A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
نحن نقدم طريقة لحقن الخلايا عبر تقنية Waterjet الخالية من الإبر إلى جانب تكملة من تحقيقات ما بعد الولادة من حيث الجدوى الخلوية والانتشار وقياسات المرونة.
سلس البول (UI) هو حالة منتشرة للغاية تتميز بنقص العضلة العاصرة للإحليل. فروع الطب التجديدي ، وخاصة العلاج الخلوي ، هي أساليب جديدة لتحسين واستعادة وظيفة العضلة العاصرة للإحليل. على الرغم من أن حقن الخلايا الوظيفية النشطة يتم إجراؤه بشكل روتيني في الإعدادات السريرية عن طريق الإبرة والحقنة ، إلا أن هذه الأساليب لها عيوب وقيود كبيرة. في هذا السياق ، تعد تقنية Waterjet الخالية من الإبر (WJ) طريقة مجدية ومبتكرة يمكنها حقن خلايا قابلة للحياة عن طريق تنظير المثانة الموجه بصريا في العضلة العاصرة للإحليل. في هذه الدراسة ، استخدمنا WJ لتوصيل الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير (pADSCs) إلى أنسجة مجرى البول الجثة، ثم حققنا في تأثير توصيل WJ على إنتاجية الخلايا وقابليتها للحياة. قمنا أيضا بتقييم السمات الميكانيكية الحيوية (أي المرونة) بواسطة قياسات مجهر القوة الذرية (AFM). لقد أظهرنا أن PADSC التي قدمتها WJ قد انخفضت بشكل كبير في مرونتها الخلوية. كانت الجدوى أقل بكثير مقارنة بالضوابط ولكنها لا تزال أعلى من 80٪.
سلس البول (UI) هو اضطراب واسع الانتشار مع انتشار 1.8 - 30.5 ٪ في السكان الأوروبيين1 ويتميز في المقام الأول عن طريق خلل في العضلة العاصرة للإحليل. من منظور سريري ، غالبا ما يتم تقديم العلاج الجراحي للمرضى عندما تفشل العلاجات المحافظة أو العلاج الطبيعي في معالجة الأعراض الناشئة والتخفيف من حدتها.
ظهر العلاج الخلوي للإصلاح التجديدي المحتمل لخلل مجمع العضلة العاصرة كنهج طليعي لعلاج أمراض UI 2,3. أهدافها الرئيسية هي استبدال وإصلاح واستعادة الوظائف البيولوجية للأنسجة التالفة. في النماذج الحيوانية لواجهة المستخدم ، أظهرت زراعة الخلايا الجذعية نتائج واعدة في نتائج ديناميكا البول2،4،5. تنشأ الخلايا الجذعية كمرشحة خلوية مثالية لأنها تتمتع بالقدرة على الخضوع للتجديد الذاتي والتمايز متعدد القدرات ، وبالتالي ، تساعد على تجديد الأنسجة المصابة6. على الرغم من إمكانات التجدد القادمة ، لا يزال الاستخدام العملي للعلاج بالخلايا معوقا لأن توصيل الخلايا بأقل قدر من التدخل الجراحي لا يزال يواجه العديد من التحديات المتعلقة بدقة الحقن وتغطية الهدف. على الرغم من أن النهج الحالي المستخدم لتوصيل الخلايا هو الحقن من خلال نظام حقنة الإبرة7 ، إلا أنه عادة ما يؤدي إلى عجز عام في الخلايا القابلة للحياة ، مع انخفاض الجدوى المبلغ عنها إلى 1٪ - 31٪ بعد الزرع8. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أيضا أن توصيل الخلايا عن طريق حقن الإبرة يؤثر على الوضع ، ومعدل الاحتفاظ ، وكذلك توزيع الخلايا المزروعة في الأنسجة المستهدفة9،10،11. هناك نهج عملي وجديد يتغلب على القيد المذكور أعلاه وهو توصيل الخلايا الخالية من الإبر عبر تقنية المياه النفاثة.
تظهر تقنية Waterjet (WJ) كنهج جديد يتيح توصيل الخلايا عالية الإنتاجية بواسطة منظار المثانة تحت السيطرة البصرية في العضلة العاصرة للإحليل12,13. يتيح WJ توصيل الخلايا عند ضغوط مختلفة (E = تأثيرات في البار) تتراوح من E5 إلى E8013. في المرحلة الأولى ، يتم تطبيق محلول متساوي التوتر (مرحلة اختراق الأنسجة) بضغط عال (أي E60 أو E80) من أجل تخفيف المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالأنسجة المستهدفة وفتح ثغرات صغيرة مترابطة صغيرة. في المرحلة الثانية (مرحلة الحقن) ، يتم خفض الضغط في غضون مللي ثانية (أي حتى E10) من أجل توصيل الخلايا بلطف إلى الأنسجة المستهدفة. بعد هذا التطبيق المكون من مرحلتين ، لا تتعرض الخلايا لضغط إضافي ضد الأنسجة عند إخراجها ولكنها تطفو في تيار منخفض الضغط في منطقة كهفية مملوءة بالسائل13. في إعداد نموذج خارج الجسم الحي حيث تم حقن الخلايا الجذعية عبر WJ في أنسجة مجرى البول الجثة، يمكن بعد ذلك شفط الخلايا القابلة للحياة واسترجاعها من الأنسجة وتوسيعها في المختبر13. على الرغم من أن دراسة أجريت عام 2020 من قبل Weber et al. أظهرت جدوى وقابلية تطبيق WJ لتقديم خلايا عضلة القلب الخالية من البصمة في عضلة القلب14 ، إلا أنه يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن تقنية WJ لا تزال في مرحلة النموذج الأولي.
يصف البروتوكول التالي كيفية تحضير وتسمية الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير (pADSC) وكيفية توصيلها إلى أنسجة سائلة وجثث عبر تقنية WJ وإبر تنظير المثانة من ويليامز (WN). بعد الحقن الخلوي ، يتم تقييم الحيوية الخلوية والمرونة عبر مجهر القوة الذرية (AFM). من خلال تعليمات خطوة بخطوة ، يوفر البروتوكول نهجا واضحا وموجزا للحصول على بيانات موثوقة. يعرض قسم المناقشة ويصف المزايا الرئيسية والقيود والمنظورات المستقبلية لهذه التقنية. إن تسليم WJ للخلايا بالإضافة إلى تحليلات ما بعد ترجمة التتمة المذكورة هنا تحل محل حقن الإبرة القياسي وتوفر إطارا قويا لتوصيل الخلايا للشفاء التجديدي للأنسجة المستهدفة. في دراساتنا الأخيرة قدمنا أدلة على أن WJ سلمت الخلايا بشكل أكثر دقة وعلى الأقل في قابلية مماثلة عند مقارنتها بحقن الإبرة15,16.
تم الحصول على عينات الأنسجة الدهنية الخنازير من معهد الجراحة التجريبية في جامعة توبنغن. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل سلطات رعاية الحيوان المحلية تحت رقم التجربة على الحيوانات CU1/16.
1. عزل الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير
2. زراعة الخلايا من الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير
3. وضع العلامات على الخلايا مع الكالسيين-AM
ملاحظة: الخلايا التي يتم حقنها في أنسجة الجثث ملطخة ببقعة خلايا حية قابلة للنفاذ إلى الغشاء الأخضر الفلوري ومؤشر جدوى غشاء أحمر فلورسنت غير مقصود للتحقق من أن الخلايا المستخرجة هي نفسها الخلايا المحقونة وليست شظايا الأنسجة في مجرى البول.
4. إعداد عينات من أنسجة مجرى البول للحقن
5. حقن الخلايا عن طريق إبرة ويليامز في عينات السوائل والأنسجة
6. حقن الخلايا عن طريق Waterjet في عينات السوائل والأنسجة
7. التقييم الميكانيكي الحيوي للمرونة الخلوية بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM)
8. التحليل الإحصائي
بعد توصيل الخلايا عبر النهجين ، كانت صلاحية الخلايا التي يتم تسليمها من خلال WN (97.2 ± 2٪ ، n = 10 ، p<0.002) أعلى عند مقارنتها بالحقن بواسطة WJ باستخدام إعدادات E60-10 (85.9 ± 0.16٪ ، n = 12) (الشكل 2). أظهرت نتائج التقييم البيوميكانيكي أن: حقن WN للخلايا في سائل الالتقاط لم تظهر فرقا كبيرا فيما يت?...
في هذه الدراسة ، أظهرنا وقدمنا نهجا خطوة بخطوة لإجراء توصيل خلايا WJ واستخدمنا تكملة من التحقيقات الكمية لتقييم تأثير تسليم WJ على الخصائص الخلوية: الجدوى الخلوية والميزات الميكانيكية الحيوية (أي EM). بعد حقن WJ ، كانت 85.9٪ من الخلايا التي تم حصادها قابلة للحياة. من حيث حقن WN ، احتفظت 97.2٪ من الخل...
أصحاب البلاغ J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. ليس لديهم ما يكشفون عنه. المؤلفان W.L. و M.D.E. موظفان في ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen ، منتج ERBEJet2 والنموذج الأولي WJ المستخدم في هذه الدراسة.
نشكر المؤلفين المشاركين من المنشورات الأصلية على مساعدتهم ودعمهم.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
AFM software | Bruker | JPK00518 | |
AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
laboratory bags | Brand | 759705 | |
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved