Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.

Resumo

A adesão de rolamento, facilitada por interações seletivas mediadas, é uma motilidade altamente dinâmica e passiva no recrutamento de leucócitos para o local da inflamação. Este fenômeno ocorre em venules pós-capilares, onde o fluxo sanguíneo empurra leucócitos em um movimento de rolamento sobre as células endoteliais. O rolamento estável requer um delicado equilíbrio entre a formação de vínculos de adesão e sua dissociação mecanicamente conduzida, permitindo que a célula permaneça presa à superfície enquanto rola na direção do fluxo. Ao contrário de outros processos de adesão que ocorrem em ambientes relativamente estáticos, a adesão é altamente dinâmica à medida que as células rolante viajam sobre milhares de mícrons a dezenas de mícrons por segundo. Consequentemente, métodos convencionais de mecanobiologia, como microscopia de força de tração, são inadequados para medir os eventos de adesão individual e as forças moleculares associadas devido à curta escala de tempo e alta sensibilidade necessária. Aqui, descrevemos nossa mais recente implementação do ensaio de pegada de adesão para imagem das interações P-selectin: PSGL-1 na adesão de rolamento no nível molecular. Este método utiliza amarras irreversíveis de medidor de tensão baseada em DNA para produzir uma história permanente de eventos de adesão molecular na forma de trilhas de fluorescência. Essas faixas podem ser imagens de duas maneiras: (1) costurando milhares de imagens limitadas à difração para produzir um grande campo de visão, permitindo a extração de pegada de adesão de cada célula rolante sobre milhares de mícrons de comprimento, (2) realizando DNA-PAINT para reconstruir imagens de super-resolução das faixas de fluorescência dentro de um pequeno campo de visão. Neste estudo, o ensaio de pegada de adesão foi utilizado para estudar células HL-60 rolando em diferentes estresses de tesoura. Ao fazê-lo, fomos capazes de imaginar a distribuição espacial da interação P-selectin: PSGL-1 e obter insights sobre suas forças moleculares através da intensidade da fluorescência. Assim, este método fornece as bases para a investigação quantitativa das diversas interações célula-superfície envolvidas na adesão de rolamento a nível molecular.

Introdução

A cascata de aderência rolando descreve como as células circulantes se amarram e rolam ao longo da parede do vaso sanguíneo1. O rolamento passivo é mediado principalmente por selectins, uma grande classe de moléculas de adesão celular (CAMs)1. Sob o fluxo de cisalhamento de sangue, leucócitos expressando ligante de glicoproteína P-selectin -1 (PSGL-1) formam ligações altamente transitórias com p-selectina, que podem ser expressas na superfície de células endoteliais inflamadas. Esse processo é fundamental para que os leucócitos migrem para um local de inflamação2. Além disso, o PSGL-1 também é um receptor mecanosensível capaz de desencadear o estágio subsequente de adesão firme da cascata de adesão rolando após seu engajamento com P-selectin3.

Mutações genéticas que afetam a função CAM podem afetar severamente o sistema imunológico, como na rara doença da deficiência de adesão leucócito (LAD), onde o mau funcionamento das moléculas de adesão que mediam o rolamento leva a indivíduos severamente imunocomprometidos4,5,6. Além disso, as células tumorais circulantes têm sido mostradas para migrar após um processo de rolagem semelhante, levando à metástase7,8. No entanto, como o rolamento celular é rápido e dinâmico, os métodos de mecanobiologia experimental convencionais são inadequados para estudar interações moleculares durante o rolamento celular. Embora métodos de manipulação de células únicas e moléculas únicas, como microscopia de força atômica e pinça óptica, foram capazes de estudar interações moleculares, como a interação dependente da força de P-selectin com o PSGL-1 no nível de molécula única9, eles são inadequados para investigar eventos de adesão ao vivo durante o rolamento celular. Além disso, a interação caracterizada in vitro não pode responder diretamente à pergunta sobre a adesão molecular in vivo. Por exemplo, que faixa de tensão molecular é biologicamente relevante quando as células estão funcionando em seu ambiente nativo? Métodos computacionais, como simulação de dinâmica adesiva10 ou modelo simples de estado estável11, capturaram certos detalhes moleculares e como influenciam o comportamento de rolamento, mas são altamente dependentes da precisão dos parâmetros e suposições de modelagem. Outras técnicas como microscopia de força de tração podem detectar forças durante a migração celular, mas não fornecem resolução espacial suficiente ou informações quantitativas sobre tensão molecular. Nenhuma dessas técnicas pode fornecer observações experimentais diretas da dinâmica temporal, distribuição espacial e heterogeneidade de magnitude das forças moleculares, que se relacionam diretamente com a função celular e o comportamento em seu ambiente nativo.

Portanto, implementar um sensor de força molecular capaz de medir com precisão interações seletivas mediadas é crucial para melhorar nossa compreensão da adesão de rolamento. Aqui, descrevemos o protocolo para o ensaio de pegada de adesão12 onde as contas revestidas psgl-1 são enroladas em uma superfície apresentando amarras de medidor de tensão funcionalizadas p-selectin (TGTs)13. Estes TGTs são sensores de força irreversíveis baseados em DNA que resultam em um histórico permanente de eventos de ruptura na forma de leitura de fluorescência. Isso é conseguido através da ruptura do TGT (dsDNA) e, em seguida, posterior rotulagem do TGT rompido (ssDNA) com uma cadeia complementar fluorescentemente rotulada. Uma grande vantagem deste sistema é sua compatibilidade com imagens limitadas à difração e super-resolução. O fio complementar fluorescente ou rotulado pode ser permanentemente vinculado (>12 bp) para imagens limitadas à difração ou vinculado transitoriamente (7-9 bp) para imagens de super-resolução através de TINTA DE DNA. Este é um sistema ideal para estudar a adesão de rolamento, pois os TGTs são rompidos durante o rolamento ativo, mas a leitura da fluorescência é analisada após a rolagem. Os dois métodos de imagem também proporcionam ao usuário mais liberdade para investigar a adesão em rolamento. Normalmente, a imagem limitada à difração é útil para extrair força de ruptura molecular através da intensidade da fluorescência13, enquanto a imagem de super-resolução permite a análise quantitativa da densidade do receptor. Com a capacidade de investigar essas propriedades de adesão de rolamento, essa abordagem fornece uma plataforma promissora para entender o mecanismo de regulação da força sobre a adesão molecular das células rolantes sob fluxo de cisalhamento.

Protocolo

1. Rotulagem e hibridização de oligonucleotídeos

  1. Redução de ligações de dissulfeto de proteína G
    1. Dissolva 10 mg de Proteína G (ProtG) em 1 mL de água ultrauso.
      NOTA: A proteína G aqui é modificada com um único resíduo de cisteína no C-terminus e uma tag N-terminus poly-histidine.
    2. Troca de buffer ≥20 μL de ProtG (10 mg/mL) em 1x PBS (pH 7.2) com uma coluna P6.
    3. Meça a concentração de proteína após a troca de tampão.
      NOTA: Concentração típica de 7-8 mg/mL.
    4. Prepare 120 mM Tris (2-carboxyethyl)fospfina (TCEP) dissolvendo 3 mg de TCEP em 90 μL de 1x PBS (pH 7.2) seguido por 10 μL de 0,5 M EDTA.
      NOTA: O TCEP deve estar recém-preparado.
    5. Adicione 4 μL de 120 mM TCEP (480 nmol) a 20 μL de ProtG (4-5 nmol).
      NOTA: Aponte para uma relação molar de ~100:1 TCEP para proteína.
    6. Permita que a reação prossiga por 30 minutos em temperatura ambiente (RT).
    7. Remova o excesso de TCEP do ProtG reduzido com uma coluna P6 (buffer trocado em 1x PBS, pH 7.2).
    8. Meça a concentração do ProtG reduzido com um espectrofotômetro UV/Vis e salve o espectro.
      NOTA: Concentração típica de 3,5-4,5 mg/mL.
  2. Reação ssDNA rotulada por amina com Sulfo-SMCC
    1. Dissolver ssDNA (amina-ssDNA) em água sem nuclease a uma concentração de 1 mM. Verifique a concentração do fio com um espectotúmetro UV/Vis.
    2. Prepare a solução de 11,5 mM sulfo-SMCC (um crosslinker hetero-bifunctional com ester sulfo-NHS e maleimide) fresca, dissolvendo 2 mg de sulfo-SMCC em 400 μL de água ultrapura e vórtice para misturar.
    3. Adicione 6 μL do amine-ssDNA de 1 mM (6 nmol) a 5,2 μL de 11,5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) e 88,8 μL de 1x PBS (pH 7.2). Vórtice para 5 s seguido de centrifugação a 8600 x g por 3 min.
    4. Permita que a reação prossiga por 30 min no RT.
    5. Remova o excesso de sulfo-SMCC do SMCC conjugado amine-ssDNA (mal-ssDNA) com uma coluna P6 (buffer trocado em 1x PBS, pH 7.2).
    6. Meça a concentração do mal-ssDNA com um espectrômetro UV/Vis e salve o espectro.
      NOTA: Concentração típica de 35-45 μM.
  3. Conjugação ProtG-ssDNA
    1. Adicione 21 μL de 4,5 mg/mL reduzido ProtG (3 nmol) ao mal-ssDNA (~4-5 nmol).
      NOTA: Volumes e concentrações aqui são valores típicos. Ajuste de acordo com a medição experimental individual. Certifique-se sempre de uma quantidade excessiva de mal-ssDNA sobre ProtG a uma proporção de ~1,5:1.
    2. Vórtice para 5 s e permitir que a reação prossiga por 3 h no RT.
  4. Purificação e caracterização protG-ssDNA
    1. Purifique o ProtG-ssDNA conjugado através do isolamento de sua tag com contas magnéticas de ácido níquel-nitrilotriactico (Ni-NTA).
    2. Remova o excesso de imidazol (tampão de eluição Ni-NTA) do produto com uma coluna P6 (buffer trocado em 1x PBS, pH 7.2).
      NOTA: Este passo é essencial para quantificar a conjugação, pois o imidazol tem absorção significativa a 280 nm.
    3. Use um espectrofotômetro UV/Vis para registrar o espectros do produto ProtG-ssDNA, bem como o buffer de elução Ni-NTA (1x).
      NOTA: A absorvância típica protG-ssDNA a 260 nm e 280 nm é 0,8 e 0,6, respectivamente.
    4. Para determinar a eficiência de conjugação e a razão do ProtG com o SSDNA, use o script MATLAB personalizado (Arquivo de Codificação Suplementar 1) para decompor o espectro final do produto com base nos três espectros coletados anteriormente (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead elution buffer).
      NOTA: Brevemente, o código funciona conforme descrito nas etapas 1.4.5-1.4.8. A concentração típica é de 4 μM de ProtG-ssDNA com ProtG e ssDNA a uma razão molar de ~1:1 (Figura 2A).
    5. Entrada ProtG, SMCC-strand, tampão de eluição de contas Ni-NTA e o espectro ProtG-ssDNA UV/Vis no script MATLAB
    6. Realize uma minimização não linear multidimensional para reconstruir o espectro protG-ssDNA a partir do espectro de origem (ProtG, SMCC-strand e Ni-NTA elution buffer spectra)
      NOTA: A função de minimização produz três fatores de transformação, um para cada espectro de origem.
    7. Reconstrua o espectro ProtG-ssDNA multiplicando o espectro pelo seu fator correspondente e combinando o espectro de origem transformado.
    8. Multiplique a concentração inicial do ProtG e do SMCC-strand pelos fatores de transformação correspondentes para determinar as concentrações de SMCC-strand e ProtG no produto ProtG-ssDNA.
    9. (OPCIONAL) Execute o PAGE nativo de acordo com a Figura 2B para ajudar a garantir que cada componente e passo funcione como esperado.
  5. Hibridização TGT
    1. Hibridize ProtG-ssDNA (fio superior) com fio inferior biotinína em uma relação molar de 1,2:1 com concentrações de 240 nM e 200 nM respectivamente no buffer T50M5 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) para hibridizar a construção TGT completa. Deixe hibridizar em RT ≥1 h.

2. Fgêria de superfície

  1. Limpeza de superfície
    1. Limpe um frasco de Erlenmeyer e dois frascos de coloração para cada 8 tampas. Encha cada recipiente com solução KOH de 1 M e sonicate por 1 h na RT. Lave completamente cada recipiente com água ultrapura e seque com N2 ou em um forno.
      NOTA: Encha o KOH até a parte superior para tocar na tampa, para que eles também sejam limpos.
    2. Enxágue minuciosamente cada mancha com água ultrapura e coloque-as em um dos frascos de coloração limpos.
      NOTA: Certifique-se de que eles não estão presos uns aos outros ou à parede dos frascos de coloração.
    3. Em um capô de fumaça, prepare recentemente uma solução de piranha adicionando 30 mL de peróxido de hidrogênio (30%) a 90 mL de ácido sulfúrico concentrado (95%-98%) em um béquer de 250 mL.
      ATENÇÃO: O ácido sulfúrico concentrado é altamente corrosivo. Adicione o peróxido de hidrogênio muito lentamente ao ácido sulfúrico e gire cuidadosamente para misturar.
    4. Submergir totalmente as tampas no frasco de coloração com a solução piranha. Deixe tampas em piranha por 30 minutos no capô da fumaça.
      ATENÇÃO: Esfrie a solução de piranha a não mais de 80 °C antes de derramar para evitar quebrar o frasco de coloração.
    5. Descarte a solução de piranha em um béquer de 1000 mL e neutralize com o KOH de 1 M da limpeza de vidro.
    6. (OPCIONAL) Repita a limpeza da piranha (etapas 2.1.3-2.1.5) com uma solução de piranha fresca.
    7. Enxágüe as tampas com quantidades abundantes de água ultrapura para remover toda a solução residual de piranha. Agite suavemente o frasco de coloração durante cada elevação para facilitar a remoção (10 enxágues são recomendadas).
    8. Enxágüe as tampas com metanol 3 vezes para remover a água da superfície da mancha e manter as tampas submersas em metanol.
  2. Silanização superficial
    1. Prepare uma solução de 1% de aminosilano misturando completamente 94 mL de metanol, 1 mL de aminosilano e 5 mL de ácido acético glacial no frasco erlenmeyer limpo e seco. Despeje no segundo frasco de coloração limpo e seco14.
    2. Transfira as tampas submersas sob a solução de metanol para o frasco de coloração contendo 1% de solução de aminosilano e mantenha o frasco coberto.
      NOTA: Não permita que as tampas sequem durante a transferência para aminosilano para limitar a exposição da superfície do vidro ao ar.
    3. Incubar o frasco de coloração contendo manchas em aminosilano por 1h a 70 °C em um forno15.
    4. Descarte cuidadosamente a solução de aminosilano em um recipiente de resíduos separado e enxágue as tampas no frasco de coloração com metanol 5 vezes para remover a solução de aminosilano.
    5. Enxágüe as tampas no frasco de coloração com água ultrauso 5 vezes e seque-as com N2.
    6. Asse as tampas secas no frasco de coloração em um forno a 110 °C por 20 min. Deixe as tampas esfriarem para RT e coloque-as no rack PEGylation.
      NOTA: Cubra o frasco de coloração com uma tampa durante o cozimento para minimizar a deposição específica e química na superfície15.
  3. Preparação da solução PEG
    1. Degelo PEG (Polietileno glicol) e PEG-biotina para RT por cerca de 30 min.
      NOTA: Esta etapa minimiza a condensação da umidade que pode degradar o éster NHS em PEG.
    2. Faça o buffer PEG adicionando 84 mg de bicarbonato de sódio a 10 mL de água ultrapura. Esta formulação deve fornecer um buffer em pH 8.4.
    3. Para 8 tampas, cada um com um lado PEGylated com 20:1 PEG:PEG-biotina: medir 100 mg de PEG e 5 mg de PEG-biotina para adicionar a 400 μL de tampão PEG. Vórtice a solução para 30 s e centrífuga por 1 min na velocidade máxima (≥18000 x g).
      NOTA: Este passo é sensível ao tempo, pois a hidrólise SVA NHS-ér começa imediatamente e tem uma meia-vida de 34 min no pH 8.0, com uma meia-vida mais curta em pH 8.4.
  4. Incubação peg e armazenamento de deslizamentos
    1. Configure a câmara de umidade e coloque as tampas dentro.
    2. Adicione 90 μL de solução PEG a um deslizamento de cobertura na câmara de umidade e coloque um segundo deslizamento de cobertura em cima da solução PEG usando pinças de retenção de tampas para espalhar uniformemente a solução PEG.
    3. Certifique-se de que não há bolhas na solução lançadas na tampa. Abaixe uma extremidade da segunda tampa no primeiro deslizamento de cobertura e solte lentamente a outra extremidade para que não haja bolhas entre as tampas.
      NOTA: As bolhas farão com que certas áreas sejam mal-traduzidas.
    4. Repita até que todas as tampas tenham PEG (ou seja, 8 tampas = 4 sanduíches PEG). Incubar as soluções PEG durante a noite (~12 h) em RT em uma câmara de umidade no escuro16.
    5. Separe os pares de deslizamentos e coloque-os em um frasco de coloração. Observe os lados PEGylated.
    6. Enxágüe bem as tampas com água ultrauso e seque com N2.
      NOTA: Segure as tampas com pinças e sopre N2 através da superfície em direção à pinça para evitar que os contaminantes sequem na superfície.
    7. Marque o lado não-PEGylated com um ponto em um canto usando um marcador permanente ou uma caneta de diamante.
    8. Coloque 2 tampas pegylated em tubos de mailer com os lados PEGylated voltados uns para os outros para ajudar a identificar o lado PEGylated antes de usar.
    9. Aspire o tubo por 5 minutos e enchimento com N2. Sele o tubo com parafilme.
    10. Armazene as tampas PEGylated a -20 °C nos tubos de mailer selados por até 6 meses.
      NOTA: Aqueça os tubos de armazenamento para RT antes do conjunto do chip. A condensação nas tampas durante a vedação causará vazamento.

3. Preparação da câmara de fluxo

  1. Montagem de chips
    1. Espalhe finamente uma pequena quantidade de epóxi em ambos os lados de fita dupla face com uma lâmina de barbear.
      NOTA: Muito epóxi pode se espalhar para o canal durante a montagem.
    2. Corte a laser a fita revestida de epóxi para criar 4 canais. Crie o chip de fluxo sanduitando a fita epóxi entre um slide de 4 buracos e uma tampa PEG (Figura 1A).
    3. Usando uma ponta de pipeta, aplique uma pressão suave ao longo do comprimento dos canais para criar uma boa vedação. Cure o epóxi por ≥1 h.
      NOTA: Não corte o vidro para evitar deslizar contra o epóxi.
  2. Assembleia da Câmara
    1. Alinhe o chip para que a abertura de cada canal esteja posicionada nos centros do adaptador (Figura 1A). Coloque dois espaçadores acrílicos transparentes em cima do chip, aplique pressão firme no meio do bloco e enrosque em dois parafusos 4-40 nas extremidades de cada espaçador.
      NOTA: Não force o parafuso ou pressione muito forte os espaçadores, ou o chip pode quebrar.
    2. Do outro lado do suporte, aparar as entradas nos orifícios roscados. Monitore a condição de vedação através do bloco acrílico transparente.
    3. À medida que a tubulação faz contato com a abertura do chip, sele a conexão torcendo suavemente o tubo no sentido horário.
      NOTA: Entradas sobrenques podem causar bloqueio de fluxo, enquanto contatos soltos causarão vazamento.

4. Preparação da superfície

NOTA: Consulte a Figura 1B para o fluxo de trabalho global.

  1. Bloqueando agentes para evitar vinculação inespecífica
    1. Use uma pipeta para fluir 200 μL de tampão de lavagem (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 e 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) na câmara para verificar se há vazamento. Se as bolhas se formarem no canal, empurre agressivamente mais 200 μL para remover as bolhas.
      NOTA: Grandes bolhas de ar não removidas nesta etapa podem desalojar e destruir a funcionalização da superfície mais tarde.
    2. Adicione 40 μL de BSA (1% w/v) à câmara de fluxo para evitar a vinculação inespecífica e incubar por 10 minutos.
    3. Certifique-se de adicionar volume suficiente durante cada período de incubação para preencher as câmaras de fluxo e formar gotículas nas entradas e tomadas. Ajuste os volumes de incubação em conformidade e realize todas as incubações em uma câmara de umidade.
    4. Adicione 40 μL de Tween 20 (5% v/v) à câmara de fluxo. Incubar por 10 minutos para reduzir ainda mais a ligação inespecífica.
    5. (OPCIONAL) Verifique se a superfície está em busca de passivação adequada, fluindo contas de poliestireno através do canal. Adicione 40 μL de contas de poliestireno revestidas protG (0,01% w/v) e imagem usando um microscópio de campo escuro com objetivo de 10x. Se as contas não aderirem à superfície, prossiga para o próximo passo.
    6. Lave o canal com 200 μL de tampão de lavagem para remover todos os agentes de passivação.
  2. Funcionalização da superfície da câmara
    1. Adicione 40 μL de streptavidina (100 μg/mL) à câmara de fluxo e incubar por 20 minutos. Em seguida, lave com 200 μL de tampão de lavagem.
    2. Adicione 40 μL de ProtG-TGT hibridizado (100 nM) à câmara de fluxo e incubar por 20 minutos. Em seguida, lave com 200 μL de tampão de lavagem.
    3. Adicione 40 μL de fio superior ProtG-TGT (100 nM) por 20 minutos para completar qualquer fio inferior TGT não higiênica na superfície. Lave com 200 μL de tampão de lavagem.
    4. Adicione 40 μL de P-selectin-Fc (10 μg/mL) à câmara de fluxo e incubar por 60 minutos. Em seguida, lave com 200 μL de tampão de lavagem.
      NOTA: A duração da incubação é crítica.

5. Experimento e imagem

  1. Configuração do sistema de fluxo
    1. Encha uma seringa de vidro de 5 mL com o tampão de rolamento (HBSS com 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa tocando os lados da seringa para desalojar as bolhas e empurrando-as para fora enquanto flutuam em direção à ponta.
    2. Insira uma agulha estéril (26 G, 5/8 Polegadas de Comprimento) em um ~200 mm de tubos de polietileno (I.D: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) e conecte a agulha à seringa de vidro.
      NOTA: Certifique-se de que nenhum ar está preso em qualquer lugar do conector da agulha.
    3. Fixar a seringa na bomba de seringa e inclinar a bomba de seringa de tal forma que o lado do êmbolo seja elevado para evitar que bolhas de ar entrem no canal. Insira a extremidade do tubo na entrada da câmara de fluxo.
      NOTA: Certifique-se de contato líquido ao líquido ao fazer a conexão depositando gotículas nas entradas e tendo gotículas no final da tubulação de seringa. Certifique-se de que não entrem no canal permitindo que uma pequena gota se forme na extremidade da tubulação de seringa antes de inseri-la na entrada.
    4. Insira uma extremidade de outras 200 mm da tubulação de polietileno na tomada, e a outra extremidade submersa em um béquer de resíduo.
  2. Configuração para rolagem de células
    1. Cultivar células HL-60 em frascos de cultura ventilada de 25 cm2 em mídia IMDM complementadas com soro bovino fetal de 20% e 1% antibióticos a 37 °C com 5% de CO2. Manter densidades celulares entre 1 x 105-2 × 106 células/mL.
    2. (OPCIONAL) Diferencie as células HL-60 em um meio IMDM completo contendo 1,25% DMSO a uma densidade inicial de 2 x 105 células/mL. Incubar células para serem mais ativas por 5-6 dias.
    3. Pegue uma amostra (1-2 mL) da suspensão celular e centrífuga (200 x g, 3 min) para pelotizar as células.
    4. Remova o meio e resuspenque suavemente as células em 500 μL do buffer de rolamento. Repita o passo de lavagem duas vezes para remover detritos celulares.
    5. Meça a densidade celular com um hemócito. Resuspengem as pelotas celulares com tampão de rolamento a uma densidade de 2 x 105 células/mL.
    6. Desconecte cuidadosamente o tubo das entradas/saída e a pipeta de 40 μL da suspensão da célula na câmara de fluxo. Reconecte a tubulação como descrito anteriormente, certifique-se de que não sejam introduzidas bolhas no canal de fluxo.
    7. Inicie o experimento de rolagem celular iniciando a bomba de seringa nas taxas de fluxo desejadas.
      NOTA: A intensidade das faixas fluorescentes depende do estresse da tesoura, e a velocidade do corte de velocidade celular/velocidade celular mais baixa geralmente produzirá faixas mais fracas (Figura 4A). Evite alta densidade celular na superfície ou duração excessiva do rolamento para garantir faixas de célula única separáveis (Figura 4B,C).
    8. Use um microscópio de campo escuro com um objetivo de 10x para garantir que o rolamento celular seja observado.
    9. Uma vez que o experimento seja concluído, remova as células do canal infundindo o tampão de rolamento a 100 mL/h até que a superfície esteja livre de células.
  3. Imagens locais de imagens por "Acúmulo de Ponto baseado em DNA para imagem em topografia nanoescala" (DNA-PAINT)
    1. Adicione 40 μL de fio de imager DNA-PAINT (500 pM) no buffer DNA-PAINT (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) ao canal.
    2. Realize a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) utilizando uma lente objetiva TIRF de imersão a óleo de 100x. Adquira mais de 4000 quadros com tempo de exposição de 25 ms por período a um ganho de 300 em que se multiplicam de elétrons (EMCCD).
    3. Use o pacote de software Picasso17 para localizar e renderizar as imagens de super-resolução (Figura 4D) seguindo as etapas 5.3.4-5.3.5.
    4. Carregue o filme DNA-PAINT no programa Localize para determinar a localização de cada fluoróforo em cada quadro.
      NOTA: Otimize o comprimento lateral da caixa e os parâmetros de Gradiente Líquido Min. até que apenas fluoroforos sejam rastreados com precisão. Min. O parâmetro de gradiente líquido pode muitas vezes ultrapassar 100000 para alcançar o rastreamento ideal. Ajuste: MLE, o método gaussiano integrado produz o melhor resultado. Por fim, se o filme for muito longo, divida-o em pilhas de 10000 quadros para que o rastreamento de visualização no Localize funcione corretamente antes de recombiná-los em um arquivo hdf5 final.
    5. Em seguida, carregue o arquivo HDF5 resultante no programa Render para executar a correção e a renderização de deriva.
      NOTA: Execute correção de deriva múltipla via Undrift by RCC para melhorar o resultado final.
  4. Imagens longas de faixas por rotulagem permanente
    1. Adicione o fio imager permanente e incubar por 120 s no buffer T50M5. Lave o canal infundindo 200 μL de tampão de lavagem.
    2. Grave uma imagem com o laser de excitação desligado para obter ruído de câmera de fundo. Imagem uma grande área em um padrão de grade pela microscopia TIRF.
      NOTA: A sobreposição de quadro sobre quadro de ≥10% é recomendada para a costura subsequente.
    3. Programe o microscópio para digitalizar a área de 400 x 50 imagens (20000 imagens no total). Usando o programa FIJI, divida dados brutos em arquivos de tiff individuais, cada um contendo um máximo de 10000 imagens.
    4. Achate todas as imagens usando o perfil de iluminação (Figura 3A-C) seguindo as etapas 5.4.5-5.4.7.
    5. Subtraia o ruído da câmera de fundo de cada quadro. Obtenha a projeção média da pilha (perfil de iluminação) de cada quadro subtraído em segundo plano.
    6. Normalize o perfil de iluminação pelo seu valor máximo. Divida cada quadro subtraído de fundo pelo perfil de iluminação normalizado.
    7. Redimensione os quadros corrigidos para a faixa apropriada para a profundidade de bit correspondente.
    8. Use MIST18 para costurar as imagens (Figura 3D,E).

Resultados

O protocolo acima descreve o procedimento experimental do ensaio de pegada de adesão. O fluxo de trabalho do experimento geral é ilustrado na Figura 1, desde a montagem da câmara de fluxo (Figura 1A) até a funcionalização da superfície (Figura 1B) e etapas de experimento e imagem (Figura 1C).

A Figura 2 é um resultado representativo para ...

Discussão

O ensaio de pegada de adesão permite a visualização dos eventos de adesão molecular entre PSGL-1 e P-selectin durante a adesão ao rolamento celular. Este processo é iniciado por captura mediada por P-selectin seguido de rolagem sob estresse fluido de tesoura. Problemas potenciais durante o experimento geralmente envolvem más rolamentos celulares ou rastros fluorescentes ausentes mesmo quando as células rolam bem. Esses problemas muitas vezes são resultantes de controles de qualidade nas etapas críticas do proto...

Divulgações

Os autores não declaram conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Inovação do Canadá (CFI 35492), Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) e a University of British Columbia Emin Fund.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
4-channel drill guideCustom made3D printed with ABS filament
4-holes slideCustom madeDrill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
AcetoneVWRBDH1101-4LP
Acrylic spacerCustom madeCut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holderCustom madeMachine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
AminosilaneAlfaAesarL14043CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solutionCytiva HyCloneSV3007901Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyreneSpherotechPGP-60-5
Bovine serum albuminVWR332
Buffer, DNA PAINT0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M510mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, RollingHBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chlorideVWRBDH9224
Cell culture flasksVWR10062-868
Concentrated sulfuric acidVWRBDH3072-2.5LG95-98%
Coverslip holding tweezersTechni-Tool758TW150
Diamond-coated drill bitsAbrasive technologyC52505100.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand)IDT DNACustom oligoCCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)IDT DNACustom oligo/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINTIDT DNACustom oligoGAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labellingIDT DNACustom oligoCCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tapeScotch2373/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTAThermofisher155750200.5 M EDTA, pH 8.0
EpoxyGorilla420015 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-085
GelGreenBiotium41005
Glacial acetic acidVWRBDH3094-2.5LG
Glass, CoverslipsFisher Scientific12-548-5P
Glass, Microscope slideVWR48300-02675 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jarVWR74830-150Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)Lonza04-315Q
HemocytometerSigma-AldrichZ359629-1EA
HL-60 cellsATCCCCL-240
Humidity chamber slide supportCustom made3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxideVWRBDH7690-130%
ImidazoleSigma-AldrichI2399
Inlets/outletsCustom madeDrill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)Lonza12-722F
Magnesium chlorideVWRBDH9244
Magnetic Ni-NTA beadsInvitrogen10103D
Mailer tubesEMSEMS71406-10
MethanolVWRBDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel ColumnsBiorad7326200In SSC Buffer
PEGLaysan BioMPEG-SVA-5000
PEG-biotinLaysan BioBiotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxideVWR470302-132
Protein, Protein GAbcamab155724N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-FcR&D System137-PSRecombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, StreptavidinCedarlaneCL1005-01-5MG
Pump SyringeHarvard Apparatus704801
Sodium bicarbonateWard’s Science470302-444
Sodium chlorideVWR97061-274
Sulfo-SMCCThermofisher22322
SyringeHamilton81520Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needlesBD305115Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEPSigma-AldrichC4706-2G
TrisVWRBDH4502-500GP
Tubing, AdaptorTygonABW00001Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, PolyethyleneBD Intramedic427406Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20Sigma-Aldrich93773

Referências

  1. McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
  4. Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
  5. van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
  6. Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
  7. Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
  8. Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
  9. Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
  10. Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
  11. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
  12. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
  13. Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
  14. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
  15. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  16. Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  17. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  18. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
  19. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  20. Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
  21. Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
  22. Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
  23. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  24. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

BiologiaQuest o 175ades o de rolamentoleuc citoselectinaligand 1 de glicoprote na p selectin PSGL 1sensor de for a molecularensaio de pegada de ader nciatether medidor de tens o TGTac mulo de ponto baseado em DNA para imagem em topografia nanoescala DNA PAINT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados