JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نقدم طريقة لحقن الخلايا عبر تقنية Waterjet الخالية من الإبر إلى جانب تكملة من تحقيقات ما بعد الولادة من حيث الجدوى الخلوية والانتشار وقياسات المرونة.

Abstract

سلس البول (UI) هو حالة منتشرة للغاية تتميز بنقص العضلة العاصرة للإحليل. فروع الطب التجديدي ، وخاصة العلاج الخلوي ، هي أساليب جديدة لتحسين واستعادة وظيفة العضلة العاصرة للإحليل. على الرغم من أن حقن الخلايا الوظيفية النشطة يتم إجراؤه بشكل روتيني في الإعدادات السريرية عن طريق الإبرة والحقنة ، إلا أن هذه الأساليب لها عيوب وقيود كبيرة. في هذا السياق ، تعد تقنية Waterjet الخالية من الإبر (WJ) طريقة مجدية ومبتكرة يمكنها حقن خلايا قابلة للحياة عن طريق تنظير المثانة الموجه بصريا في العضلة العاصرة للإحليل. في هذه الدراسة ، استخدمنا WJ لتوصيل الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير (pADSCs) إلى أنسجة مجرى البول الجثة، ثم حققنا في تأثير توصيل WJ على إنتاجية الخلايا وقابليتها للحياة. قمنا أيضا بتقييم السمات الميكانيكية الحيوية (أي المرونة) بواسطة قياسات مجهر القوة الذرية (AFM). لقد أظهرنا أن PADSC التي قدمتها WJ قد انخفضت بشكل كبير في مرونتها الخلوية. كانت الجدوى أقل بكثير مقارنة بالضوابط ولكنها لا تزال أعلى من 80٪.

Introduction

سلس البول (UI) هو اضطراب واسع الانتشار مع انتشار 1.8 - 30.5 ٪ في السكان الأوروبيين1 ويتميز في المقام الأول عن طريق خلل في العضلة العاصرة للإحليل. من منظور سريري ، غالبا ما يتم تقديم العلاج الجراحي للمرضى عندما تفشل العلاجات المحافظة أو العلاج الطبيعي في معالجة الأعراض الناشئة والتخفيف من حدتها.

ظهر العلاج الخلوي للإصلاح التجديدي المحتمل لخلل مجمع العضلة العاصرة كنهج طليعي لعلاج أمراض UI 2,3. أهدافها الرئيسية هي استبدال وإصلاح واستعادة الوظائف البيولوجية للأنسجة التالفة. في النماذج الحيوانية لواجهة المستخدم ، أظهرت زراعة الخلايا الجذعية نتائج واعدة في نتائج ديناميكا البول2،4،5. تنشأ الخلايا الجذعية كمرشحة خلوية مثالية لأنها تتمتع بالقدرة على الخضوع للتجديد الذاتي والتمايز متعدد القدرات ، وبالتالي ، تساعد على تجديد الأنسجة المصابة6. على الرغم من إمكانات التجدد القادمة ، لا يزال الاستخدام العملي للعلاج بالخلايا معوقا لأن توصيل الخلايا بأقل قدر من التدخل الجراحي لا يزال يواجه العديد من التحديات المتعلقة بدقة الحقن وتغطية الهدف. على الرغم من أن النهج الحالي المستخدم لتوصيل الخلايا هو الحقن من خلال نظام حقنة الإبرة7 ، إلا أنه عادة ما يؤدي إلى عجز عام في الخلايا القابلة للحياة ، مع انخفاض الجدوى المبلغ عنها إلى 1٪ - 31٪ بعد الزرع8. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أيضا أن توصيل الخلايا عن طريق حقن الإبرة يؤثر على الوضع ، ومعدل الاحتفاظ ، وكذلك توزيع الخلايا المزروعة في الأنسجة المستهدفة9،10،11. هناك نهج عملي وجديد يتغلب على القيد المذكور أعلاه وهو توصيل الخلايا الخالية من الإبر عبر تقنية المياه النفاثة.

تظهر تقنية Waterjet (WJ) كنهج جديد يتيح توصيل الخلايا عالية الإنتاجية بواسطة منظار المثانة تحت السيطرة البصرية في العضلة العاصرة للإحليل12,13. يتيح WJ توصيل الخلايا عند ضغوط مختلفة (E = تأثيرات في البار) تتراوح من E5 إلى E8013. في المرحلة الأولى ، يتم تطبيق محلول متساوي التوتر (مرحلة اختراق الأنسجة) بضغط عال (أي E60 أو E80) من أجل تخفيف المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالأنسجة المستهدفة وفتح ثغرات صغيرة مترابطة صغيرة. في المرحلة الثانية (مرحلة الحقن) ، يتم خفض الضغط في غضون مللي ثانية (أي حتى E10) من أجل توصيل الخلايا بلطف إلى الأنسجة المستهدفة. بعد هذا التطبيق المكون من مرحلتين ، لا تتعرض الخلايا لضغط إضافي ضد الأنسجة عند إخراجها ولكنها تطفو في تيار منخفض الضغط في منطقة كهفية مملوءة بالسائل13. في إعداد نموذج خارج الجسم الحي حيث تم حقن الخلايا الجذعية عبر WJ في أنسجة مجرى البول الجثة، يمكن بعد ذلك شفط الخلايا القابلة للحياة واسترجاعها من الأنسجة وتوسيعها في المختبر13. على الرغم من أن دراسة أجريت عام 2020 من قبل Weber et al. أظهرت جدوى وقابلية تطبيق WJ لتقديم خلايا عضلة القلب الخالية من البصمة في عضلة القلب14 ، إلا أنه يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن تقنية WJ لا تزال في مرحلة النموذج الأولي.

يصف البروتوكول التالي كيفية تحضير وتسمية الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير (pADSC) وكيفية توصيلها إلى أنسجة سائلة وجثث عبر تقنية WJ وإبر تنظير المثانة من ويليامز (WN). بعد الحقن الخلوي ، يتم تقييم الحيوية الخلوية والمرونة عبر مجهر القوة الذرية (AFM). من خلال تعليمات خطوة بخطوة ، يوفر البروتوكول نهجا واضحا وموجزا للحصول على بيانات موثوقة. يعرض قسم المناقشة ويصف المزايا الرئيسية والقيود والمنظورات المستقبلية لهذه التقنية. إن تسليم WJ للخلايا بالإضافة إلى تحليلات ما بعد ترجمة التتمة المذكورة هنا تحل محل حقن الإبرة القياسي وتوفر إطارا قويا لتوصيل الخلايا للشفاء التجديدي للأنسجة المستهدفة. في دراساتنا الأخيرة قدمنا أدلة على أن WJ سلمت الخلايا بشكل أكثر دقة وعلى الأقل في قابلية مماثلة عند مقارنتها بحقن الإبرة15,16.

Protocol

تم الحصول على عينات الأنسجة الدهنية الخنازير من معهد الجراحة التجريبية في جامعة توبنغن. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل سلطات رعاية الحيوان المحلية تحت رقم التجربة على الحيوانات CU1/16.

1. عزل الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير

  1. استخدم الأنسجة الدهنية الخنازير التي يتم تسليمها من معهد الجراحة التجريبية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل إلى المختبر.
  2. انقل الأنسجة إلى طبق بتري معقم تحت المقعد المعقم وفرمه بمشرطين (رقم 10) إلى شظايا صغيرة وفطر.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام المقص للحصول على شظايا صغيرة. كلما كانت الشظايا أصغر ، كان ذلك أفضل لعملية الهضم التالية.
    1. انقل الشظايا الصغيرة / الهريسة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واحتضنها بمحلول مجانس 5 مل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر. الحل المجانس هو PBS مع 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) (محلول الأسهم: 1٪ (ث / v) BSA في PBS) و 0.1٪ كولاجيناز من النوع الأول.
      ملاحظة: قم دائما بإعداد محلول مجانس طازجا. يحتوي الخلاط على حركة اهتزاز دائرية بسرعة بطيئة تتراوح بين 25 و 500 دورة في الدقيقة.
  3. لوقف الحضانة ، أضف 10 مل من وسائط النمو [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - Low glucose (DMEM-LG) ، و 2.5٪ محلول ملح الصوديوم HEPES (1 M) ، و 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) ، و 1٪ L-Glutamin (200 mM) ، و 1٪ Penicillin-Streptomycin (10000 U / mL Penicillin ؛ 10000 ميكروغرام / مل Streptomycin) و 1٪ Amphotericin B (250 ميكروغرام / مل)].
    ملاحظة: يمكن إعداد وسائط النمو مسبقا. المضادات الحيوية والأدوية المضادة للفطريات ضرورية في إعداد وسائط النمو لزراعة الخلايا لحماية الخلايا من التلوث.
  4. احتضان أنابيب الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. استنشق الكسر بالخلايا الشحمية ، وهو أخف وزنا وبالتالي يسبح فوق السائل ، باستخدام ماصة 10 مل وتخلص منها.
  6. قم بتصفية الجزء اللحمي المتبقي من خلال غربال خلية 100 ميكرومتر باستخدام غشاء البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) الخالي من المعادن الثقيلة لحجب شظايا الأنسجة الدهنية واسترداد تعليق الخلية فقط.
  7. جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية المصفى لمدة 7 دقائق عند 630 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  8. أعد تعليق بيليه الخلية في 2 مل من PBS لغسل الخلايا مرة واحدة.
  9. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية مرة أخرى لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة.
  10. بعد الطرد المركزي وإعادة التعليق المتكرر لحبيبات الخلية في 10 مل من وسائط النمو لكل قارورة ، تتكاثر خلايا البذور في قوارير زراعة الخلايا 75 سم2 .
    ملاحظة: اعتمادا على حجم بيليه الخلية بعد خطوة الغسيل باستخدام PBS ، فإن خلايا البذور في واحد إلى أربعة قوارير.

2. زراعة الخلايا من الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير

  1. خلايا الحصاد والمرور عندما تصل إلى 70٪ من الالتقاء.
  2. اغسل الخلايا ب 10 مل من PBS مرتين واستطلع PBS تماما.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة وسائط النمو المتبقية، والتي تكملها 10٪ FBS. يحتوي FBS على العديد من مثبطات الأنزيم البروتيني التي يمكن أن تعيق وظيفة التربسين التالي.
  3. أضف 3 مل من 0.05٪ -Trypsin-EDTA لكل قارورة لفصل الخلايا.
  4. احتضان القوارير لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا منفصلة.
    ملاحظة: في بعض الأحيان يستغرق الأمر بعض الوقت لفصل الخلايا. في هذه الحالة ، احتضان القوارير لمدة أقصاها 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  6. لوقف عملية الحضانة والانفصال ، أضف 3 مل من وسائط النمو.
    ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه، يتم استكمال وسائط النمو بنسبة 10٪ FBS التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني.
  7. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي وأجهزة طرد مركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  8. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسائط النمو وعدها باستخدام مقياس الدم.
  9. خلايا البذور بكثافة تلقيح 3 × 105 خلايا لكل 75 سم2 قارورة.

3. وضع العلامات على الخلايا مع الكالسيين-AM

ملاحظة: الخلايا التي يتم حقنها في أنسجة الجثث ملطخة ببقعة خلايا حية قابلة للنفاذ إلى الغشاء الأخضر الفلوري ومؤشر جدوى غشاء أحمر فلورسنت غير مقصود للتحقق من أن الخلايا المستخرجة هي نفسها الخلايا المحقونة وليست شظايا الأنسجة في مجرى البول.

  1. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 مل من PBS.
  2. أضف 5 مل من محلول الصبغة لكل قارورة 75 سم2 . يتكون محلول الصبغة من وسائط نمو مع 2 ميكرومتر من صبغة الخلايا الحية ذات الغشاء الأخضر الفلوري النافذ ومؤشر جدوى الغشاء الأحمر الفلوري 4 ميكرومتر.
  3. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. شفط وتجاهل محلول الصبغة.
  5. اغسل الخلايا مرة أخرى مرتين باستخدام 10 مل من PBS.
  6. أضف وسائط نمو ووثق إشارة التألق الخضراء والحمراء بواسطة المجهر الفلوري.
    1. ضع القارورة 75 سم2 على طاولة المجهر ، واستخدم الهدف 10x ، وحدد عدم وجود مرشح تألق وتأكد من أن مسار الضوء المنقول نشط.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع هذه الخطوات يدويا على المجهر.
    2. بالتوازي مع الخطوة 3.6.1، افتح البرنامج.
    3. اضغط على الزر Live (تم ) أسفل علامة التبويب تحديد الموقع ( تحديد الموقع) للحصول على صورة حية للخلايا الموجودة في القارورة على الطاولة والتركيز عليها باستخدام محركات أقراص الضبط الخشنة والدقيقة.
      ملاحظة: على مرمى البصر الصحيح ستظهر الصورة الحية بمجرد تنشيط الزر "بث مباشر ".
    4. في علامة التبويب الفرعية مكونات المجهر، حدد الهدف الصحيح (10x).
    5. في علامة التبويب الفرعية الكاميرا، قم بتطبيق علامة اختيار للتعريض الضوئي التلقائي.
    6. اضغط على الزر Snap (محاذاة ) لالتقاط الصورة الأولى باستخدام الضوء المرسل.
    7. أدخل شريط المقياس باستخدام علامة التبويب رسومات في شريط القوائم وحدد شريط القياس.
    8. احفظ الصورة باستخدام علامة التبويب ملفات في شريط القوائم وحدد حفظ باسم czi.
    9. بالنسبة لصور التألق ، قم بتغيير المرشح إلى المرشح المحدد للتألق الأخضر أو الأحمر وحدد مسار الضوء المنعكس.
      ملاحظة: يجب إجراء هذه التغييرات يدويا على المجهر.
    10. اضغط مرة أخرى على الزر Live (لاذخ) ضمن علامة التبويب تحديد الموقع للحصول على صورة حية للخلايا.
    11. اضغط على الزر Snap (محاذاة ) لالتقاط الصورة الثانية باستخدام التألق الأخضر أو الأحمر.
    12. أدخل شريط المقياس باستخدام علامة التبويب رسومات في شريط القوائم وحدد شريط القياس.
    13. احفظ الصورة باستخدام علامة التبويب ملفات في شريط القوائم وحدد حفظ باسم czi.
    14. كرر الخطوات من 3.6.9 إلى 3.6.13 مع قناة التألق الأخرى.

4. إعداد عينات من أنسجة مجرى البول للحقن

  1. تشريح مجرى البول والمثانة المتصلة من الخنزير.
    ملاحظة: تم استخدام عينات أنسجة مجرى البول من عينات الجثث الطازجة من خنازير السلالة البرية البالغة في التجارب.
  2. نقله إلى المختبر في أكياس على الجليد الرطب.
    ملاحظة: يجب ترك العينات على الجليد حتى مزيد من المعالجة. لم تتم إضافة أي إضافات إلى العينات.
  3. ضع مجرى البول مع المثانة على إسفنجة ، والتي تحاكي مرونة قاع الحوض السفلي.
    1. استخدم المثانة لتحديد الاتجاه (القريب والبعيد والظهري والبطني) للإحليل. هذا ممكن بسبب توطين الحالب والأربطة الثلاثة التي تثبت المثانة في تجويف البطن والحوض. الأربطة الثلاثة هي الأربطة الجانبية الحويصلة على جانبي المثانة و vesicae medianum ، والتي تنشأ من السطح البطني للمثانة (الشكل 1).
  4. اقطع مجرى البول طوليا على الجانب الظهري بمساعدة قسطرة.
  5. حقن الخلايا في مجرى البول المفتوح كما هو موضح في الفصول التالية.

5. حقن الخلايا عن طريق إبرة ويليامز في عينات السوائل والأنسجة

  1. حصاد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.
  2. على النقيض من الخطوة 2.9 ، اضبط كثافة الخلايا للحقن على 2.4 × 106 خلايا لكل مل.
    ملاحظة: بالنسبة للحقن في عينات الأنسجة ، قم بتسمية الخلايا بخلية حية قابلة للنفاذ إلى غشاء الفلورسنت الأخضر.
  3. استنشق تعليق الخلية باستخدام حقنة وقم بتطبيق إبرة الحقن بالمنظار المثانة (WN) من ويليامز عليها.
  4. إما أن تمسك الإبرة فوق 2 مل من وسائط النمو بقليل في أنبوب طرد مركزي 15 مل أو تدخل الإبرة في أنسجة مجرى البول المفتوحة. في كلتا الحالتين حقن 250 ميكرولتر من الخلايا يدويا.
    ملاحظة: الخلايا التي يتم حقنها في مجرى البول الجثوي تشكل قبة حقن.
  5. جمع الخلايا التي يتم حقنها في الوسائط مباشرة عن طريق الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة.
  6. بالنسبة للخلايا التي يتم حقنها في مجرى البول الجثة، قم بسحبها من قبة الحقن باستخدام إبرة 18G مطبقة على حقنة.
  7. انقل الخلايا المحقونة والمستنشقة إلى أنبوب طرد مركزي وأجهزة طرد مركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة مقارنة بالخلايا المحقونة في الوسائط.
  8. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في 4 مل من وسائط النمو في كلتا الحالتين.
  9. تحديد إنتاجية الخلايا وقابليتها للحياة بمساعدة استبعاد صبغة تريبان الزرقاء باستخدام مقياس الدم.
    1. امزج 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا جيدا مع 20 ميكرولتر من التربان الأزرق.
    2. املأ 10 ميكرولتر من هذا الخليط في كل غرفة من مقياس الدم.
      ملاحظة: يتم ملء كلا الغرفتين وحسابهما للحصول على التحسين الإحصائي عن طريق مضاعفة أخذ العينات.
    3. تحت المجهر ، عد الخلايا في جميع مربعات الزاوية الأربعة.
      ملاحظة: عد الخلايا اللامعة باللون الأبيض (غير الملطخ) كخلايا قابلة للحياة بينما تحسب الخلايا اللامعة باللون الأزرق (الملطخ) كخلايا ميتة.
    4. لحساب رقم الخلية لكل مل ، احسب متوسط الغرفتين ، واقسم هذا الرقم على اثنين واضربه في 104.

6. حقن الخلايا عن طريق Waterjet في عينات السوائل والأنسجة

  1. حصاد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.
  2. على النقيض من الخطوتين 2.9 و 5.2 ، اضبط كثافة الخلايا للحقن على 6 × 106 خلايا لكل مل.
    ملاحظة: بالنسبة للحقن في عينات الأنسجة ، استخدم الخلايا الموسومة بخلية حية منفذة بالغشاء الأخضر الفلورسنت.
  3. املأ تعليق الخلية في وحدة الجرعات الخاصة بجهاز WJ.
  4. إما أن تمسك فوهة الحقن فوق 2 مل من وسائط النمو بقليل في أنبوب طرد مركزي 15 مل أو فوق أنسجة مجرى البول المفتوحة بقليل.
  5. في كلتا الحالتين حقن 100 ميكرولتر من الخلايا بواسطة الجهاز باستخدام ضغط عال لاختراق الأنسجة تليها مرحلة الضغط المنخفض لحقن الخلايا. استخدم إعدادات الضغط E60-10.
    ملاحظة: الخلايا التي يتم حقنها في مجرى البول الجثوي تشكل قبة حقن.
  6. جمع الخلايا التي يتم حقنها في الوسائط مباشرة عن طريق الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة.
  7. بالنسبة للخلايا التي يتم حقنها في مجرى البول الجثة، قم بسحبها من قبة الحقن باستخدام إبرة 18G مطبقة على حقنة.
  8. انقل الخلايا المحقونة والمستنشقة إلى أنبوب طرد مركزي وأجهزة طرد مركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة مقارنة بالخلايا المحقونة في الوسائط.
  9. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في 4 مل من وسائط النمو في كلتا الحالتين.
  10. حدد إنتاجية الخلية وقابليتها للحياة بمساعدة استبعاد صبغة تريبان الزرقاء باستخدام مقياس الدم كما هو موضح بالتفصيل في 5.10.

7. التقييم الميكانيكي الحيوي للمرونة الخلوية بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM)

  1. إعداد العينات
    ملاحظة: الخلايا المستردة بعد الحقن تخضع الآن لمزيد من التحليلات من قبل AFM. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام الخلايا التي لم يتم حقنها كعناصر تحكم.
    1. خلايا البذور في أطباق زراعة الأنسجة بكثافة 5 × 105 خلايا لكل طبق.
      ملاحظة: بذر طبق واحد من زراعة الأنسجة لكل حالة. الشروط هي الضوابط ، ADSCs التي يتم حقنها بواسطة WJ أو WN في الوسائط و ADSCs التي يتم حقنها بواسطة WJ أو WN في الأنسجة الجثة.
    2. احتضان الخلايا في أطباق زراعة الأنسجة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لتجنب الاختلافات بسبب الخلايا في مرحلة G1 وأثناء الانقسام ، أجرينا قياسات AFM بعد 3 ساعات من خطوة بذر الخلية.
    3. مباشرة قبل القياس باستخدام AFM ، استبدل وسائط النمو ب 3 مل من وسائط L-15 من Leibovitz بدون L-glutamine.
    4. ضع طبق زراعة الأنسجة في حامل العينة الخاص بجهاز AFM وقم بتشغيل سخان الأطباق بتري الذي تم ضبطه على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  2. إعداد AFM ومعايرة الكابولي
    1. استخدم كتلة زجاجية محددة للقياسات في السوائل واضبطها على حامل AFM.
      ملاحظة: يجب أن يكون السطح العلوي للكتلة الزجاجية مستقيما وموازيا لحامل AFM.
    2. ضع الكابولي بعناية على سطح الكتلة الزجاجية. يجب أن يقع الطرف A فوق المستوى البصري المصقول.
      ملاحظة: لا تخدش السطح البصري المصقول للكتلة الزجاجية لأن الخدوش قد تؤدي إلى تداخلات في القياسات. يجب أن يبرز الطرف A فوق المستوى البصري المصقول لأنه بخلاف ذلك ، فإن انعكاس ليزر AFM على الكاشف الضوئي غير ممكن.
    3. لتحقيق الاستقرار في الكابولي على الكتلة الزجاجية ، أضف نابضا معدنيا بمساعدة ملاقط.
    4. عندما يتم تثبيت الكابولي على الكتلة الزجاجية ، ضع الكتلة على رأس AFM وقم بقفل آلية القفل المدمجة.
    5. قم بتركيب رأس AFM على جهاز AFM.
      ملاحظة: يجب أن يواجه الزنبرك الجانب الأيسر ليتم وضعه بشكل صحيح. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتصحيح موضع الكتلة الزجاجية واضبط رأس AFM مرة أخرى.
    6. قم بتهيئة إعداد البرنامج وافتح البرنامج مع نافذة محاذاة الليزر وإعدادات معلمة النهج. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتشغيل محرك السائر وضوء الليزر وكاميرا CCD.
    7. حدد الطرف الكابولي A باستخدام كاميرا CCD.
    8. اخفض الكابولي حتى يتم غمسه بالكامل في الوسط. استخدم وظيفة محرك السائر للوصول إلى هذا الهدف.
    9. بمجرد تغطية الكابولي بالكامل بواسطة الوسط ، يتم محاذاة الليزر أعلى الكابولي باستخدام مسامير الضبط. يجب أن يسقط الشعاع المنعكس على مركز الكاشف الضوئي ويجب أن يكون مجموع الإشارات 1 فولت أو أعلى. يجب أن تكون الانحرافات الجانبية والرأسية قريبة من 0.
      ملاحظة: إذا تم الوصول إلى المركز يمكن مراقبته في وظيفة محاذاة الليزر وكذلك قيم الإشارة. إذا كانت قيم الإشارة غير صحيحة ، فمن الضروري إجراء مزيد من التعديلات.
    10. قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي الآن باستخدام معلمات النهج (الجدول 1).
    11. اسحب الكابولي بمقدار 100 ميكرومتر بمجرد وصوله إلى القاع عن طريق الضغط على زر التراجع .
      ملاحظة: تأكد من عدم إرفاق أي خلية في هذا الحقل إذا تم تنفيذ النهج لأن هذا من شأنه تزوير المعايرة.
    12. قم بإعداد معلمات التشغيل وفقا للمواصفات التالية: Setpoint 1 V ، طول السحب 90 ميكرومتر ، السرعة: 5 ميكرومتر / ثانية ، معدل العينة: 2000 هرتز وكوضع تأخير: قوة ثابتة.
    13. ابدأ قياس منحنى قوة المسافة للمعايرة بالضغط على الزر تشغيل.
      ملاحظة: بالنقر فوق الزر تشغيل في البرنامج ، يتم الحصول على منحنى مسافة القوة.
    14. حدد منطقة الملاءمة الخطية للمنحنى المسحوب في البرنامج على منحنى مسافة قوة المعايرة الذي تم الحصول عليه. حساب قياس ثابت الربيع بواسطة البرنامج.
    15. معايرة الكابولي باتباع المعلمات والخطوات الدقيقة كما وصفها Danalache et al.17.
  3. قياس مرونة الخلايا الفردية
    1. تحديد الخلية بصريا والتركيز عليها. ضع ماوس الكمبيوتر في منتصف الخلية. لتحسين دقة القياسات، ضع طرف AFM مباشرة فوق نواة الخلية.
      ملاحظة: يتم استخدام ماوس الكمبيوتر كعلامة مرئية لتحديد الموقع المستهدف للمسافة البادئة.
    2. الآن التركيز على الكابولي وتحريكه على ماوس الكمبيوتر.
    3. ابدأ القياس باستخدام Run باستخدام المعلمات الواردة في الجدول 2.
      ملاحظة: يتم استخدام معلمة نقطة الضبط التي تم الحصول عليها عن طريق معايرة الكابولي. علاوة على ذلك ، يتم قياس خلية واحدة ثلاث مرات. قياس ما لا يقل عن 50 خلية.
  4. معالجة البيانات
    1. قم بمعالجة البيانات باتباع الخطوات والمعلمات الدقيقة كما هو موضح سابقا بواسطة Danalache17.
    2. حفظ الملف وتصديره.

8. التحليل الإحصائي

  1. افتح البرنامج الإحصائي.
  2. اختر تحديد مجموعة بيانات جديدة.
    ملاحظة: يتم فتح ملفين. واحد هو "DataSet" والآخر هو ملف "الإخراج".
  3. حدد ملف DataSet وافتح علامة التبويب عرض المتغير .
  4. أدخل المتغيرات الرقمية لحقن الموقع (التقاط السائل أو الأنسجة الجثة) ، والفئة (التحكم ، حقن WJ ، حقن WN) والمرونة.
  5. أدخل بيانات المرونة المقاسة مع حقن الموقع المقابل لها ورقم الفئة في علامة التبويب عرض البيانات .
  6. تحليل البيانات عن طريق تحديد علامة التبويب شريط القوائم تحليل | الإحصاءات الوصفية واختر تحليل البيانات الاستكشافية.
  7. كمتغير تابع، حدد المرونة وقائمة العوامل حدد الفئة.
    ملاحظة: يتم عرض النتائج في ملف "الإخراج" بما في ذلك مخطط مربع يستخدم لقسم النتائج.
  8. لإجراء اختبار إحصائي، حدد العينات المستقلة ضمن الاختبار غير البارامتري ضمن علامة التبويب تحليل شريط القائمة.
  9. في الملف الجديد المفتوح ، احتفظ بالإعدادات في علامة التبويب الهدف والإعدادات.
  10. افتح علامة التبويب حقول واختر المرونة كحقول اختبار والفئة كمجموعات.
  11. اضغط على تشغيل.
    ملاحظة: يتم عرض النتائج في ملف "الإخراج". لهذه التحليلات يتم إجراء اختبار Mann-U-Whitney.
  12. قم بتضمين نتيجة الاختبار غير البارامتري في مخطط مربع تحليل البيانات الاستكشافية.
  13. احفظ الملفات عن طريق تحديد ملف في شريط القوائم واختيار حفظ.

النتائج

بعد توصيل الخلايا عبر النهجين ، كانت صلاحية الخلايا التي يتم تسليمها من خلال WN (97.2 ± 2٪ ، n = 10 ، p<0.002) أعلى عند مقارنتها بالحقن بواسطة WJ باستخدام إعدادات E60-10 (85.9 ± 0.16٪ ، n = 12) (الشكل 2). أظهرت نتائج التقييم البيوميكانيكي أن: حقن WN للخلايا في سائل الالتقاط لم تظهر فرقا كبيرا فيما يت?...

Discussion

في هذه الدراسة ، أظهرنا وقدمنا نهجا خطوة بخطوة لإجراء توصيل خلايا WJ واستخدمنا تكملة من التحقيقات الكمية لتقييم تأثير تسليم WJ على الخصائص الخلوية: الجدوى الخلوية والميزات الميكانيكية الحيوية (أي EM). بعد حقن WJ ، كانت 85.9٪ من الخلايا التي تم حصادها قابلة للحياة. من حيث حقن WN ، احتفظت 97.2٪ من الخل...

Disclosures

أصحاب البلاغ J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. ليس لديهم ما يكشفون عنه. المؤلفان W.L. و M.D.E. موظفان في ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen ، منتج ERBEJet2 والنموذج الأولي WJ المستخدم في هذه الدراسة.

Acknowledgements

نشكر المؤلفين المشاركين من المنشورات الأصلية على مساعدتهم ودعمهم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL centrifuge tubeGreiner BioOne227261
1 mL BD Luer-LokTM SyringeBD Plastik Incn.a.
100 µm cell sieveGreiner BioOne542000
15 mL centrifuge tubeGreiner BioOne188271
75 cm2 tissue culture flaskCorning Incorporated353136
AFM head(CellHesion 200) JPKJPK00518
AFM processing softwareBrukerJPK00518
AFM softwareBrukerJPK00518
AFM system Cell Hesion 200BrukerJPK00518
All-In-One-Al cantileverBudget SensorsAIO-10tip A, Conatct Mode, Shape: Beam
Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m)
Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz)
Length: 500 µm (490 - 510 µm)
Width: 30 µm (35 - 45 µm)
Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
Amphotericin B solutionSigmaA2942250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, GermanyJPK00518
BD Microlance 3 18GBD304622
bovine serum albuminGibcoA10008-01
Cantilever All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, BulgariaAIO-TL-10tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometerNanoEnTek631-1098
centrifuge: Rotina 420RHettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powderGibco17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucoseSigmaD5546
Feather disposable scalpel (No. 10)Feather02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)SigmaF7524
HEPES sodium salt solution (1 M)SigmaH3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
laboratory bagsBrand759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamineMerckF1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)F1315
L-glutamineLonzaBE 17-605C1200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity KitInvitrogen by Thermo Fisher ScientificL3224Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6Zeiss
Microscope: AxioVertA.1Zeiss
Nelaton-Catheter femaleBicakcilar19512051
Penicillin-StreptomycinGibco15140-12210000 U/ml Penicillin
10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFMBrukerT-05-0117
Petri dish heater associated with AFMJPK Instruments AG, Berlin, GermanyT-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22IBM
Sterile Petri dish - CellStarGreiner BioOne664160
Tissue culture dishesTPP AGTPP93040
Tissue culture dishesTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Trypan Blue 0.4%
0.85% NaCl		Lonza17-942E
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
Waterjet: ERBEJET2 deviceErbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection NeedleCook MedicalG1422023G, 5.0 Fr, 35 cm

References

  1. Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
  2. Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
  3. Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
  4. Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
  5. Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
  6. Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
  7. Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, 110-113 (2006).
  8. Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
  9. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
  10. Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
  11. Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
  12. Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
  13. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  14. Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
  15. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  16. Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
  17. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  18. Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
  19. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
  20. Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
  21. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
  22. Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
  23. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  24. Ding, Y., Xu, G. -. K., Wang, G. -. F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
  25. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  26. Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
  27. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
  28. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  29. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  30. Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
  31. Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
  32. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
  33. Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
  34. Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
  35. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  36. Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
  37. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  38. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
  39. Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
  40. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
  41. Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
  42. Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved