a 8600 x g per 3 min.
   4. Lasciare procedere la reazione per 30 minuti a RT.
   5. Rimuovere l'eccesso di sulfo-SMCC dall'ammina-ssDNA coniugato SMCC (mal-ssDNA) con una colonna P6 (tampone scambiato in 1x PBS, pH 7.2).
   6. Misurare la concentrazione del mal-ssDNA con uno spettrofotometro UV/Vis e salvare gli spettri.
      NOTA: Concentrazione tipica di 35-45 μM.
3. Coniugazione ProtG-ssDNA
   1. Aggiungere 21 μL di ProtG ridotto da 4,5 mg/mL (3 nmol) al mal-ssDNA (~4-5 nmol).
      NOTA: volumi e concentrazioni qui sono valori tipici. Regolare in base alla misurazione sperimentale individuale. Assicurarsi sempre una quantità eccessiva di mal-ssDNA rispetto a ProtG con un rapporto di ~ 1,5: 1.
   2. Vortice per 5 s e lasciare che la reazione proceda per 3 ore a RT.
4. Purificazione e caratterizzazione del ProtG-ssDNA
   1. Purificare il ProtG-ssDNA coniugato attraverso l'isolamento his-tag con perle magnetiche di acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA).
   2. Rimuovere l'imidazolo in eccesso (tampone di eluizione Ni-NTA) dal prodotto con una colonna P6 (tampone scambiato in 1x PBS, pH 7,2).
      NOTA: Questo passaggio è essenziale per quantificare la coniugazione, poiché l'imidazolo ha un assorbimento significativo a 280 nm.
   3. Utilizzare uno spettrofotometro UV/Vis per registrare gli spettri del prodotto ProtG-ssDNA e il tampone di eluizione Ni-NTA (1x).
      NOTA: l'assorbanza tipica di ProtG-ssDNA a 260 nm e 280 nm è rispettivamente 0,8 e 0,6.
   4. Per determinare l'efficienza di coniugazione e il rapporto tra ProtG e ssDNA, utilizzare lo script MATLAB scritto su misura (Supplemental Coding File 1) per scomporre lo spettro di prodotti finali in base ai tre spettri raccolti in precedenza (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead elution buffer).
      NOTA: in breve, il codice funziona come descritto nei passaggi 1.4.5-1.4.8. La concentrazione tipica è di 4 μM di ProtG-ssDNA con ProtG e ssDNA in un rapporto molare ~1:1 (Figura 2A).
   5. Immettere ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead e gli spettri ProtG-ssDNA UV/Vis nello script MATLAB
   6. Eseguire una minimizzazione non lineare multidimensionale non vincolata per ricostruire gli spettri ProtG-ssDNA dagli spettri sorgente (spettri del buffer di eluizione di perline ProtG, SMCC e Ni-NTA)
      NOTA: la funzione di minimizzazione restituisce tre fattori di trasformazione, uno per ogni spettro di origine.
   7. Ricostruire gli spettri ProtG-ssDNA moltiplicando gli spettri per il loro fattore corrispondente e combinando gli spettri sorgente trasformati.
   8. Moltiplicare la concentrazione iniziale del filamento ProtG e SMCC per i corrispondenti fattori di trasformazione per determinare le concentrazioni di filamento SMCC e ProtG nel prodotto ProtG-ssDNA.
   9. (FACOLTATIVO) Eseguire PAGE nativo in base alla Figura 2B per garantire che ogni componente e passaggio funzioni come previsto.
5. Ibridazione TGT
   1. Ibridare ProtG-ssDNA (filamento superiore) con filamento inferiore biotinilato ad un rapporto molare di 1,2:1 con concentrazioni rispettivamente di 240 nM e 200 nM in tampone T50M5 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM _MgCl2) per ibridare l'intero costrutto TGT. Lascia ibridare a RT ≥1 h.

2. PEGilazione superficiale

1. Pulizia delle superfici
   1. Pulire un pallone Erlenmeyer e due barattoli di colorazione ogni 8 coverslips. Riempire ogni contenitore con 1 M KOH soluzione e sonicare per 1 ora a RT. Lavare accuratamente ogni contenitore con acqua ultrapura e asciugare con _N2 o in un forno.
      NOTA: riempire il KOH verso l'alto per toccare il coperchio, in modo che vengano puliti.
   2. Risciacquare accuratamente ogni coverslip con acqua ultrapura e metterli in uno dei barattoli di colorazione puliti.
      NOTA: Assicurarsi che non siano attaccati l'uno all'altro o alla parete dei barattoli di colorazione.
   3. In una cappa aspirante, preparare al momento una soluzione di piranha aggiungendo 30 ml di perossido di idrogeno (30%) a 90 ml di acido solforico concentrato (95%-98%) in un becher da 250 ml.
      ATTENZIONE: l'acido solforico concentrato è altamente corrosivo. Aggiungere il perossido di idrogeno molto lentamente all'acido solforico e ruotare accuratamente per mescolare.
   4. Immergere completamente le coperture nel barattolo di colorazione con la soluzione di piranha. Lasciare le coperture in piranha per 30 minuti nella cappa aspirante.
      ATTENZIONE: Raffreddare la soluzione di piranha a non più di 80 °C prima di versarla per evitare di rompere il barattolo di colorazione.
   5. Scartare la soluzione di piranha in un becher da 1000 ml e neutralizzare con 1 M KOH dalla pulizia del vetro.
   6. (FACOLTATIVO) Ripetere la pulizia del piranha (passaggi 2.1.3-2.1.5) con una soluzione di piranha fresca.
   7. Risciacquare le coperture con abbondanti quantità di acqua ultrapura per rimuovere tutta la soluzione residua di piranha. Agitare delicatamente il barattolo di colorazione durante ogni salita per facilitare la rimozione (si consigliano 10 risciacqui).
   8. Risciacquare le coperture con metanolo 3 volte per rimuovere l'acqua dalla superficie del coverslip e mantenere le coverslips immerse nel metanolo.
2. Silanizzazione superficiale
   1. Preparare una soluzione di aminosilano all'1% mescolando accuratamente 94 mL di metanolo, 1 mL di aminosilano e 5 ml di acido acetico glaciale nel matraccio Erlenmeyer pulito ed essiccato. Versare nel secondo barattolo di colorazione pulito e ^asciugato14.
   2. Trasferire le coperture immerse sotto la soluzione di metanolo nel barattolo di colorazione contenente soluzione di aminosilano all'1% e mantenere il barattolo coperto.
      NOTA: non lasciare asciugare i coperchi durante il trasferimento ad aminosilane per limitare l'esposizione della superficie del vetro all'aria.
   3. Incubare il barattolo di colorazione contenente coverslips in aminosilane per 1 ora a 70 °C in un ^forno15.
   4. Scartare con attenzione la soluzione di aminosilano in un contenitore separato per i rifiuti e risciacquare i coperchi nel barattolo di colorazione con metanolo 5 volte per rimuovere la soluzione di aminosilano.
   5. Risciacquare le coperture nel barattolo di colorazione con acqua ultrapura 5 volte e asciugarle con _N2.
   6. Cuocere le coperture essiccate nel barattolo di colorazione in forno a 110 °C per 20 minuti. Lasciare raffreddare i coverslip a RT, quindi posizionarli sul rack PEGylation.
      NOTA: Coprire il barattolo di colorazione con un coperchio durante la cottura per ridurre al minimo la deposizione particolare e chimica sulla ^superficie15.
3. Preparazione della soluzione PEG
   1. Scongelare PEG (Polietilenglicole) e PEG-biotina a RT per circa 30 min.
      NOTA: questo passaggio riduce al minimo la condensa di umidità che può degradare l'estere NHS su PEG.
   2. Fare tampone PEG aggiungendo 84 mg di bicarbonato di sodio a 10 ml di acqua ultrapura. Questa formulazione dovrebbe fornire un tampone a pH 8,4.
   3. Per 8 coverslip, ciascuno con un lato PEGilato con 20:1 PEG:PEG-biotina: misurare 100 mg di PEG e 5 mg di PEG-biotina da aggiungere a 400 μL di tampone PEG. Vortice la soluzione per 30 s e centrifuga per 1 min alla velocità massima (≥18000 x g).
      NOTA: Questo passaggio è sensibile al tempo, poiché l'idrolisi dell'estere SVA NHS inizia immediatamente e ha un'emivita di 34 minuti a pH 8,0, con un'emivita più breve a pH 8,4.
4. Incubazione PEG e stoccaggio coverslip
   1. Impostare la camera di umidità e posizionare i coperchi all'interno.
   2. Aggiungere 90 μL di soluzione PEG a un coverslip nella camera di umidità e posizionare un secondo coverslip sopra la soluzione PEG utilizzando una pinzetta coverslip per distribuire uniformemente la soluzione PEG.
   3. Assicurarsi che non ci siano bolle nella soluzione lasciata cadere sul coperchio. Abbassa un'estremità del secondo coverslip sul primo coverslip e rilascia lentamente l'altra estremità in modo che non ci siano bolle inserite tra le coverslip.
      NOTA: le bolle faranno sì che alcune aree siano scarsamente PEGilate.
   4. Ripeti fino a quando tutti i coverslip hanno PEG (cioè 8 coverslips = 4 sandwich PEG). Incubare le soluzioni PEG durante la notte (~12 h) a RT in una camera di umidità al ^buio16.
   5. Separare le coppie di coverslip e metterle in un barattolo di colorazione. Notate i lati PEGilati.
   6. Risciacquare accuratamente le coperture con acqua ultrapura e asciugare con _N2.
      NOTA: tenere le coperture con una pinzetta e soffiare _N2 sulla superficie verso la pinzetta per evitare che i contaminanti si secchino sulla superficie.
   7. Contrassegnare il lato non PEGilato con un punto in un angolo utilizzando un pennarello permanente o una penna diamantata.
   8. Posizionare 2 coverslip PEGylated in tubi mailer con i lati PEGylated uno di fronte all'altro per aiutare a identificare il lato PEGylated prima dell'uso.
   9. Aspirare il tubo per 5 minuti e riempire con _N2. Sigillare il tubo con parafilm.
   10. Conservare i coperchi PEGilati a -20 °C nei tubi sigillati per un massimo di 6 mesi.
       NOTA: riscaldare i tubi di stoccaggio su RT prima dell'assemblaggio del chip. La condensa sui coperchi durante la sigillatura causerà perdite.

3. Preparazione della camera di flusso

1. Assemblaggio chip
   1. Stendere sottilmente una piccola quantità di resina epossidica su entrambi i lati del nastro biadesivo con una lama di rasoio.
      NOTA: troppa resina epossidica può diffondersi nel canale durante l'assemblaggio.
   2. Tagliare al laser il nastro rivestito con resina epossidica per creare 4 canali. Creare il chip di flusso inserendo il nastro epossidico tra una slitta a 4 fori e un coperchio PEG (Figura 1A).
   3. Utilizzando una punta della pipetta, applicare una leggera pressione lungo la lunghezza dei canali per creare una buona tenuta. Curare la resina epossidica per ≥1 h.
      NOTA: Non tranciare il vetro per evitare di scivolare contro la resina epossidica.
2. Assemblaggio da camera
   1. Allineare il chip in modo che l'apertura di ciascun canale sia posizionata al centro dell'adattatore (Figura 1A). Posizionare due distanziali acrilici trasparenti sulla parte superiore del chip, applicare una pressione decisa al centro del blocco e avvitare due viti 4-40 alle estremità di ciascun distanziatore.
      NOTA: non forzare la vite o premere troppo forte sui distanziali, altrimenti il chip potrebbe rompersi.
   2. Dall'altra parte della staffa, avvitare le prese nei fori filettati. Monitorare le condizioni di tenuta attraverso il blocco acrilico trasparente.
   3. Quando il tubo entra in contatto con l'apertura del chip, sigillare la connessione ruotando delicatamente il tubo in senso orario.
      NOTA: le prese d'aria troppo strette possono causare il blocco del flusso, mentre i contatti allentati causeranno perdite.

4. Preparazione della superficie

NOTA: fare riferimento alla Figura 1B per il flusso di lavoro complessivo.

1. Agenti bloccanti per impedire il legame non specifico
   1. Utilizzare una pipetta per far fluire 200 μL di tampone di lavaggio (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM _MgCl2 e 2 mM _CaCl2, 0,05% Tween 20) nella camera per verificare la presenza di perdite. Se si formano bolle nel canale, spingere aggressivamente altri 200 μL per rimuovere le bolle.
      NOTA: le bolle d'aria di grandi dimensioni non rimosse in questa fase possono rimuovere e distruggere la funzionalizzazione della superficie in un secondo momento.
   2. Aggiungere 40 μL di BSA (1% p/v) alla camera di flusso per evitare legami non specifici e incubare per 10 minuti.
   3. Assicurarsi di aggiungere un volume sufficiente durante ogni periodo di incubazione per riempire le camere di flusso e formare goccioline alle entrate e alle uscite. Regolare i volumi di incubazione di conseguenza ed eseguire tutte le incubazioni in una camera di umidità.
   4. Aggiungere 40 μL di Tween 20 (5% v/v) alla camera di flusso. Incubare per 10 minuti per ridurre ulteriormente il legame non specifico.
   5. (FACOLTATIVO) Controllare la superficie per un'adeguata passivazione facendo scorrere perline di polistirolo attraverso il canale. Aggiungere 40 μL di perle di polistirene rivestite ProtG (0,01% p/v) e l'immagine utilizzando un microscopio darkfield con obiettivo 10x. Se le perline non aderiscono alla superficie, procedere al passaggio successivo.
   6. Lavare il canale con 200 μL di tampone di lavaggio per rimuovere tutti gli agenti di passivazione.
2. Funzionalizzazione della superficie della camera
   1. Aggiungere 40 μL di streptavidina (100 μg/mL) alla camera di flusso e incubare per 20 min. Quindi, lavare con 200 μL di tampone di lavaggio.
   2. Aggiungere 40 μL di ProtG-TGT ibridato (100 nM) alla camera di flusso e incubare per 20 min. Quindi, lavare con tampone di lavaggio da 200 μL.
   3. Aggiungere 40 μL di filo superiore ProtG-TGT (100 nM) per 20 minuti per completare qualsiasi filamento inferiore TGT non ibridato sulla superficie. Lavare con 200 μL di tampone di lavaggio.
   4. Aggiungere 40 μL di P-selectin-Fc (10 μg/mL) alla camera di flusso e incubare per 60 min. Quindi, lavare con 200 μL di tampone di lavaggio.
      NOTA: la durata dell'incubazione è fondamentale.

5. Esperimento e imaging

1. Configurazione del sistema di flusso
   1. Riempire una siringa di vetro da 5 mL con il tampone di rotolamento (HBSS con 2 mM _CaCl2, 2 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella siringa picchiettando i lati della siringa per rimuovere le bolle e spingendole fuori mentre galleggiano verso la punta.
   2. Inserire un ago sterile (26 G, 5/8 inch length) in un tubo di polietilene da ~200 mm (I.D: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) e collegare l'ago alla siringa di vetro.
      NOTA: assicurarsi che l'aria non sia intrappolata in alcun punto del connettore dell'ago.
   3. Fissare la siringa sulla pompa della siringa e inclinare la pompa della siringa in modo che il lato dello stantuffo sia sollevato per evitare che le bolle d'aria entrino nel canale. Inserire l'estremità del tubo nell'ingresso della camera di flusso.
      NOTA: Assicurarsi il contatto tra liquido e liquido quando si effettua il collegamento depositando goccioline sulle prese e avendo goccioline all'estremità del tubo della siringa. Assicurarsi che non entrino bolle d'aria nel canale lasciando che si formi una piccola goccia all'estremità del tubo della siringa prima di inserirla nell'ingresso.
   4. Inserire un'estremità di altri 200 mm del tubo di polietilene nell'uscita e l'altra estremità immersa in un becher di scarto.
2. Configurazione per la laminazione delle celle
   1. Coltiva cellule HL-60 in palloni di coltura ventilati da ^{25 cm2} in mezzi IMDM integrati con il 20% di siero bovino fetale e l'1% di antibiotici a 37 °C con il 5% di _CO2. Mantenere le densità cellulari tra 1 x ^105-2 × ¹⁰⁶ celle / mL.
   2. (FACOLTATIVO) Differenziare le celle HL-60 in un mezzo IMDM completo contenente l'1,25% di DMSO ad una densità iniziale di 2 x ¹⁰⁵ celle/ml. Incubare le cellule per essere più attive per 5-6 giorni.
   3. Prelevare un campione (1-2 ml) dalla sospensione cellulare e dalla centrifuga (200 x g, 3 min) per pellettare le celle.
   4. Rimuovere il mezzo e risospese delicatamente le celle in 500 μL del tampone di rotolamento. Ripetere la fase di lavaggio due volte per rimuovere i detriti cellulari.
   5. Misurare la densità cellulare con un emocitometro. Risospesare i pellet di cella con tampone di rotolamento ad una densità di 2 x ¹⁰⁵ celle/ml.
   6. Scollegare con attenzione il tubo dalle prese/uscite e dalla pipetta a 40 μL della sospensione cellulare nella camera di flusso. Ricollegare il tubo come descritto in precedenza, assicurarsi che non vengano introdotte bolle nel canale di flusso.
   7. Iniziare l'esperimento di laminazione cellulare avviando la pompa della siringa alle portate desiderate.
      NOTA: l'intensità delle tracce fluorescenti dipende dallo sforzo di taglio e lo sforzo di taglio a velocità della cella più bassa/ la velocità della cella produrranno generalmente tracce dimmer (Figura 4A). Evitare un'elevata densità di celle sulla superficie o un'eccessiva durata di rotolamento per garantire tracce monocellulari separabili (Figura 4B,C).
   8. Utilizzare un microscopio a campo scuro con un obiettivo 10x per garantire che si osservi il rotolamento cellulare.
   9. Una volta completato l'esperimento, rimuovere le celle dal canale infondendo il rolling buffer a 100 ml/h fino a quando la superficie non è priva di cellule.
3. Imaging di tracce locali mediante "DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography" (DNA-PAINT)
   1. Aggiungere 40 μL di filamento imager DNA-PAINT (500 pM) nel buffer DNA-PAINT (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM _MgCl2, 1 mM EDTA) al canale.
   2. Eseguire la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) utilizzando una lente tiRF a immersione in olio 100x. Acquisisci oltre 40000 fotogrammi con un tempo di esposizione di 25 ms per fotogramma con un guadagno di moltiplicazione degli elettroni (EM) di 300 utilizzando una fotocamera EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device).
   3. Utilizzare il pacchetto software ^Picasso17 per localizzare ed eseguire il rendering delle immagini a super-risoluzione (Figura 4D) seguendo i passaggi 5.3.4-5.3.5.
   4. Carica il filmato DNA-PAINT nel programma Localize per determinare la localizzazione di ciascun fluoroforo in ogni fotogramma.
      NOTA: ottimizzare la lunghezza del lato della scatola e i parametri del gradiente netto minimo fino a quando solo i fluorofori non vengono tracciati con precisione. Il parametro Net Gradient può spesso superare 100000 per ottenere un tracciamento ottimale. Fit setting: MLE, metodo gaussiano integrato produce il miglior risultato. Infine, se il filmato è troppo lungo, dividerlo in pile di 10000 fotogrammi in modo che il tracciamento dell'anteprima in Localize funzioni correttamente prima di ricombinarli in un file hdf5 finale.
   5. Quindi, caricare il file hdf5 risultante nel programma Render per eseguire la correzione della deriva e il rendering.
      NOTA: eseguire la correzione della deriva multipla tramite Undrift by RCC per migliorare il risultato finale.
4. Imaging di tracce lunghe mediante etichettatura permanente
   1. Aggiungere il filamento imager permanente e incubare per 120 s nel buffer T50M5. Lavare il canale infondendo 200 μL di tampone di lavaggio.
   2. Registrare un'immagine con il laser di eccitazione spento per ottenere il rumore di fondo della telecamera. Immagine di una vasta area in un modello a griglia mediante microscopia TIRF.
      NOTA: la sovrapposizione frame-over-frame di ≥10% è consigliata per le cuciture successive.
   3. Programmare il microscopio per eseguire la scansione dell'area di 400 x 50 immagini (20000 immagini in totale). Utilizzando il programma FIJI, dividere i dati grezzi in singoli file tiff, ciascuno contenente un massimo di 10000 immagini.
   4. Appiattire tutte le immagini utilizzando il profilo di illuminazione (Figura 3A-C) seguendo i passaggi 5.4.5-5.4.7.
   5. Sottraere il rumore di fondo della fotocamera da ogni fotogramma. Ottenete la proiezione media dello stack (profilo di illuminazione) di ogni fotogramma sottratto sullo sfondo.
   6. Normalizzare il profilo di illuminazione in base al suo valore massimo. Dividere ogni fotogramma sottratto dallo sfondo per il profilo di illuminazione normalizzato.
   7. Ridimensionare i fotogrammi corretti all'intervallo appropriato per la profondità di bit corrispondente.
   8. Utilizzare ^MIST18 per cucire le immagini (Figura 3D,E).

Risultati

Il protocollo di cui sopra descrive la procedura sperimentale del test dell'impronta di adesione. Il flusso di lavoro generale dell'esperimento è illustrato nella Figura 1, dall'assemblaggio della camera di flusso (Figura 1A) alla funzionalizzazione della superficie (Figura 1B) e alle fasi di esperimento e imaging (Figura 1C).

La Figura 2 è un ...

Discussione

Il test dell'impronta di adesione consente la visualizzazione degli eventi di adesione molecolare tra PSGL-1 e P-selectina durante l'adesione al rotolamento cellulare. Questo processo viene avviato mediante cattura mediata da P-selectina seguita da rotolamento sotto sforzo di taglio fluidico. I potenziali problemi durante l'esperimento di solito riguardano un cattivo rotolamento delle cellule o tracce fluorescenti mancanti anche quando le cellule rotolano bene. Questi problemi sono spesso il risultato di controlli di qua...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-channel drill guide	Custom made		3D printed with ABS filament
4-holes slide	Custom made		Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
Acetone	VWR	BDH1101-4LP
Acrylic spacer	Custom made		Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holder	Custom made		Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
Aminosilane	AlfaAesar	L14043	CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solution	Cytiva HyClone	SV3007901	Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyrene	Spherotech	PGP-60-5
Bovine serum albumin	VWR	332
Buffer, DNA PAINT			0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M5			10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, Rolling			HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash			10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chloride	VWR	BDH9224
Cell culture flasks	VWR	10062-868
Concentrated sulfuric acid	VWR	BDH3072-2.5LG	95-98%
Coverslip holding tweezers	Techni-Tool	758TW150
Diamond-coated drill bits	Abrasive technology	C5250510	0.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand)	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)	IDT DNA	Custom oligo	/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINT	IDT DNA	Custom oligo	GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labelling	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tape	Scotch	237	3/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTA	Thermofisher	15575020	0.5 M EDTA, pH 8.0
Epoxy	Gorilla	42001	5 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-085
GelGreen	Biotium	41005
Glacial acetic acid	VWR	BDH3094-2.5LG
Glass, Coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
Glass, Microscope slide	VWR	48300-026	75 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jar	VWR	74830-150	Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)	Lonza	04-315Q
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
Humidity chamber slide support	Custom made		3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxide	VWR	BDH7690-1	30%
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Inlets/outlets	Custom made		Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	Lonza	12-722F
Magnesium chloride	VWR	BDH9244
Magnetic Ni-NTA beads	Invitrogen	10103D
Mailer tubes	EMS	EMS71406-10
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns	Biorad	7326200	In SSC Buffer
PEG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
PEG-biotin	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxide	VWR	470302-132
Protein, Protein G	Abcam	ab155724	N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-Fc	R&D System	137-PS	Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, Streptavidin	Cedarlane	CL1005-01-5MG
Pump Syringe	Harvard Apparatus	704801
Sodium bicarbonate	Ward’s Science	470302-444
Sodium chloride	VWR	97061-274
Sulfo-SMCC	Thermofisher	22322
Syringe	Hamilton	81520	Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needles	BD	305115	Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris	VWR	BDH4502-500GP
Tubing, Adaptor	Tygon	ABW00001	Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, Polyethylene	BD Intramedic	427406	Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773