التحليل المكاني الزماني الآلي ثنائي الأبعاد لمجسات FRET أحادية الجزيء المتنقلة

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة للتحليل المكاني الزماني للمجسات المتنقلة أحادية الجزيء Förster القائمة على نقل الطاقة بالرنين (smFRET) باستخدام المجهر الفلوري واسع المجال. تسمح مجموعة أدوات البرامج المطورة حديثا بتحديد آثار الوقت smFRET للمجسات المتحركة ، بما في ذلك كفاءة FRET الصحيحة والمواقع الجزيئية ، كوظائف للوقت.

Abstract

نقل طاقة الرنين Förster أحادي الجزيء (smFRET) هي تقنية متعددة الاستخدامات للإبلاغ عن المسافات في نطاق ما دون النانومتر إلى النانومتر. وقد تم استخدامه في مجموعة واسعة من التجارب البيولوجية الفيزيائية الحيوية والجزيئية ، بما في ذلك قياس القوى الجزيئية ، وتوصيف الديناميكيات التوافقية للجزيئات الحيوية ، ومراقبة التوطين المشترك داخل الخلايا للبروتينات ، وتحديد أوقات التفاعل بين المستقبلات والروابط. في تكوين الفحص المجهري واسع المجال ، يتم إجراء التجارب عادة باستخدام مجسات مثبتة على السطح. هنا ، يتم تقديم طريقة تجمع بين تتبع الجزيء الواحد مع تجارب smFRET للإثارة بالتناوب (ALEX) ، مما يسمح باكتساب آثار زمنية smFRET للتحقيقات السطحية ، ولكن المتنقلة في أغشية البلازما أو الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة بالزجاج. ولتحليل البيانات المسجلة، تم تطوير مجموعة برمجيات آلية مفتوحة المصدر تدعم (أ) توطين إشارات الفلورسنت، (ب) تتبع الجسيمات المفردة، (ج) تحديد الكميات المتعلقة ب FRET بما في ذلك عوامل التصحيح، (د) التحقق الصارم من آثار smFRET، و (ت) العرض البديهي للنتائج. يمكن استخدام البيانات التي تم إنشاؤها بسهولة كمدخلات لمزيد من الاستكشاف عبر برامج متخصصة ، على سبيل المثال ، لتقييم السلوك المنتشر للمجسات أو التحقيق في انتقالات FRET.

Introduction

كان نقل طاقة الرنين Förster (FRET) محركا رئيسيا في البحوث البيولوجية الجزيئية والبيوفيزيائية ، لأنه يسمح بالتحقيق في العمليات بدقة أقل من النانومتر. نظرا لأن كفاءة نقل الطاقة بين الفلوروفورات المانحة والمتقبلة تعتمد بشدة على المسافة بين الصبغات في نطاق ما دون النانومتر إلى النانومتر ، فقد تم استخدامه بفعالية كمسطرة طيفية لاستكشاف التشكيل الثابت والديناميكي للجزيئات ^{الحيوية1،2،3،4}. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام ظاهرة FRET على نطاق واسع لدراسات التوطين المشترك للبروتينات المرتبطة بالأغشية وداخل الخلايا على مستوى الجزء ^{الأكبر5,6}. وفي العقدين الماضيين، تم تكييف هذه الطريقة لرصد أحداث smFRET7، مما ساعد على زيادة الاستبانة الزمنية والمكانية بشكل كبير وحل حتى المجموعات الفرعية النادرة في عينات غير متجانسة. وبفضل هذه التقنيات، تم اكتساب رؤى فريدة في ديناميكيات الآلات الجزيئية مثل معدل معالجة النسخ لبوليميراز الحمض النووي الريبي ^II8، وسرعة تكرار بوليميراز الحمض ^{النووي9،10}، ومعدل نقل النيوكليوسوم11، وربط النسخ ومعدل توقف الوصلات ^{المجمعة12}، ونشاط المجموعات الفرعية الريبوسومية13، وسرعة المشي لمحركات ^{كينسين14} ، على سبيل المثال لا الحصر. تم تحديد مدد التفاعل بين المستقبلات ^{والرباط15} والقوى ^{الجزيئية16} كميا.

تعتمد دراسات smFRET القائمة على الكثافة عادة على الانبعاثات الحساسة لقياس كفاءة FRET: يفصل مقسم الحزم في مسار الانبعاث مكانيا الضوء الناشئ عن الفلوروفورات المانحة والمتقبلة عند إثارة المتبرع ، مما يسمح بتحديد كمية كثافة التألق الفردية. يمكن حساب الكفاءة لاحقا على أنها جزء الفوتونات المنبعثة من المتقبل فيما يتعلق بإجمالي عدد ^{الفوتونات17}. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح إثارة المتقبل بعد إثارة المتبرع (ALEX) بقياس قياس stoichiometry لأحداث FRET ، مما يساعد في التمييز بين إشارات FRET المنخفضة الحقيقية من الإشارات الناشئة ، على سبيل المثال ، من المجسات التي تتميز بفلوروفور متقبل مبيض ^ضوئيا18.

عادة ما يتم إجراء تجارب FRET أحادية الجزيء بإحدى طريقتين. أولا ، يتم إضاءة منطقة صغيرة في حجم العينة باستخدام المجهر البؤري. يتم إثارة جزيئات المسبار الواحد في المحلول عندما يحدث انتشارها داخل الحجم البؤري. باستخدام هذه التقنية ، يمكن استخدام كاشفات عد الفوتونات السريعة ، مما يتيح دقة زمنية دون الميكروثانية. ثانيا، يتم تثبيت المجسات على وجه التحديد على الأسطح ومراقبتها عبر الفحص المجهري واسع النطاق، وغالبا ما تستخدم تكوين الانعكاس الداخلي الكلي (TIR) لتقليل تألق الخلفية. يسمح تجميد المسبار بأوقات تسجيل أطول بكثير من استخدام النهج الأول. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح مجال الرؤية الأكبر بمراقبة مجسات متعددة بالتوازي. الحاجة إلى كاميرا تجعل هذه الطريقة بطيئة مقارنة بالطريقة الموضحة أعلاه. تقتصر دقة الوقت على المللي ثانية إلى النطاق الثاني.

إذا كانت هناك حاجة إلى آثار طويلة الأمد ، على سبيل المثال ، لدراسة العمليات الديناميكية على مقياس زمني من مللي ثانية إلى ثانية ، فإن الطريقة الأولى غير قابلة للتطبيق ، لأن انفجارات التألق عادة ما تكون قصيرة جدا. يفشل النهج الثاني عندما يكون التجميد غير ممكن ، على سبيل المثال ، في تجارب الخلايا الحية التي تتميز بتحقيقات منتشرة داخل غشاء الخلية. وعلاوة على ذلك، لوحظ أن نظم النماذج البيولوجية يمكن أن تغير استجابتها بشكل كبير اعتمادا على حركة السطح ^{الملامس16}.

في حين تم إجراء تجارب تتبع smFRET والجسيمات المفردة المشتركة التي تسجل مجسات FRET المتنقلة في الماضي ¹⁹ ، لا توجد برامج متاحة للجمهور لتقييم البيانات. وقد دفع ذلك إلى تطوير منصة تحليل جديدة ، والتي تسمح بتحديد خصائص متعددة لمجسات الفلورسنت المتنقلة ، بما في ذلك كفاءة smFRET وقياس stoichiometry ، والمواقع ذات الدقة الفرعية للبكسل ، وكثافة التألق كوظائف للوقت. تم إنشاء طرق لتصفية الآثار الناتجة من خلال فحص سلوك التبييض التدريجي ، ومسافات أقرب جار ، وكثافة الانبعاثات ، وغيرها من السمات لاختيار جزيئات أحادية المسبار المركبة والوظيفية بشكل صحيح. يدعم البرنامج أيضا التقنيات التجريبية والتحليلية المتفق عليها مؤخرا في دراسة متعددة المختبرات لإنتاج بيانات smFRET كمية ^{موثوقة17}. على وجه الخصوص ، يلتزم التنفيذ بالإجراءات التي تم التحقق منها لحساب كفاءة FRET وقياس stoichiometry. يتم استخدام كثافة التألق عند إثارة المتبرع في معرف قناة الانبعاثات _{المانحة و} IDA لقناة الانبعاثات المتقبلة لحساب كفاءة FRET الظاهرة Eapp باستخدام Eq (1).

(1)

بمساعدة شدة التألق في قناة انبعاث المستقبل عند إثارة المتقبل IAA ، يتم حساب قياس اللمعان الظاهر باستخدام Eq (2).

(2)

يمكن اشتقاق كفاءة FRET E و stoichiometry S من Eapp و Sapp من خلال النظر في أربعة عوامل تصحيح.

يصف α تسرب الفلورة المانحة إلى قناة انبعاث المستقبل، ويمكن تحديده باستخدام عينة تحتوي فقط على الفلوروفورات المانحة أو عن طريق تحليل أجزاء من المسارات التي تم فيها تبييض المتقبل. δ يصحح الإثارة المباشرة للمتقبل من قبل مصدر ضوء الإثارة المانحة ويمكن قياسه باستخدام عينة مع الفلوروفورات المتقبلة فقط أو عن طريق تحليل أجزاء من المسارات حيث تم تبييض المتبرع.

.

γ مقاييس _IDD لتصحيح كفاءات الكشف المتباينة في قنوات انبعاثات المانحين والمستقبلين والكفاءات الكمومية المختلفة للفلوروفورات. يمكن حساب العامل من خلال تحليل الزيادة في كثافة المانحين عند تبييض المتقبلين في مسارات ذات كفاءات FRET ^عالية20 أو من خلال دراسة عينة تضم حالات FRET منفصلة متعددة.

β مقاييس IAA لتصحيح الكفاءات المتباينة لإثارة المتبرع والمتقبل. إذا تم تحديد γ من خلال تحليل تبييض المتقبلين، يمكن حساب β من عينة من نسبة المتبرع إلى المتقبلين ^{المعروفة21}. خلاف ذلك ، فإن عينة FRET متعددة الحالات تنتج أيضا β.

معا ، تسمح التصحيحات بحساب كفاءة FRET المصححة باستخدام Eq (3).

(3)

وقياس الستويشيومتري المصحح باستخدام Eq (4).

(4)

من الناحية المثالية ، فإن قياس stoichiometry المصحح لنسبة 1: 1 من المتبرع إلى المتقبل يعطي S = 0.5. ومن الناحية العملية، ينتج عن انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء انتشار القيم المقاسة ل S، مما يعوق التمييز بين الإشارات المقدمة من المانحين فقط (S = 1) وإشارات المستقبلين فقط (S = 0). يمكن استخدام الآثار الزمنية الناتجة كمدخلات لإجراء تحليل أكثر تفصيلا لمسارات الجزيء الواحد للحصول على معلومات مثل ملامح القوة المكانية ^{الزمانية16}، أو حركة أحداث الجزيء ^{الواحد22}، أو الحركيات الانتقالية بين الحالات ^{المختلفة1}.

يصف البروتوكول التالي المعلمات والإجراءات التجريبية لتجارب تتبع smFRET ، بالإضافة إلى مبدأ العمل وراء تحليل البيانات باستخدام مجموعة البرامج المطورة حديثا. للحصول على البيانات التجريبية ، يوصى باستخدام إعداد الفحص المجهري الذي يلبي المتطلبات التالية: أ) القدرة على الكشف عن انبعاث جزيئات الصبغة المفردة. ii) إضاءة واسعة المجال: خاصة بالنسبة لتجارب الخلايا الحية ، يوصى بتكوين الانعكاس الداخلي الكلي (^TIR23,24,25) ؛ ج) الفصل المكاني لضوء الانبعاث وفقا للطول الموجي بحيث يتم إسقاط التألق المانح والمتقبل على مناطق مختلفة من نفس شريحة الكاميرا ²⁵ أو كاميرات مختلفة ؛ د) تعديل مصادر الضوء لإثارة المتبرع والمتقبل بدقة مللي ثانية ، على سبيل المثال ، باستخدام أشعة الليزر القابلة للتعديل مباشرة أو التشكيل عبر المعدلات الصوتية البصرية. هذا يسمح بالإضاءة الستروبوسكوبية لتقليل التبييض الضوئي للفلوروفورات وكذلك الإثارة بالتناوب لتحديد stoichiometries. v) إخراج ملف واحد لكل تسلسل صورة مسجل بتنسيق يمكن قراءته بواسطة حزمة PIMS ^Python26. على وجه الخصوص ، يتم دعم ملفات TIFF متعددة الصفحات.

Protocol

1. المتطلبات الأساسية للبرنامج

1. قم بتثبيت توزيعة Python miniconda ²⁷ (الحد الأدنى المطلوب لإصدار Python: 3.7).
2. افتح مطالبة Anaconda في قائمة ابدأ في Windows ، أو افتح محطة طرفية وقم بتنفيذ تنشيط conda في حالة استخدام Linux أو macOS.
3. تمكين مستودع حزم conda-forge الذي يحتفظ به ^{المجتمع28} عن طريق تنفيذ الأوامر التالية:
   conda config --add channels conda-forge
   كوندا التكوين --تعيين channel_priority صارمة
   تحديث كوندا --الكل
4. قم بتثبيت حزم Python المطلوبة عن طريق تنفيذ:
   conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab
5. تعرف على JupyterLab ، واجهة المستخدم لبرنامج التحليل (راجع وثائق ^{البرنامج29}).
6. قم بتثبيت نظام التحكم في إصدار git ، والذي سيتم استخدامه لاحقا لتنزيل برنامج التحليل وتحديثه. إذا كنت تستخدم Linux، فاستخدم برنامج إدارة حزم التوزيع للتنزيل والتحديث. خلاف ذلك ، قم بتنفيذ:
   conda install git
7. اختياريا قم بتثبيت حزمة Python الجانبية لعرض مجموعات البيانات بعد خطوات التصفية أثناء التحليل:
   كوندا تثبيت السيارة الجانبية

2. قياس العينات

الشكل 1: الحصول على الصور. (أ) تسلسل الإثارة. بعد تسجيل صورة اختيارية لخلية محملة بالصبغة باستخدام ليزر 405 نانومتر ، يتم إثارة المتبرع والمتقبل بالتناوب وبشكل متكرر _لذروة وقت الإضاءة باستخدام ليزر 532 نانومتر و 640 نانومتر ، على التوالي. يجب أن يكون الوقت tr بين إثارة المتبرع والمتقبل طويلا بما يكفي للسماح بقراءة الصورة بواسطة الكاميرا. يمكن استخدام _tdelay وقت التأخير لضبط معدل إطارات الاقتناء ، وبالتالي ، الفترة الزمنية للمراقبة قبل التبييض الضوئي. تم تعديل هذه اللوحة من ¹⁶. (ب) تستخدم العلامات الائتمانية لحساب تحويلات الإحداثيات بين قناتي الانبعاثات. يشار إلى الائتمانات المطابقة حسب اللون. يجب تسجيل العديد من الصور المتحولة لضمان تغطية مجال الرؤية بالكامل. (ج) يتم تسجيل ملفات تعريف الليزر لتصحيح الحقل المسطح باستخدام عينة ذات علامات كثيفة. يتم تسجيل ملف تعريف المتقبل وتبييضه ضوئيا ، يليه الحصول على ملف تعريف المتبرع. يجب التقاط صور متعددة في مناطق عينات مختلفة ، ومتوسطها ، وتنعيمها للتخفيف من تأثير عيوب العينة (على سبيل المثال ، النقطة المضيئة في الجزء العلوي الأوسط من الصورة). (د) خريطة تصحيح الحقل المسطح p(x,y) محسوبة من 20 ملف تعريف ليزر مسجل كما هو موضح في C. الاختصارات: FRET = نقل طاقة الرنين Förster؛ ImDD = صورة انبعاثات المانحين عند إثارة المتبرعين ؛ ImDA = صورة انبعاث المتقبل عند إثارة المتبرع ؛ ImAA = صورة انبعاث المتقبل عند إثارة المتبرع. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. عند استخدام كاميرا جهاز مقترن بالشحنة (EMCCD) يضاعف الإلكترونات، قم بتمكين كسب EM من مراقبة إشارات الجزيء الواحد عند نسب إشارة إلى ضوضاء عالية (راجع تعليمات الشركة المصنعة).
2. تسلسل الإثارة (انظر الشكل 1A لمزيد من التفاصيل).
   1. اختياريا تسجيل صورة للتجزئة لتقييد تحليل البيانات إلى مناطق معينة في مجال الرؤية. على سبيل المثال ، تثير الخلايا المحملة ب Fura-2 باستخدام ليزر 405 نانومتر وتلتقط انبعاثاتها حوالي 510 نانومتر لتقييم المجسات الموجودة فقط في الواجهات بين الخلايا والطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs). وبالتالي ، انتظر الوقت tr للسماح بقراءة الكاميرا.
      ملاحظة: في كاميرات EMCCD، تعتمد tr على عدد الخطوط في منطقة الاهتمام المختارة (ROI). لذلك ، يمكن أن يكون اختيار عائد استثمار صغير مفيدا لأنه يقلل من التأخير بين الإطارات وحجم البيانات المسجلة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح تمكين وضع نقل الإطار بمزيد من التخفيض في tr.
   2. بالتناوب إثارة الفلوروفورات المانحة والمتقبلة بشكل متكرر.
      1. قم بإثارة المتبرع لمدة وقت الإضاءة ₍5-10 مللي ثانية عادة ما تكون قصيرة بما يكفي لتجنب ضبابية الحركة) مع تشغيل الكاميرا أيضا.
      2. انتظر الوقت tr للسماح بقراءة الكاميرا.
      3. إثارة المتقبل أثناء تشغيل الكاميرا.
      4. انتظر لفترة من الوقت _tdelay.
         ملاحظة: يجب أن يكون هذا أطول من tr لتمكين القراءة بواسطة الكاميرا ولكن يمكن اختياره بشكل تعسفي. يجب أن يوازن بين متطلبات حل الوقت وطول التتبع.
      5. كرر الخطوات من 2.2.2.1 إلى 2.2.2.4. اختر عدد التكرارات ليكون كبيرا بما يكفي لضمان التبييض الضوئي لفلوروفور واحد على الأقل لكل مسبار داخل مجال الرؤية ، مما يسمح بتحليل التبييض الضوئي التدريجي لتمييز إشارات الجزيء الواحد من المجاميع.
         ملاحظة: عادة ما يتطلب اختيار كثافة ليزر _الحشو والإثارة المناسبة بعض التجارب: فكلما طالت أوقات الإضاءة وزادت شدة الليزر ، كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الصور الناتجة أفضل ، ولكن كلما كانت الآثار الزمنية الناتجة أقصر.
3. سجل عددا كافيا من الأفلام لكل عينة.

3. قياسات إضافية لتحديد عوامل التصحيح

1. سجل سلسلة من العلامات الائتمانية الموضوعة عشوائيا والمرئية في كل من قناتي الانبعاثات لتسجيل الصور (أي العثور على التحويل الذي يرسم إحداثيات قناة الانبعاثات المانحة على قناة الانبعاثات المستقبلة والعكس صحيح). انظر الشكل 1 باء.
   ملاحظة: يتم تنفيذ تسجيل الصور بواسطة البرنامج ؛ انظر الخطوة 6-1-4.
2. قم بقياس ملف تعريف الكثافة لكل من مصادر ضوء الإثارة المانحة والمتقبلة لتصحيح الحقل المسطح (أي تصحيح الإثارة غير المتجانسة عبر مجال الرؤية). تحقيقا لهذه الغاية ، قم بإعداد عينة تتميز بكثافة عالية من مجسات FRET واحصل أولا على صورة عند إثارة المتقبل ، تليها التبييض الضوئي للمتقبل والتسجيل اللاحق للصورة عند إثارة المتبرع. لزيادة الاستقرار، كرر ذلك عدة مرات في مناطق العينة المختلفة. انظر الشكل 1 جيم ودال. بدلا من ذلك ، سجل عينة مزينة بالجزيء المانح فقط وعينة ثانية مزينة بالفلوروفورات المتقبلة فقط.
   ملاحظة: يتم تنفيذ تصحيح Flatfield بواسطة برنامج التحليل. راجع الخطوة 8.1.2.
3. سجل عينة أحادية الجزيء (كما في القسم 2) من مسبار بدون فلوروفور متقبل لتحديد انبعاثات المانحين المتسربة إلى قناة المستقبل.
   ملاحظة: يمكن أيضا حساب تسرب المانحين من الآثار الزمنية الفعلية للمجسات بعد تبييض المتقبل. إذا تم تسجيل عدد كاف من هذه الأحداث ، فلا يلزم إجراء قياس إضافي. يتم دعم كلا الخيارين بواسطة برنامج التحليل. انظر المعلومات التكميلية، القسم 3-15.
4. احصل على تسجيلات لمسبار بدون فلوروفور مانح لتحديد كمية الإثارة المباشرة للمتقبل بواسطة مصدر ضوء الإثارة المانح.
   ملاحظة: يمكن أيضا اشتقاق إثارة المستقبل المباشر من الآثار الزمنية الفعلية للمجسات بعد تبييض المتبرع. إذا تم تسجيل عدد كاف من هذه الأحداث ، فلا يلزم إجراء قياس إضافي. يتم دعم كلا الخيارين بواسطة برنامج التحليل. انظر المعلومات التكميلية، القسم 3-15.
5. سجل عينة أحادية الجزيء تتميز بكفاءتين متميزتين من FRET لتصحيح كفاءات الكشف المختلفة لقنوات انبعاثات المتبرع والمتقبل والغلة الكمومية المختلفة للأصباغ.
   ملاحظة: يمكن أن تكون هذه العينات، على سبيل المثال، تقاطعات ^{هوليداي1}، التي تتقلب بين اثنين من التوافقات، أو قضبان الحمض النووي التي تحتوي على أزواج FRET متصلة على مسافات مختلفة ومحددة جيدا. إذا كانت المجسات تتميز بكفاءات FRET عالية وثابتة بما فيه الكفاية ، فيمكن أيضا حساب التصحيح من أحداث تبييض المستقبلين لآثار وقت المجسات ، وفي هذه الحالة لا يلزم إجراء قياسات إضافية. يتم دعم كلا الخيارين بواسطة برنامج التحليل. انظر المعلومات التكميلية، القسم 3-15.

4. خوارزميات توطين جزيء واحد

ملاحظة: تتطلب العديد من خطوات التحليل توطين جزيء واحد. اختر بين خوارزمية تركيب ^غاوسي30 وحساب مركز ^{الكتلة31}، اعتمادا على كثافة الإشارة والخلفية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء.

1. لإجراء تركيب Gaussian ، اختر خوارزمية 3D-DAOSTORM30 عبر واجهات المستخدم المعنية.
   ملاحظة: تم تصميم 3D-DAOSTORM لتمييز الإشارات المتساوية ذات وظائف انتشار النقاط المتداخلة. في حين أن هذه ميزة بشكل عام ، إلا أنها تأتي مع تحذير: يتم تحديد إشارات واحدة ساطعة في بعض الأحيان على أنها إشارتان متجاورتان ، مما قد يربك خوارزمية التتبع ويؤدي إلى اكتشاف مسارين قصيرين بدلا من مسار واحد طويل.
   قم بتعيين المعلمات التالية (للحصول على التفاصيل، راجع وثائق مكتبة sdt-python32، التي توفر تنفيذ الخوارزمية).
   1. نصف القطر: اضبط قيمة σ الأولية لدالة الملاءمة الغاوسية بالبكسل اعتمادا على حجم البكسل الفعال.
   2. العتبة: قم بتعيين الحد الأدنى للسعة (أي قيمة البكسل الأكثر سطوعا، والتي تم تصحيحها للخلفية المحلية المقدرة) للحد الأقصى للكثافة المحلية لتكون مناسبة.
      ملاحظة: يمكن القول إن العتبة هي المعلمة الأكثر أهمية. إذا تم ضبطها منخفضة جدا ، فقد تعتبر الضوضاء إشارة تألق ، ويمكن تزويد الإشارات الساطعة باثنين من Gaussians. إذا تم تعيينها عالية جدا ، فإن الإشارات الخافتة غير مناسبة.
   3. نموذج: تعيين إلى 2D لتناسب Gaussians الدائرية.
      ملاحظة: النماذج الأخرى غير قابلة للتطبيق على بيانات smFRET.
   4. العثور على فلتر: قم بتطبيق مرشح قبل العثور على الحد الأقصى المحلي لتقليل الضوضاء، وهو أمر مفيد في حالات انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. يمكن أن يكون هذا i) الهوية: لا يوجد مرشح ؛ ب) كروكر-جرير: مرشح ممر النطاق الترددي من خوارزمية كروكر-جرير31,33؛ أو iii) Gaussian: طمس غاوسي مع σ تعيينه بواسطة معلمة سيغما.
      ملاحظة: بالنسبة إلى Crocker-Grier ، يجب أن تكون معلمة الحجم الفذة تقريبا نصف قطر دالة انتشار النقطة بالبكسل.
      ملاحظة: يتم إجراء التركيب باستخدام البيانات الخام غير المصفاة.
   5. المسافة الدقيقة: تناسب إشارتين محتملتين مفصولتين بأقل من الحد الأدنى من بكسل المسافة بواسطة غاوسي واحد.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد هذا في السيناريو المذكور أعلاه حيث يتم اكتشاف إشارة ساطعة بشكل خاطئ كإشارتين متجاورتين.
   6. نطاق الحجم: حدد الحد الأدنى والحد الأقصى σ من الملاءمة لإزالة الاكتشافات من الإشارات الزائفة بسبب الضوضاء.
2. اختر خوارزمية Crocker-Grier عبر واجهات المستخدم المعنية لإجراء حساب مركز الكتلة (خوارزمية ^محسنة31 تستند إلى فكرة Crocker و ^Grier33).
   ملاحظة: هذه الخوارزمية قوية جدا حتى في سيناريوهات الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة وفي التعامل مع الإشارات التي تتميز بمجموعة من الشدة ولكنها لا يمكن أن تناسب الجزيئات ذات وظائف انتشار النقطة المتداخلة بدقة.
   1. نصف القطر: اضبط نصف القطر (بالبكسل) للقرص كبيرا بما يكفي لاحتواء دالة انتشار النقطة الكاملة.
   2. درج الإشارة: اضبط الحد الأدنى للسعة (ألمع بكسل فوق الخلفية المقدرة) لتحليل الحد الأقصى للكثافة المحلية.
      ملاحظة: إذا تم ضبطها منخفضة جدا، يمكن اعتبار الضوضاء إشارة تألق. إذا تم تعيينها عالية جدا ، فإن الإشارات الخافتة غير مناسبة.
   3. الدرس الكتلي: قم بتعيين الحد الأدنى للكثافة الكلية (مجموع قيم البكسل المصححة في الخلفية) للإشارة المراد تحليلها.
      ملاحظة: تنطبق نفس الاعتبارات المذكورة أعلاه.

5. تهيئة البرامج

1. قم بتنزيل البرامج النصية للتحليل. في موجه Anaconda ، انتقل إلى مجلد لحفظ التحليل (باستخدام أمر القرص المضغوط ) وتنفيذه
   git استنساخ المجلد الهدف https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git
   1. استبدل المجلد الهدف باسم وصفي مثل 2021-06-14_Force-FRET-experiment.
      ملاحظة: سينتهي برنامج التحليل في هذا المجلد. تأكد من عدم وجود هذا المجلد مسبقا. يوصى بتنزيل نسخة من البرامج النصية للتحليل لكل تجربة. بهذه الطريقة ، من الممكن إعادة النظر في التحليل لاحقا ، وتذكر المعلمات المستخدمة ، وإجراء تغييرات.
2. نسخ دفاتر الملاحظات Jupyter (01. Tracking.ipynb ، 02. Analysis.ipynb, 03. Plots.ipynb) في المجلد الذي تم إنشاؤه حديثا (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم المجلد الجذر). إذا كانت هذه هي المرة الأولى التي تستخدم فيها البرنامج، فاحصل عليها من المجلد الفرعي لدفاتر الملاحظات في المجلد الجذر.
   ملاحظة: إذا تم بالفعل تحليل مجموعات بيانات مماثلة، فقد يكون نسخ دفاتر الملاحظات من تجربة سابقة خيارا مناسبا، حيث قد تكون المعلمات قد تغيرت قليلا فقط.
3. بدء تشغيل خادم JupyterLab عن طريق تنفيذ الأمر التالي في موجه Anaconda لفتح نافذة مستعرض ويب تعرض JupyterLab.
   مختبر جوبيتر
   ملاحظة: المستعرض هو الواجهة فقط ، بينما تقوم العملية التي تعمل في مطالبة Anaconda بالعمل الفعلي. ونتيجة لذلك ، فإن إغلاق نافذة المتصفح ليس له سوى تأثير ضئيل ؛ يمكن استعادة الجلسة عن طريق الوصول إلى http://localhost:8888. ومع ذلك ، فإن مقاطعة عملية JupyterLab في المطالبة أو إغلاق المطالبة سيؤدي إلى إنهاء التحليل ، مما يؤدي إلى فقدان العمل غير المحفوظ.
4. في نافذة مستعرض JupyterLab، استخدم الجزء الأيمن للانتقال إلى المجلد الجذر. انقر نقرا مزدوجا فوق 01. Tracking.ipynb لتشغيل أول دفتر ملاحظات. بعد التشغيل ، ابحث عن علامة تبويب جديدة تظهر ، والتي تعرض مربعات ، ما يسمى بالخلايا ، لرمز Python.
   ملاحظة: تحتوي كافة دفاتر ملاحظات Jupyter على تعليقات تصف وظائف كل خلية تعليمات برمجية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن عرض الوثائق الخاصة بكل استدعاء أسلوب عن طريق وضع مؤشر النص مباشرة قبل الفتح ( واضغط على Shift+Tab.
5. انظر الشكل 2 للحصول على نظرة عامة على عملية تحليل البيانات.

الشكل 2: نظرة عامة على خط أنابيب تحليل نموذجي. لاحظ أن خطوات التصفية تخضع للتكيف وفقا للتصميم التجريبي. تم تعديل هذا الرقم من ¹⁶. اختصار: FRET = نقل طاقة الرنين Förster. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ملاحظة: يمكن تنزيل عينة من البيانات لتجربة البرنامج من https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files

6. توطين وتتبع وتحليل كثافة التألق للجزيئات المفردة (01. Tracking.ipynb).

1. استخدم الزر 01. Tracking.ipynb دفتر Jupyter للتحليل الموثوق به لقيم شدة التألق لإشارات الجزيء الواحد ، والذي تم تصميمه خصيصا للقياس الكمي الدقيق ، خاصة للإشارات الخافتة التي تحدث غالبا في قياسات FRET (على سبيل المثال ، بسبب انخفاض إشارات المتبرع في أحداث FRET العالية والعكس صحيح).
   ملاحظة: تحقيقا لهذه الغاية، يتم تنفيذ التكامل المباشر لكثافة البكسل في البيانات الخام مع تصحيح الخلفية المحلية. للحصول على لقطات شاشة لكل خطوة تحليل ووصف لمعلمات استدعاء الدالة، راجع معلومات تكميلية.
   1. حدد تسلسل الإضاءة للسماح بتحديد إطارات الإثارة المانحة والمتقبلة، بالإضافة إلى إطارات تجزئة الصور من تسلسلات الصور المسجلة.
      ملاحظة: نظرا لأن البرنامج يسمح بمعالجة البيانات المسجلة باستخدام بروتوكولات إضاءة تعسفية ، فمن الضروري الإشارة إلى الإطار الذي تم الحصول عليه في تسلسل الصورة مع إثارة نوع الفلوروفور ؛ انظر المعلومات التكميلية، القسم 1.2، الخطوة 3. يتم الاحتفاظ بأرقام إطارات تسلسل الصورة الأصلي.
   2. وصف مجموعات البيانات وتحميلها. تحليل مجموعات بيانات متعددة في وقت واحد، شريطة أن يتم تسجيلها باستخدام نفس إعدادات الإضاءة. قم بتعيين معرف ونمط يطابق أسماء ملفات تسلسل الصور المعنية لكل مجموعة بيانات. بالإضافة إلى ذلك، حدد مجموعات بيانات محددة لأغراض خاصة، مثل تسجيلات العلامات الائتمانية لتسجيل الصور، وملفات تعريف ضوء الإثارة لتصحيح الحقل المسطح، وعينات اختيارية للمتبرعين فقط والمستقبلين فقط لتحديد عوامل التصحيح.
   3. حدد قنوات الانبعاثات في الصور الأولية إذا تم تسجيل كلتا القناتين باستخدام كاميرا واحدة. لهذا ، استخدم الأداة الرسومية المناسبة لتحديد المناطق المناسبة لانبعاث المانحين والمستقبلين.
   4. توطين العلامات الائتمانية في كل من قنوات الانبعاثات وإجراء تسجيل الصور. استخدم واجهة المستخدم المتوفرة للعثور على المعلمات المناسبة لخوارزمية التعريب لكل من قنوات الانبعاثات المانحة والمتقبلة. راجع القسم 4 للحصول على معلومات حول خوارزميات الترجمة المدعومة.
      ملاحظة: يمكن تحديد العلامات الائتمانية الموزعة عشوائيا عبر قنوات الانبعاثات من خلال التوزيع المكاني لأقرب جيرانها (الشكل 1 باء). إن التنفيذ المخصص للخوارزمية المقترحة للفحص المجهري الانتقائي للإضاءة ^{المستوية34} في مكتبة sdt-python يطابق تلقائيا موضع كل علامة في قناة الانبعاثات المانحة مع الموضع في قناة انبعاث المستقبل. تم العثور على تحويل T يرسم خريطة لإحداثيات قناة الانبعاثات المانحة إلى إحداثيات قناة الانبعاثات المتقبلة عبر تناسب المربعات الصغرى الخطية للتحول الأفيني إلى مواقع ^{العلامات35}. يستخدم RANSAC لحساب القيم المتطرفة، مثل المراكز المتطابقة بشكل خاطئ من الخطوة السابقة.
   5. توطين مجسات FRET بشكل مستقل عند إثارة المتبرع والمتقبل في جميع الإطارات ودمج النتائج في جدول واحد يحتوي على رقم الإطار الأصلي وإحداثيات 2-dimensional ومعرف يشير إلى ملف الصورة المصدر.
      ملاحظة: تحقيقا لهذه الغاية ، يوفر البرنامج واجهات المستخدم للعثور على الخيارات المناسبة لخوارزمية الترجمة.
      1. توطين مجسات FRET عند إثارة المانحين في مجموع الصور التي تم الحصول عليها من انبعاثات الجهات المانحة _ImDD و IMDA للانبعاثات المتقبلة ، والتي بالكاد تعتمد على كفاءة FRET. للحصول على معلومات حول خيارات خوارزمية التعريب، راجع القسم 4.
         ملاحظة: يتم حساب كل صورة مجمعة عن طريق تحويل _ImDD باستخدام التحويل T الذي تم الحصول عليه مسبقا من تسجيل الصورة وإضافته إلى ImDA.
      2. توطين المجسات عند إثارة المتقبل في قناة انبعاث المستقبل ImAA (انظر القسم 4 للحصول على تفاصيل حول خوارزميات التعريب).
   6. إجراء التتبع وقياس شدة التألق.

الشكل 3: قياس كثافة الجزيء الواحد. (أ) بالنسبة للفلوروفور الموجود في البكسل البرتقالي ، يتم تحديد شدته غير المصححة _Iuncorr من خلال جمع جميع كثافة وحدات البكسل داخل قرص (بكسل أصفر وبرتقالي) كبير بما يكفي لتغطية جميع وحدات البكسل المتأثرة بالإشارة: . يتم حساب الخلفية المحلية كمتوسط للبيكسلات في حلقة (بكسل أزرق) حول القرص: ، حيث nring هو عدد وحدات البكسل في الحلقة. شدة التألق I هي نتيجة لطرح الخلفية من الكثافة غير المصححة ، I = _Iuncorr - b × _ndisk ، حيث _ndisk هو عدد وحدات البكسل في القرص. يتم تحديد نصف قطر الدائرة عبر المعلمة feat_radius لطريقة التتبع. يتم إعطاء عرض الحلقة بواسطة المعلمة bg_frame. إذا تداخلت دالة انتشار النقطة لإحدى الإشارات مع حلقة الخلفية لإشارة أخرى (اللوحة السفلية)، يتم استبعاد البيكسلات المتأثرة (الحمراء) من تحليل الخلفية المحلية. إذا تداخلت دالتان من وظائف انتشار النقطة ، فلا يمكن حساب شدة التألق بشكل موثوق وبالتالي يتم التخلص منها. (ب، ج) تظهر عمليات المحاكاة أن تطبيق طمس غاوسي بانحراف معياري قدره 1 بكسل يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء حتى عامل قريب من 2 عند كثافة التألق المنخفضة (B) ولا يكاد يقدم أي خطأ (تقدير طفيف أقل من 1٪ ، (C))¹⁶. علاوة على ذلك ، فإن الخطأ النسبي (أي (_Imeas - _Itruth) / _Itruth ، حيث _Itruth هو الحقيقة الأرضية و _Imeas هو نتيجة التحليل) ثابت على نطاق الكثافة بأكمله وبالتالي يلغي الكميات النسبية مثل كفاءات FRET و stoichiometries. تستند جميع المؤامرات إلى عمل منشور ^مسبقا16. الاختصارات: SNR = نسبة الإشارة إلى الضوضاء; FRET = نقل طاقة الرنين Förster. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. اختر الخيارات المناسبة ل ^{trackpy36algorithm} المستخدم لربط توطين مسبار FRET بالمسارات. على وجه الخصوص ، قم بتعيين الحد الأقصى لمسافة البحث من إطار إلى آخر وعدد الإطارات المتتالية التي قد لا يتم اكتشاف الإشارة الخاصة بها ، والتي يمكن أن تحدث بسبب التبييض أو التوطين الفائت.
   ملاحظة: يتم سد هذه الفجوات عن طريق الاستيفاء بين المناصب السابقة واللاحقة. يتم وضع علامة على هذه المواضع المستنبطة وتستخدم فقط في وقت لاحق لقراءة قيم الكثافة ولكن ليس لتحليل الانتشار. يتم تحليل المسارات في نظام الإحداثيات لقناة انبعاث المستقبل. وفيما يتعلق بتحليل شدة التألق (الخطوة 6-1-6-2)، تحول المسارات بالإضافة إلى ذلك إلى النظام الإحداثي لقناة الانبعاثات المانحة باستخدام التحويل العكسي ^T-1 الذي تم الحصول عليه عن طريق تسجيل الصور (انظر الخطوة 6-1-4).
2. حدد خيارات لخوارزمية حساب شدة التألق (انظر الشكل 3A للحصول على التفاصيل). حدد i) نصف قطر القرص الذي ، عندما يتمركز على موضع الإشارة ، يحتوي على جميع وحدات البكسل المتأثرة بتلك الإشارة و ii) عرض حلقة حول كل قرص يستخدم لتحديد الخلفية المحلية.
   ملاحظة: لتقليل التشويش في قياسات الكثافة التي تم الحصول عليها، يتم تطبيق ضبابية غاوسية بانحراف معياري قدره 1 بكسل على الصور (الشكل 3B، C).

7. استخدم وظيفة برنامج التحليل لمعالجة بيانات الصور الإضافية من تسلسل الصور.
   1. استخراج صور إضافية مسجلة لتسهيل التجزئة (انظر الخطوة 2.2.1، المميزة ب s في تسلسل الإثارة (انظر المعلومات التكميلية، القسم 1.2، الخطوة 3).
   2. حدد ملفات تعريف ضوء الإثارة المانحة والمتقبلة عبر مجال الرؤية من الصور المسجلة على عينة ذات علامات كثيفة (انظر الخطوة 3.2).
      ملاحظة: يتم حساب متوسط بكسل تلو الآخر من الصور لحساب ملفات تعريف الضوء. يتم طرح خط الأساس للكاميرا. يتم عدم وضوح الصور باستخدام مرشح غاوسي لتقليل التأثيرات الناتجة عن شوائب العينة. وأخيرا، يتم تقسيم الصور الناتجة بالبكسل حسب قيمتها القصوى للحصول على إحداثيات تعيين ملف التعريف p(x,y) على الفاصل الزمني [0,1].

7. تصور مسارات FRET (اختياري)

1. استخدم تطبيق المفتش لعرض مسارات أحادية الجزيء في بيانات الصورة الخام وكثافة التألق المقابلة وكفاءات FRET الظاهرة و stoichiometries.
   ملاحظة: هذه أداة قيمة لتقييم صحة المعلمات المختارة وقبول أو رفض آثار الوقت الفردية يدويا. راجع المعلومات التكميلية للحصول على لقطة شاشة ومعلومات استخدام مفصلة.

8. تحليل وتصفية بيانات الجزيء الواحد (02. Analysis.ipynb)

1. استخدم الزر 02. Analysis.ipynb Jupyter دفتر ملاحظات لتحليل وتصفية بيانات الجزيء الواحد التي تم الحصول عليها عبر 01. Tracking.ipynb دفتر. راجع الخطوات أدناه للحصول على خط أنابيب تحليل نموذجي.
   ملاحظة: قد تتطلب الأسئلة العلمية المختلفة والتصاميم التجريبية تعديلات على الإعدادات. يسمح استخدام أجهزة الكمبيوتر المحمولة Jupyter بسهولة التكيف عن طريق حذف خطوات التحليل وإعادة ترتيبها وتعديلها. للحصول على لقطات شاشة لكل خطوة تحليل ووصف لمعلمات استدعاء الدالة، راجع معلومات تكميلية.
   1. تنفيذ خطوات التصفية الأولية.
      1. تجاهل الإشارات ذات وظائف انتشار النقاط المتداخلة لأنه من الصعب تحديد شدتها الفلورية بشكل موثوق.
      2. في حالة الإضاءة غير المتجانسة ، تقبل فقط الإشارات الموجودة في المناطق المضاءة جيدا داخل مجال الرؤية لضمان نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة.
      3. في حالة دراسة FRET داخل الجزيئات ، قصر التحليل على تلك المسارات الموجودة من بداية تسلسل الصورة لضمان تسجيل جميع خطوات التبييض ويمكن تقييمها بشكل صحيح لاحقا أثناء تحليل التبييض الضوئي التدريجي.
         ملاحظة: عند إجراء تجارب على مجسات FRET بين الجزيئات ، حيث لا تكون الفلوروفورات المانحة والمتقبلة جزءا من مجمع مسبق التشكيل ، قد لا يكون من الممكن تقييد التحليل بالمسارات الحالية في البداية.
   2. قم بتنفيذ تصحيح الحقل المسطح، والذي يستخدم ملفات تعريف مصدر ضوء الإثارة التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.1.7.2 لعكس اختلافات شدة التألق المعتمدة على الموضع الناجمة عن الإضاءة غير المتجانسة.
      ملاحظة: يتم تصحيح شدة التألق I(x,y) للمسبار في الموضع (x,y) عبر ؛ انظر الشكل 1C,D.
   3. احسب كفاءة FRET الظاهرة Eapp (أي جزء الطاقة المنقولة من الفلوروفور المانح إلى الفلوروفور المتقبل) و stoichiometry Sapp الظاهر (أي عدد الفلوروفورات المانحة مقسوما على العدد الإجمالي للفلوروفورات داخل بقعة محدودة الحيود ).
      ملاحظة: من خلال رسم E مقابل S لكل نقطة بيانات، من الممكن التمييز بين التغييرات في كفاءات FRET المقاسة بسبب التغير في المسافة بين المتبرع والمتقبل والتعديلات الناجمة عن التغيرات في قياس ^{الجرعات18}. هذا يسمح بالتمييز بين E = 0 بسبب فصل الصبغة عن E = 0 بسبب عدم وجود متقبل نشط. وتستخدم قطع الأراضي E-S في جميع مراحل التحليل كأداة لتقييم الجودة؛ انظر الشكل 4 كمثال.
   4. إجراء تحليل تدريجي للتبييض الضوئي للتمييز بين المجسات الجزيئية المفردة والمجاميع. اختر قبول أحد الخيارات التالية.
      ملاحظة: تحقيقا لهذه الغاية، يطبق برنامج التحليل تطبيقا ^مخصصا32 لخوارزمية الكشف عن نقطة التغيير ^PELT37 بشكل منفصل على شدة التألق عند إثارة المتبرع (_IDD + IDA) وإثارة المتقبل (IAA).
      1. اختر الخيار 1 ، حيث يقوم المستقبل بتبييض الفلوروفور في خطوة واحدة بينما لا يظهر المتبرع أي تبييض جزئي (أي ، لا توجد خطوة تبييض إلى كثافة غير صفرية).
         ملاحظة: يرفض هذا الخيار أيضا المسارات التي يبيض فيها المتبرع قبل المتقبل في خطوة واحدة. الخيار 1 هو الخيار المفضل في حالة ارتفاع معدلات التبييض الضوئي للقبول.
      2. اختر الخيار 2 ، حيث يقوم المانح بتبييض في خطوة واحدة بينما لا يوجد تبييض جزئي للقبول.
         ملاحظة: يرفض هذا الخيار أيضا المسارات التي يبيض فيها المتبرع بعد المتقبل في خطوة واحدة. الخيار 2 هو الخيار المفضل في حالة ارتفاع معدلات التبييض الضوئي للمانحين.
      3. اختر الخيار 3 ، حيث يقوم أي من المبيضات الفلوروفورية في خطوة واحدة بينما لا تبيض الأخرى جزئيا.
         ملاحظة: يعطي الخيار 3 مرونة أكبر من الخيارين 1 و2 وسيكون الخيار المفضل المقترح لتحليل البيانات.
      4. اختر الخيار 4 ، حيث تظهر الفلوروفورات المانحة والمتقبلة تبييض ضوئي من خطوة واحدة أو لا يوجد تبييض ضوئي على الإطلاق.
         ملاحظة: يفضل الخيار 4 في حالة انخفاض معدلات التبييض الضوئي.
   5. احسب عوامل التصحيح لتسرب انبعاثات الجهات المانحة إلى α قناة المستقبل، δ إثارة المستقبل المباشر، وكفاءة الكشف γ، وكفاءات الإثارة β ¹⁷.
   6. استخدم عوامل التصحيح لحساب كفاءة FRET E من الكفاءة الظاهرة Eapp و stoichiometry S من stoichiometry Sapp.
   7. قم بتنفيذ المزيد من خطوات التصفية. حدد نقاط البيانات فقط من قبل حدث التبييض الأول في كل مسار. بالإضافة إلى ذلك ، اقبل فقط المسارات التي تحتوي على 75٪ على الأقل من نقاط البيانات التي تلبي 0.35 < S < 0.6 لتقييد التحليل على مجسات أحادية الجزيء (الأرقام قابلة للتعديل).
      ملاحظة: ينبغي اختيار الحدود العليا والدنيا وفقا لانتشار السكان الذين يهمهم الاهتمام مقابل السكان الذين سيتم استبعادهم من التحليل (على سبيل المثال، السكان المانحون فقط والمقبولون فقط). استنادا إلى الخبرة ، تبين أن 0.35 < S < 0.6 خيار جيد للعديد من المواقف التجريبية.
   8. إجراء تجزئة الصور عبر طرق العتبة العالمية أو ^{التكيفية35} على الصور المساعدة المناسبة (انظر الخطوتين 2-2-1 و6-1-7) لقصر التحليل على مناطق متميزة داخل مجال الرؤية.
      ملاحظة: يسمح هذا، على سبيل المثال، بإجراء تقييم حصري للمجسات الموجودة في واجهة خلية-SLB أو على بنية منقوشة.

9. رسم النتائج ومزيد من التحليل (03. Plot.ipynb)

ملاحظة: ارجع إلى المعلومات التكميلية للحصول على لقطات شاشة لدفتر ملاحظات Jupyter ووصف معلمات استدعاء الدالة.

1. قم بإنشاء مخططات E-S للتحقق من أن إشارات قياس stoichiometry غير الصحيحة قد تم تحديدها وإزالتها بشكل صحيح.
2. رسم بياني لكفاءات FRET لتوفير نظرة عامة راسخة على توزيعات كفاءة FRET. قم بتجميع المدرج التكراري للمقارنة المريحة للنتائج من التجارب المختلفة.
3. قم بتقييم البيانات بشكل أكبر (على سبيل المثال ، تحليل الانتشار ، وتحويل كفاءات FRET إلى قوى في التجارب باستخدام مستشعرات القوة الجزيئية أو تحليل الانتقال) داخل دفتر الملاحظات مع الاستفادة من مكتبات Python العلمية.
   ملاحظة: يمكن أيضا تصدير البيانات في العديد من تنسيقات الملفات كمدخلات إلى برامج تحليل أخرى.

النتائج

يمكن استخراج مجموعة متنوعة من المعلومات منخفضة وعالية المستوى من مسارات smFRET اعتمادا على السؤال العلمي للتجربة. هنا ، يتم تقديم أمثلة على خطوط أنابيب التحليل مع المجسات التناظرية والرقمية: مستشعر القوة الجزيئية القائم على ^{الببتيد16} ومسبار الحمض النووي مع التبديل العشوائي لتكوينه38 ، على التوالي. ارجع إلى الشكل 5 لمعرفة التصميم ومبدأ عمل هذه المجسات.

بعد تنفيذ خوارزميات التوطين والتتبع كما هو موضح في البروتوكول ، توفر الحزمة أدوات متعددة لتصور البيانات لتحسين المعلمات الأولية وخطوات التصفية اللاحقة: (i) تصور أحداث smFRET الفردية ، (ii) تجزئة الصور الاختيارية لتحليل البيانات في مناطق معينة من الاهتمامات ، (iii) مراقبة خطوات التصفية عبر كفاءة FRET مقابل مؤامرات stoichiometry (E-S). يتم عرض تصور بيانات الجزيء الواحد في الشكل 6.

أخيرا ، يتم تمثيل أحداث FRET التي تمت تصفيتها بواسطة مخطط E-S ورسم بياني لكفاءة FRET (الشكل 4). تعد مؤامرة E-S أداة مفيدة لتحسين خطوات التصفية المذكورة أعلاه والتحقيق في النتيجة النهائية. يمكن استبعاد مستشعرات FRET المبيضة جزئيا أو غير المكتملة من خلال قيمة قياس الخصر الخاصة بها. يمكن التحقيق في معلمات التنقل عن طريق رسم مسار مسار فردي في مخطط x-y (الشكل 6) أو مخطط متوسط الإزاحة المربعة (MSD) (الشكل 4). الطريقة الأولى مفيدة بشكل خاص للتمييز بين الحركة والأحداث المجمدة ، في حين يتم استخدام الطريقة الأخيرة لحساب معامل الانتشار.

الشكل 4: الإخراج المثالي. (أ) يتم رسم كفاءة FRET مقابل قياس الكيمياء (E-S plot) لمجموعة من مستشعر القوة الجزيئية (اللوحة اليسرى) التي تزين طبقة ثنائية من الدهون المدعومة بالزجاج وتوترها خلية T. سحابة سكانية واحدة فقط مرئية. يجسد الرسم البياني الخاص بكفاءات FRET الفرق بين مجموعة مستشعر القوة في وجود الخلايا وغيابها (اللوحة الوسطى). لا يمكن ملاحظة أي تحول إلى انخفاض كفاءة FRET لأفراد المستشعر في وجود الخلايا التائية ، مما يشير إلى تمدد ضئيل أو معدوم يعتمد على القوة لوحدة الاستشعار. تؤكد مخطط MSD لهذه الظروف التجريبية أن مجموعة مستشعر القوة تحت الخلية التائية تتحرك بشكل أبطأ بكثير من نظيراتها غير المقيدة (اللوحة اليمنى). (ب) وأجري التحليل نفسه باستخدام مستشعر الحمض النووي لتقاطع هوليداي الذي يزين طبقة ثنائية من الدهون السائلة المدعومة بالزجاج. تظهر مؤامرة E-S بوضوح مجموعتين من السكان ، والتي هي واضحة أيضا في الرسم البياني لكفاءة FRET. تشير مؤامرة MSD إلى وجود مجموعة أجهزة استشعار واحدة سريعة الحركة. الاختصارات: FRET = نقل طاقة الرنين Förster؛ MSD = متوسط الإزاحة المربعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: التصميم ومبدأ العمل لمجسات FRET داخل الجزيئية. (أ) مستشعر الببتيد التناظري للقياس الكمي للقوى الجزيئية الميكانيكية. ترتبط الفلوروفورات المانحة والمتقبلة تساهميا بأي من طرفي العمود الفقري للببتيد. ترتبط وحدة المستشعر على وجه التحديد برابطة محددة ، والتي بدورها تربط مستقبلا سطحيا مقيما في الخلية محل اهتمام (هنا ، جزء من الجسم المضاد يتعرف على وجه التحديد على سلسلة بيتا لمستقبل الخلايا التائية). عند ربط رباط المستقبلات ، يتم ممارسة القوة ، وتمتد وحدة المستشعر وترتد في النهاية بعد انقسام الرابطة. تم تعديل هذه اللوحة من ¹⁶. (ب) مستشعر الحمض النووي الرقمي لتحديد كمية انتقالات FRET. يتكون مستشعر FRET من أربعة خيوط من الحمض النووي تشكل تقاطع هوليداي. يتم ربط الفلوروفور المانح والمتقبل تساهميا بخيطين. غالبا ما تقوم تقاطعات هوليداي بتبديل تشكيلها اعتمادا على ظروف التخزين المؤقت المحيطة. يمكن مراقبة التبديل العشوائي لهذه التشكيلات عن طريق تحديد كفاءة FRET للمجسات الفردية. الاختصارات: TCR = مستقبلات الخلايا التائية. FRET = نقل طاقة الرنين Förster. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: أمثلة على توطين وتتبع مجسات FRET. (أ) يتم حساب كفاءة FRET وقياس الترويشيومتري للأحداث الفردية عن طريق تحديد شدة الفلوروفور المانح عند إثارة المتبرع (D → D) ، والفلوروفور المتقبل عند إثارة المتبرع (D → A) ، والفلوروفور المتقبل عند إثارة المتقبل (A → A). تمنع تصفية أقرب جار التحيز عن طريق تداخل وظائف انتشار النقطة للبواعث القريبة. يسمح تجزئة الصور للمستخدم باختيار أحداث smFRET معينة مترجمة داخل منطقة الاهتمام (على سبيل المثال ، خلية أو نمط صغير). وكمثال على تجزئة الصورة، تم تلطيخ الخلايا التائية ب Fura-2 (معروضة على اليسار) وإخضاعها للعتبات التكيفية لتحديد حواف الخلية (الخط البرتقالي المنقط). أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر (B) مسارات smFRET باستخدام مستشعر القوة الجزيئية. يمكن رسم المسارات الفردية في مستوى x-y ، وتصور سلوك الانتشار والتوطين (اللوحة اليسرى). علاوة على ذلك ، يمكن رسم كثافة كل مسار بمرور الوقت لتحديد انتقالات FRET أو خطوات التبييض (تظهر اللوحة الوسطى المسار الأحمر من اللوحة اليسرى). يمكن تصور كفاءة FRET الناتجة وقياس stoichiometry بالمثل (اللوحة اليمنى). (ج) مسارات smFRET باستخدام مستشعر الحمض النووي لتقاطع هوليداي. تم استخدام HBSS + 12 mM _MgCl2 كمخزن مؤقت أثناء القياسات. بصرف النظر عن خطوة تبييض المستقبل الظاهرة بالقرب من نهاية تسلسل هذه الأمثلة ، يمكن تحديد تردد انتقالات FRET لكل مستشعر. تقوم تقاطعات هوليداي بتبديل تشكيلها بتردد عال ، في حين أن مستشعر القوة الجزيئية لا يظهر انتقالات FRET. هذه المعلومات تجعل من الممكن ضبط الظروف التجريبية ، مثل التأخير بين الإطارات ، لزيادة أو تقليل عدد التحولات المرصودة. الاختصارات: FRET = نقل طاقة الرنين Förster؛ smFRET = جزيء واحد FRET; HBSS = محلول الملح المتوازن من هانك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

معلومات تكميلية: توطين وتتبع الجزيئات المفردة (01. Tracking.ipynb). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تفصل هذه المقالة خط أنابيب للتسجيلات الآلية والتحليل الكمي لبيانات smFRET الناشئة عن جزيئات المسبار المتنقلة والمربوطة بالسطح. وهو يكمل النهجين السائدين لتجارب smFRET ، التي تنطوي إما على مجسات مثبتة على السطح أو مجسات منتشرة في محلول داخل وخارج حجم الإثارة ^{البؤرية17}. يوفر كفاءة FRET الصحيحة والمواقع الجزيئية كدالة للوقت. وبالتالي يمكن استخدامه كمدخلات لبرامج التحليل المتخصصة، على سبيل المثال، لتحديد الحركيات الانتقالية ¹ أو المدرج التكراري ^FRET39 أو الانتشار ثنائي ^{الأبعاد22}.

يتم إصدار البرنامج بموجب ترخيص مجاني ومفتوح المصدر معتمد من قبل مبادرة المصدر المفتوح التي تمنح المستخدم الحق الدائم في الاستخدام المجاني والتعديل وإعادة التوزيع. تم اختيار Github كمنصة تطوير وتوزيع لتسهيل الحصول على البرنامج والمشاركة في عملية التطوير قدر الإمكان من خلال الإبلاغ عن الأخطاء أو المساهمة ^برمز40. مكتوب في بايثون ، لا يعتمد البرنامج على مكونات خاصة. إن اختيار أجهزة الكمبيوتر المحمولة Jupyter كوجهات مستخدم يسهل فحص البيانات في كل خطوة تحليل ويسمح بتخصيص وتوسيع خط الأنابيب خصيصا للنظام التجريبي في متناول اليد. تعمل مكتبة sdt-python32 كأساس وتنفذ وظائف لتقييم بيانات الفحص المجهري الفلوري ، مثل توطين جزيء واحد ، وتحليل الانتشار ، وتحليل كثافة التألق ، وتسجيل قناة اللون ، وتحليل التوطين المشترك ، ومعالجة عائد الاستثمار.

من حيث المبدأ ، يمكن إجراء تتبع جسيم واحد في أنظمة أحادية أو ثنائية أو ثلاثية الأبعاد. هنا ، تم تصميم خط أنابيب تحليل الجزيء الواحد لدراسة أنظمة الهاتف المحمول 2D. يعكس هذا الاختيار توافر أنظمة بسيطة ، مثل الطبقات الثنائية للدهون المدعومة بالمستوي (SLBs) ، لتقديم مجسات الفلورسنت المتنقلة. تتكون أنظمة الطبقة الثنائية الدهنية هذه عادة من اثنين أو أكثر من الدهون الفوسفاتية ، حيث يحدد الكسر السائب المعلمات الفيزيائية الكيميائية الرئيسية ل SLB (مثل الطور واللزوجة) ، ويوفر الكسر الصغير مواقع التعلق للجزيئات الحيوية. يمكن أن تكون مواقع التعلق هذه فوسفوليبيدات بيوتينيل لمنصات البروتين القائمة على أفيدين أو ستريبتافيدين أو الدهون الفوسفاتية المترافقة مع النيكل NTA لمنصات البروتين مع علامات ^{الهيستيدين41}. يعتمد اختيار المنصة المناسبة لربط البروتينات ب SLB على السؤال العلمي. يمكن للقراء الرجوع إلى ^{الأدبيات16،38،42} للحصول على أمثلة على الاستراتيجيات المستخدمة بنجاح. يجب أن تكون كثافة المجسات في العينة منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب وظائف انتشار النقاط المتداخلة ؛ عادة ، يوصى بأقل من 0.1 جزيء لكل ميكرومتر ² . انظر قسم النتائج التمثيلية (على وجه الخصوص ، الشكل 6) للحصول على مثال يوضح كثافة مسبار مناسبة. تنطبق طريقة التحليل أيضا على جزيئات البروتين المفردة ذات العلامات الفلورية المنتشرة في الغشاء البلازمي للخلايا الحية.

أحد الجوانب الحاسمة لتجارب smFRET هو إنتاج وتوصيف تحقيقات FRET نفسها. عند اختيار الفلوروفورات لزوج FRET ، يجب أن يتطابق نصف قطر Förster مع المسافات المتوقعة بين ^{الأصباغ43}. يفضل استخدام الأصباغ المقاومة للتبييض الضوئي لأنها تنتج آثارا طويلة الأمد. ومع ذلك ، بالنسبة لمعدلات التبييض المرتفعة ، يمكن استخدام نوع واحد من الفلوروفور للتعرف على الأحداث متعددة الباعث الناشئة عن جزيئات متمركزة عن طريق تحليل التبييض الضوئي التدريجي؛ راجع الخطوة 8.1.4 في قسم البروتوكول. يجب أن تكون أزواج الفلوروفور مرتبطة بشكل خاص بالموقع وساهميا بالجزيئات ذات الأهمية ، وتشكيل أزواج FRET داخل أو بين الجزيئات.

يمكن أن يؤدي الجمع بين smFRET والتقنيات الأخرى المتاحة بسهولة إلى زيادة استبانته المكانية إلى ما وراء حد الحيود (عبر ^STED44). تعمل خوارزمية تتبع smFRET المعروضة هنا على توسيع نطاق تطبيق النهج على الإعدادات التجريبية الجديدة وأنظمة النماذج. ويشمل ذلك دراسات (i) التغيرات الحركية في قياس الجزيئات الحيوية المتنقلة، (ii) الارتباط الديناميكي للجزيئات الحيوية المتنقلة، (iii) معدل التفاعلات الأنزيمية للتفاعلات المتفاعلة المنتشرة بحرية، و (iv) حركية التغيرات التوافقية للجزيئات الحيوية المتنقلة. يتطلب المثالان الأولان أنظمة نموذجية تظهر FRET بين الجزيئات ، أي أن المتبرع والمتقبل مقترنان بكيانات جزيئية حيوية منفصلة ذات أهمية. قد تستفيد الأمثلة الأخيرة من أجهزة الاستشعار الحيوية التي تحمل المتبرع والمتقبل داخل نفس الكيان الجزيئي (FRET داخل الجزيئات).

يمكن أن توفر المستشعرات القائمة على FRET داخل الجزيئية نظرة ثاقبة على التغيرات التوافقية الجوهرية للجزيئات ^{الحيوية1،2،3،4} ، أو التغيرات التوافقية الناجمة عن حمل القوة الذاتية أو الخارجية (مستشعرات القوة ^{الجزيئية16}) ، أو تركيزات الأيونات في البيئة النانوية مثل ^{الكالسيوم45} و ^pH46 . واعتمادا على النظام النموذجي ومنصة الإرساء المفضلة، يمكن تتبع أحداث smFRET هذه إما في 2D أو 3D: (i) يمكن استخدام التتبع المستوي لأحداث smFRET لتحديد كمية أوقات تفاعل المستقبلات مع الليغاند داخل غشاء البلازما، وارتباط سلاسل تضخيم الإشارة المرتبطة بالغشاء، وتغيرات قياس الستويشيومتري للمستقبلات السطحية؛ (ii) يمكن استخدام تتبع حجم أحداث smFRET لأي مجسات FRET داخل أو بين الجزيئات في الخلايا الحية أو في الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر .

تم تطوير طريقة تتبع smFRET بشكل رئيسي مع وضع مجسات FRET داخل الجزيئات في الاعتبار. تتميز هذه المجسات بعدد ثابت ومعروف من ملصقات الفلورسنت ، وهي حقيقة تم استغلالها لرفض البيانات من الجزيئات المتكتلة والمركبة بشكل غير صحيح (على سبيل المثال ، غير المصنفة بشكل كامل) ، وكذلك من المجسات التي تم فيها تبييض أحد الفلوروفورات ضوئيا. ومع ذلك ، من خلال ضبط خطوات التصفية ، يمكن أيضا تطبيق الطريقة على مجسات FRET بين الجزيئية. على سبيل المثال، بدلا من قبول الجزيئات التي تضم متبرعا واحدا وفلوروفور متقبلا واحدا فقط، يمكن للمرء أن يدرس المسارات المكانية للأصباغ المانحة والمتقبلة ويختار، على سبيل المثال، للمسارات المشتركة بين المتبرع والمتقبل.

نظرا لأن خوارزمية 3D-DAOSTORM لديها دعم لتحديد موقع الإشارة على طول المحور البصري عبر الاستجماتيزم بسبب عدسة أسطوانية في مسار شعاع الانبعاثات ، يمكن دمج تجارب 3D بسهولة في خط أنابيب التحليل. في هذه الحالة ، ستعمل إشارة المستقبل عند إثارة المتقبل على تحديد قياس stoichiometry والموقف المحوري. يمكن أيضا استخدام برنامج التحليل لتقييم البيانات من التجارب التي تتميز بتحقيقات مجمدة من خلال استخدام درجة كبيرة من الأتمتة ومخططات التصفية. في الواقع ، تم تحليل مجموعات بيانات كفاءة smFRET من تقاطعات هوليداي المجمدة على الطبقات الثنائية للطور ^{الهلامي38} باستخدام إصدار مبكر من البرنامج.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)	Avanti Polar Lipids	790404P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375P
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective	Zeiss	000000-1084-514
Axio Observer microscope body	Zeiss
Bandpass filter	Chroma Technology Corp	ET570/60m	donor emission filter
Bandpass filter	Chroma Technology Corp	ET675/50m	acceptor emission filter
conda-forge	conda-forge community		community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda
Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5	MENZEL
Dichroic mirror	Semrock Inc	FF640-FDi01-25×36	separation of donor and acceptor emission
Dichroic mirror (quad band)	Semrock Inc	Di01-R405/488/532/635-25×36	separation of excitation and emission light
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
FCS	Sigma-Aldrich	F7524	for imaging buffer
fret-analysis	Schütz group at TU Wien		Python package for smFRET data analysis; version 3
Fura-2 AM	Thermo Fisher Scientific	11524766
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	for imaging buffer
iBeam Smart 405-S 405 nm laser	Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD camera	Andor Technology Ltd
Lab-Tek chambers (8 wells)	Thermo Fisher Scientific	177402PK	for sample preparation and imaging
Millenia Prime 532 nm laser	Spectra Physics
miniconda	Anaconda Inc.		Python 3 distribution. Min. version: 3.7
Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)	Addgene	20860 & 20859
OBIS 640 nm laser	Coherent Inc	1185055
Optosplit II	Cairn Research
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5253	for imaging buffer
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
sdt-python	Schütz group at TU Wien		Python library for data analysis; version 17
TetraSpek bead size kit	Thermo Fisher Scientific	T14792	Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration
USC500TH Ultrasound bath	VWR		for SUV formation