워터젯 기술을 통한 돼지 지방 조직 유래 스트로마 세포 주입

요약

우리는 세포 생존력, 증식 및 탄력성 측정 측면에서 배달 후 조사의 후유증과 결합 된 바늘이없는 워터젯 기술을 통한 세포 주입 방법을 제시합니다.

초록

요실금 (UI)은 요도 괄약근 근육의 결핍을 특징으로하는 매우 보편적 인 상태입니다. 재생 의학 분야, 특히 세포 요법은 요도 괄약근 기능을 향상시키고 회복시키는 새로운 접근법입니다. 활성 기능성 세포의 주사가 바늘 및 주사기에 의해 임상 환경에서 일상적으로 수행되지만, 이러한 접근법은 상당한 단점과 한계를 가지고 있습니다. 이러한 맥락에서, 무바늘 워터젯 (WJ) 기술은 요도 괄약근에 시각적 인 안내 방광 내시경 검사로 생존 가능한 세포를 주입 할 수있는 실현 가능하고 혁신적인 방법입니다. 본 연구에서, 우리는 WJ를 사용하여 돼지 지방 조직 유래 기질 세포 (pADSCs)를 사체 요도 조직으로 전달하고 WJ 전달이 세포 수율 및 생존력에 미치는 영향을 조사했습니다. 우리는 또한 원자력 현미경 (AFM) 측정에 의해 생체 역학적 특징 (즉, 탄력성)을 평가했습니다. 우리는 WJ가 전달한 pADSC가 세포 탄력성에서 현저하게 감소한다는 것을 보여주었다. 생존력은 대조군에 비해 현저히 낮았지만 여전히 80% 이상이다.

서문

요실금 (UI)은 유럽 인구 1에서 1.8 - 30.5 %의 유병률을 가진 광범위한 장애이며 주로 요도 괄약근의 오작동이 특징입니다. 임상 적 관점에서 볼 때, 외과 적 치료는 종종 보존 적 치료법이나 물리 치료가 새로운 증상을 해결하고 완화시키지 못할 때 환자에게 제공됩니다.

괄약근 복합체 오작동의 잠재적인 재생 복구를 위한 세포 요법은 UI 병리학 ^2,3의 치료를 위한 아방가르드 접근법으로서 부각되고 있다. 주요 목표는 손상된 조직의 생물학적 기능을 대체, 복구 및 복원하는 것입니다. UI에 대한 동물 모델에서, 줄기 세포 이식은 비뇨 기역학적 결과 2,4,5에서 유망한 결과를 보여주었다. 줄기 세포는 자기 재생 및 분화 능력을 가질 수있는 능력을 가지고 있기 때문에 최적의 세포 후보로 발생하므로 영향을받는 조직 재생을 돕습니다⁶. 다가오는 재생 잠재력에도 불구하고, 세포의 최소 침습적 전달이 여전히 주사 정밀도 및 표적의 커버리지에 관한 몇 가지 도전에 직면함에 따라 세포 요법의 실질적인 사용은 여전히 방해 받고 있습니다. 세포 전달에 사용되는 현재의 접근법이 바늘 주사기 시스템⁽⁷)을 통한 주사임에도 불구하고, 일반적으로 생존 가능한 세포의 전반적인 결핍을 초래하며, 이식 후 1%-31%만큼 낮은 생존율을 보고하였다⁸. 또한, 바늘 주입을 통한 세포 전달은 또한 표적 조직 내로의 이식된 세포의 배치, 보유 속도 뿐만 아니라 분포에 영향을 미치는 것으로 나타났다⁽9,10,11). 상기 언급된 한계를 극복하는 실현 가능하고 새로운 접근법은 워터젯 기술을 통한 무바늘 세포 전달이다.

워터젯 (WJ) 기술은 요도 괄약근^12,13에서 시각적 제어하에 방광경에 의한 세포의 높은 처리량 전달을 가능하게하는 새로운 접근법으로 부상하고 있습니다. WJ는 E5에서 E80¹³ 범위의 다양한 압력 (E = 효과 바)에서 셀 전달을 가능하게합니다. 첫 번째 단계에서, (조직 침투 단계) 등장성 용액은 표적화된 조직을 둘러싸고 있는 세포외 매트릭스를 느슨하게 하기 위해 고압 (즉, E60 또는 E80)으로 적용되고 작은 상호연결 마이크로락쿠내를 개방한다. 두 번째 단계 (주입 단계)에서, 압력은 세포를 표적화 된 조직 내로 부드럽게 전달하기 위해 밀리 초 이내에 (즉, E10까지) 낮아진다. 이 두 단계-상 적용에 이어서, 세포는 분출될 때 조직에 대해 추가적인 압력을 받지 않지만, 액체-충전된 동굴 영역⁽¹³) 내로 저압 스트림으로 부유된다. 줄기 세포가 WJ를 통해 사체 요도 조직으로 주입되는 생체외 모델 설정에서, 생존 가능한 세포는 나중에 흡인 및 조직으로부터 회수되고 시험관내¹³에서 더욱 확장될 수 있었다. Weber et al.의 2020 년 연구에서 발자국이없는 심근 세포를 심근¹⁴에 전달하는 WJ의 실현 가능성과 적용 가능성을 입증했지만 WJ 기술은 여전히 프로토 타입 단계에 있음을 명심해야합니다.

다음 프로토콜은 돼지 지방조직 유래 기질 세포(pADSC)를 준비하고 라벨링하는 방법과 WJ 기술 및 윌리엄스 방광내시경 바늘(WN)을 통해 포획액 및 사체 조직으로 전달하는 방법을 설명합니다. 세포 주사 후, 원자력 현미경 (AFM)을 통해 세포 활력과 탄력성이 평가됩니다. 단계별 지침을 통해 프로토콜은 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해 명확하고 간결한 접근 방식을 제공합니다. 토론 섹션에서는 기술의 주요 장점, 한계 및 향후 관점을 제시하고 설명합니다. 여기에 보고된 후유증 후 분석뿐만 아니라 세포의 WJ 전달은 표준 바늘 주입을 대체하고 표적 조직의 재생 치유를 위한 고체 세포 전달 프레임워크를 제공한다. 우리의 최근 연구에서 우리는 WJ가 바늘 주사^15,16과 비교할 때 세포를보다 정확하고 적어도 비슷한 생존력으로 전달했다는 증거를 제공했습니다.

프로토콜

돼지 지방 조직 샘플은 Tuebingen 대학의 실험 수술 연구소에서 입수했습니다. 모든 절차는 동물 실험 번호 CU1/16에 따라 지역 동물 복지 당국에 의해 승인되었다.

1. 돼지 지방조직 유래 기질세포의 분리

1. 실험 수술 연구소에서 전달된 돼지 지방 조직을 50mL 원심분리 튜브에서 실험실로 사용하십시오.
2. 조직을 멸균 벤치 아래의 멸균 된 페트리 접시에 옮기고 작은 조각과 버섯에 두 개의 메스 (10 번)로 다듬습니다.
   참고 : 작은 조각을 얻기 위해 가위를 사용할 수도 있습니다. 파편이 작을수록 다음 소화에 더 좋습니다.
   1. 작은 조각/버섯을 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고 5 mL의 호모게나이저 용액과 함께 진탕기에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 호모게나이저 용액은 1% 소 혈청 알부민 (BSA) (원액: PBS 중 1% (w/v) BSA) 및 0.1% 콜라게나제 유형 I을 갖는 PBS이다.
      참고 : 항상 균질 기 용액을 신선하게 준비하십시오. 쉐이커는 느린 속도 25-500 rpm에서 원형 흔들림 동작을 갖습니다.
3. 배양을 중단하려면 성장 배지 10mL를 첨가한다[둘베코 변형 이글스 배지 - 저포도당(DMEM-LG), 2.5% HEPES 나트륨 염 용액(1 M), 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민(200 mM), 1% 페니실린-스트렙토마이신(10000 U/mL 페니실린; 10,000 μg/mL 스트렙토마이신) 및 1% 암포테리신 B(250 μg/mL)].
   참고: 성장 미디어는 미리 준비할 수 있습니다. 항생제와 항진균제는 오염으로부터 세포를 보호하기 위해 세포 배양을위한 성장 배지의 준비에 필요합니다.
4. 원심분리 튜브를 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
5. 더 가벼운 지방세포로 분획을 흡인하여 10 mL 피펫으로 액체 위에서 수영하고 버리십시오.
6. 중금속이 없는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 막으로 100 μm 세포 체를 통해 남은 기질 분획을 여과하여 지방 조직 단편을 보류하고 세포 현탁액만을 회수한다.
7. 여과된 세포 현탁액을 실온에서 630 x g에서 7분 동안 원심분리한다.
8. 세포 펠릿을 PBS 2 mL에 재현탁시켜 세포를 한 번 세척한다.
9. 세포 현탁액을 실온에서 630 x g에서 7분 동안 다시 원심분리한다.
10. 원심분리 후, 세포 펠릿을 플라스크 당 성장 배지 10 mL에 반복 재현탁시키고, 종자 세포를 75^cm2 세포 배양 플라스크에 재현탁시켰다.
    참고: PBS로 세척 단계 후의 세포 펠릿의 크기에 따라, 종자 세포를 하나 내지 네 개의 플라스크에 넣는다.

2. 돼지 지방조직 유래 기질세포의 세포배양

1. 70 % 합류에 도달하면 세포를 수확하고 통과시킵니다.
2. 세포를 PBS 10 mL로 두 번 세척하고 PBS를 완전히 흡인한다.
   참고: 이 단계는 10% FBS로 보완되는 나머지 성장 배지를 제거하는 데 필요합니다. FBS에는 다음의 트립신화의 기능을 방해할 수 있는 몇몇 프로테아제 억제제가 있다.
3. 플라스크 당 0.05%-트립신-EDTA 3 mL를 첨가하여 세포를 분리한다.
4. 플라스크를 37°C에서 3분 동안 인큐베이션한다.
5. 세포가 분리되어 있는지 현미경으로 확인하십시오.
   참고 : 때로는 세포를 분리하는 데 더 많은 시간이 걸립니다. 이 경우, 플라스크를 37°C에서 최대 5분 동안 인큐베이션한다.
6. 인큐베이션 및 분리 과정을 중단하려면 성장 배지 3mL를 첨가하십시오.
   참고: 위에서 언급한 바와 같이, 성장 배지는 프로테아제 억제제를 함유하는 10% FBS에 의해 보완된다.
7. 분리된 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 630 x g에서 7분 동안 원심분리한다.
8. 세포를 성장 배지 10mL에 재현탁하고 혈구분석기로 계수합니다.
9. 종자 세포는^{75 cm2} 플라스크 당 3 x 10 5 세포의 접종 밀도를 갖는다.

3. 칼세인-AM을 사용한 세포의 라벨링

참고 : 사체 조직에 주입 된 세포는 녹색 형광막 투과성 살아있는 세포 염색 및 적색 형광막 불투과성 생존 지표로 염색되어 추출 된 세포가 요도의 조직 단편이 아닌 주입 된 세포와 동일한지 확인합니다.

1. 세포를 PBS 10mL로 두 번 세척한다.
2. 75 cm² 플라스크 당 5 mL의 염료 용액을 첨가한다. 염료 용액은 2 μM의 녹색 형광 막 투과성 살아있는 세포 염료와 4 μM 적색 형광 막 불투과성 생존력 지시자를 가진 성장 배지로 구성된다.
3. 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
4. 흡인하고 염료 용액을 버린다.
5. 세포를 PBS 10mL로 다시 두 번 세척한다.
6. 성장 배지를 추가하고 형광 현미경으로 녹색 및 적색 형광 신호를 문서화합니다.
   1. 현미경 테이블 위에^75cm2 플라스크를 놓고 10x 목표를 사용하고 형광 필터를 선택하지 않고 투과 된 광 경로가 활성화되어 있는지 확인하십시오.
      참고: 이 단계는 모두 현미경에서 수동으로 수행됩니다.
   2. 3.6.1단계와 병행하여 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
   3. 찾기 탭 아래의 라이브 버튼을 눌러 테이블의 플라스크에 있는 셀의 라이브 이미지를 얻고 거칠고 미세한 조정 드라이브로 셀에 초점을 맞춥니다.
      참고: 오른쪽 시야에서 라이브 버튼이 활성화되면 라이브 이미지가 나타납니다.
   4. 하위 탭 현미경 구성 요소에서 올바른 목표(10x)를 선택합니다.
   5. 하위 탭 카메라에서 자동 노출에 대한 확인 표시를 적용합니다.
   6. Snap 버튼을 눌러 전송된 빛으로 첫 번째 사진을 찍습니다.
   7. 메뉴 모음의 그래픽 탭을 사용하고 배율 막대를 선택하여 배율 표시줄을 삽입합니다.
   8. 메뉴 막대의 파일 탭을 사용하고 czi로 저장을 선택하여 이미지를 저장합니다.
   9. 형광 사진의 경우 필터를 녹색 또는 적색 형광에 특이적인 것으로 변경하고 반사광 경로를 선택합니다.
      참고 : 이러한 변경은 현미경에서 수동으로 수행해야합니다.
   10. 찾기 탭 아래의 라이브 버튼을 다시 눌러 셀의 라이브 이미지를 가져옵니다.
   11. 스냅(Snap) 버튼을 눌러 녹색 또는 빨간색 형광으로 두 번째 사진을 찍습니다.
   12. 메뉴 모음의 그래픽 탭을 사용하고 배율 막대를 선택하여 배율 표시줄을 삽입합니다.
   13. 메뉴 막대의 파일 탭을 사용하고 czi로 저장을 선택하여 이미지를 저장합니다.
   14. 다른 형광 채널과 함께 3.6.9 ~ 3.6.13단계를 반복합니다.

4. 주사를 위해 요도 조직 샘플 준비

1. 요도와 연결 방광을 돼지에서 해부하십시오.
   참고: 성인 암컷 육상 돼지의 신선한 사체 샘플로부터의 요도 조직 샘플을 실험에 사용하였다.
2. 젖은 얼음 위에 가방으로 실험실로 운반하십시오.
   참고: 샘플은 추가 처리 때까지 얼음 위에 두어야 합니다. 샘플에 첨가제가 첨가되지 않았습니다.
3. 방광이있는 요도를 하부 골반 바닥의 탄력성을 모방 한 스폰지에 놓습니다.
   1. 방광을 사용하여 요도의 방향 (근위, 원위, 등쪽 및 복부)을 결정하십시오. 이것은 복부와 골반강에서 방광을 고정시키는 요관과 세 인대의 국소화로 인해 가능합니다. 세 인대는 방광의 측면에있는 두 개의 소포 측방 인대와 방광의 복부 표면에서 발생하는 소포 중추입니다 (그림 1).
4. 카테터의 도움으로 요도를 등쪽 쪽에서 세로로 열어 자릅니다.
5. 다음 장에 설명 된대로 열린 요도에 세포를 주입하십시오.

5. 체액 및 조직 샘플에 윌리엄스 바늘을 통한 세포 주사

1. 단계 2에 기재된 바와 같이 세포를 수확한다.
2. 단계 2.9와는 달리, 주사를 위한 세포 밀도를 mL당 2.4 x 10⁶ 세포로 조정한다.
   참고: 조직 샘플에 주사하는 경우 세포를 녹색 형광 막 투과성 살아있는 세포로 라벨링합니다.
3. 세포 현탁액을 주사기로 흡인하고 윌리엄스 방광내시경 주사 바늘 (WN)을 바르십시오.
4. 바늘을 15mL 원심분리 튜브에서 2mL의 성장 배지 바로 위에 고정하거나 바늘을 열린 요도 조직에 삽입하십시오. 두 경우 모두 250μL의 세포를 수동으로 주입합니다.
   참고 : 사체 요도에 주입 된 세포는 주사 돔을 형성합니다.
5. 실온에서 630 x g에서 7분 동안 원심분리하여 배지에 직접 주입된 세포를 수집한다.
6. 사체 요도에 주입 된 세포의 경우, 주사기에 18G 바늘을 적용하여 주사 돔에서 흡인하십시오.
7. 주입되고 흡인된 세포를 원심분리 튜브 내로 옮기고, 배지에 주입된 세포와 비교가능하게 실온에서 630 x g에서 7분 동안 원심분리한다.
8. 원심분리 후, 세포를 두 경우 모두 4 mL의 성장 배지에 재현탁시킨다.
9. 혈구계를 사용한 Trypan blue 염료 배제의 도움으로 세포 수율 및 생존력을 결정하십시오.
   1. 20 μL의 세포 현탁액을 20 μL의 트리판 블루와 완전히 혼합한다.
   2. 이 혼합물 10 μL를 혈구분석기의 각 챔버에 채운다.
      참고: 두 챔버 모두 두 배로 샘플링하여 통계적 최적화를 얻기 위해 채워지고 계산됩니다.
   3. 현미경으로 네 모서리 사각형 모두에서 세포를 계산하십시오.
      참고 : 흰색으로 빛나는 세포 (염색되지 않은)를 생존 가능한 세포로 계산하고 파란색으로 빛나는 세포 (염색 된)는 죽은 세포로 계산합니다.
   4. mL당 셀 수를 계산하려면 두 챔버의 평균을 계산하고이 숫자를 두 개로 나누고 10⁴를 곱하십시오.

6. 유체 및 조직 샘플에서 워터젯을 통한 세포 주입

1. 단계 2에 기재된 바와 같이 세포를 수확한다.
2. 단계 2.9 및 5.2와는 달리, 주사를 위한 세포 밀도를 mL당 6 x 10⁶ 세포로 조정한다.
   참고: 조직 샘플에 주사하는 경우 녹색 형광막 투과성 살아있는 세포로 표지된 세포를 사용하십시오.
3. 세포 현탁액을 WJ 장치의 투약 유닛에 채운다.
4. 분사 노즐을 15 mL 원심분리 튜브에서 성장 배지 2 mL 바로 위 또는 열린 요도 조직 바로 위에 고정하십시오.
5. 두 경우 모두 조직 침투를 위해 고압을 사용하는 장치에 의해 100 μL의 세포를 주입한 다음 세포 주입을 위한 저압 단계를 거친다. 압력 설정 E60-10을 사용합니다.
   참고 : 사체 요도에 주입 된 세포는 주사 돔을 형성합니다.
6. 실온에서 630 x g에서 7분 동안 원심분리하여 배지에 직접 주입된 세포를 수집한다.
7. 사체 요도에 주입 된 세포의 경우, 주사기에 18G 바늘을 적용하여 주사 돔에서 흡인하십시오.
8. 주입되고 흡인된 세포를 원심분리 튜브 내로 옮기고, 배지에 주입된 세포와 비교가능하게 실온에서 630 x g에서 7분 동안 원심분리한다.
9. 원심분리 후, 두 경우 모두 4 mL의 성장 배지에 세포를 재현탁시킨다.
10. 5.10에 상세히 기재된 바와 같이 혈구측정기를 사용한 트리판 블루 염료 배제의 도움으로 세포 수율 및 생존율을 결정한다.

7. 원자력 현미경(AFM)에 의한 세포 탄력성의 생체역학적 평가

1. 시료의 제조
   참고: 주사 후 검색된 세포는 이제 AFM에 의한 추가 분석 대상이 됩니다. 추가적으로, 주입되지 않은 세포는 대조군으로 사용된다.
   1. 접시 당 5 x 10^{5 세포의 밀도} 를 가진 조직 배양 접시에있는 종자 세포.
      참고 : 조건 당 하나의 조직 배양 접시를 시드하십시오. 상기 조건은 대조군, WJ 또는 WN에 의해 배지로 주사된 ADSCs 및 WJ 또는 WN에 의해 사체 조직으로 주입된 ADSC이다.
   2. 세포를 조직 배양 접시에서 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
      참고: G1 단계 및 유사분열 동안 세포로 인한 차이를 피하기 위해 세포 시딩 단계 후 3시간 후에 AFM 측정을 수행했습니다.
   3. AFM으로 측정하기 직전에 성장 배지를 L-글루타민이 없는 Leibovitz의 L-15 배지 3mL로 교체합니다.
   4. 조직 배양 접시를 AFM 장치의 샘플 홀더에 놓고 37°C에서 설정된 페트리 접시 히터를 켭니다.
2. AFM 및 캔틸레버 교정의 준비
   1. 액체의 측정에 지정된 유리 블록을 사용하고 AFM 홀더에서 조정하십시오.
      참고: 유리 블록의 윗면은 AFM 홀더와 평행하고 직선이어야 합니다.
   2. 조심스럽게 캔틸레버를 유리 블록 표면에 놓습니다. 팁 A는 연마 된 광학 평면 위에 놓여야합니다.
      참고: 긁힘으로 인해 측정에 간섭이 발생할 수 있으므로 유리 블록의 연마된 광학 표면을 긁지 마십시오. 팁 A는 연마된 광학 평면 위에 돌출되어야 하는데, 그렇지 않으면 AFM의 레이저를 광검출기에 반사시킬 수 없기 때문입니다.
   3. 유리 블록의 캔틸레버를 안정화하려면 핀셋의 도움으로 금속 스프링을 추가하십시오.
   4. 캔틸레버가 유리 블록에 고정되면 AFM 헤드에 블록을 놓고 통합 잠금 메커니즘을 잠급니다.
   5. AFM 헤드를 AFM 장치에 장착합니다.
      참고: 스프링이 올바르게 배치되려면 왼쪽을 향해야 합니다. 그렇지 않은 경우 유리 블록의 위치를 수정하고 AFM 헤드를 다시 조정하십시오.
   6. 소프트웨어 설정을 초기화하고 레이저 정렬 창 및 접근 파라미터 설정과 함께 소프트웨어를 엽니다. 또한 스테퍼 모터, 레이저 조명 및 CCD 카메라를 켭니다.
   7. CCD 카메라를 사용하여 캔틸레버 팁 A를 식별합니다.
   8. 캔틸레버가 매체에 완전히 담길 때까지 캔틸레버를 내립니다. 스테퍼 모터 기능을 사용하여이 목표에 도달하십시오.
   9. 캔틸레버가 매체로 완전히 덮이면 레이저는 조정 나사를 사용하여 캔틸레버 위에 정렬됩니다. 반사된 빔은 광검출기의 중앙에 떨어지고 신호의 합은 1V 이상이어야 합니다. 측면 및 수직 편향은 0에 가까워야 합니다.
      참고: 중심에 도달하면 레이저 정렬 기능과 신호 값을 모니터링할 수 있습니다. 신호 값이 올바르지 않으면 추가 조정이 필요합니다.
   10. 이제 스캐너 접근 방식을 접근 매개 변수로 실행하십시오(표 1).
   11. 캔틸레버가 바닥에 도달하면 리트랙트 버튼을 눌러 캔틸레버를 100μm 후퇴 시킵니다.
       참고: 교정을 위조할 수 있기 때문에 접근 방식이 수행된 경우 해당 필드에 셀이 연결되어 있지 않은지 확인하십시오.
   12. 설정점 1V, 당기기 길이 90μm, 속도: 5μm/s, 샘플 속도: 2000Hz 및 지연 모드: 일정한 힘에 따라 실행 파라미터를 설정합니다.
   13. 실행 버튼을 눌러 보정 힘-거리 곡선 측정을 시작합니다.
       참고: 소프트웨어에서 실행 단추를 클릭하면 힘-거리 곡선이 얻어집니다.
   14. 얻은 보정력-거리 곡선의 소프트웨어에서 수축된 곡선의 선형 적합 영역을 선택합니다. 소프트웨어로 스프링 상수 측정을 계산합니다.
   15. Danalache et ^al.17에 의해 기술된 바와 같이 정확한 파라미터 및 단계에 따라 캔틸레버를 교정한다.
3. 개별 세포의 탄력성 측정
   1. 시각적으로 세포를 식별하고 그것에 집중하십시오. 컴퓨터 마우스를 셀 가운데에 놓습니다. 측정 정밀도를 향상시키려면 AFM 팁을 세포 핵 바로 위에 놓습니다.
      참고: 컴퓨터 마우스는 들여쓰기의 대상 사이트를 식별하는 시각적 마커로 사용됩니다.
   2. 이제 캔틸레버에 초점을 맞추고 컴퓨터 마우스로 이동하십시오.
   3. 표 2에 제공된 파라미터로 Run으로 측정을 시작합니다.
      참고: 캔틸레버의 교정으로 얻은 설정점 매개변수가 사용됩니다. 또한, 하나의 세포가 세 번 측정됩니다. 적어도 50 개의 세포를 측정하십시오.
4. 데이터 처리
   1. Danalache¹⁷에 의해 이전에 설명된 바와 같이 정확한 단계와 파라미터에 따라 데이터를 처리한다.
   2. 파일을 저장하고 내보냅니다.

8. 통계 분석

1. 통계 소프트웨어를 엽니다.
2. 새 데이터 집합의 선택을 선택합니다.
   참고: 두 개의 파일이 열립니다. 하나는 "DataSet"이고 다른 하나는 "출력"파일입니다.
3. 데이터 집합 파일을 선택하고 변수 보기 탭을 엽니다.
4. 부위 주입 (포획 유체 또는 사체 조직), 범주 (제어, WJ 주입, WN 주입) 및 탄력성에 대한 숫자 변수를 삽입하십시오.
5. 측정된 탄력성 데이터를 해당 부위 주입 및 범주 번호와 함께 데이터 보기 탭에 삽입합니다.
6. 메뉴 모음 탭을 선택하여 데이터 분석 | 설명 통계 를 선택하고 탐색 데이터 분석을 선택합니다.
7. 종속 변수로 탄력성 을 선택하고 요인 목록에서 범주를 선택합니다.
   참고: 결과는 결과 섹션에 사용되는 상자 플롯을 포함하여 "출력" 파일에 표시됩니다.
8. 통계 테스트를 수행하려면 메뉴 막대 탭 분석에서 비모수 테스트 내에서 독립 샘플을 선택합니다.
9. 새로 열린 파일에서 목표 및 설정 탭의 설정을 유지합니다.
10. 필드 탭을 열고 탄력성을 테스트 필드로 선택하고 그룹으로 범주를 선택합니다.
11. 실행을 누릅니다.
    참고: 결과는 "출력" 파일에 표시됩니다. 이러한 분석을 위해 Mann-U-Whitney 테스트가 수행됩니다.
12. 비모수 검정의 결과를 탐색 데이터 분석의 상자 플롯에 포함합니다.
13. 메뉴 모음에서 파일을 선택하고 저장을 선택하여 파일을 저장합니다.

결과

두 가지 접근법을 통한 세포 전달 후, WN을 통해 전달된 세포의 생존율(97.2± 2%, n=10, p<0.002)은 E60-10 설정(85.9 ± 0.16%, n=12)을 사용하는 WJ에 의한 주사제와 비교했을 때 더 높았다(그림 2). 생체역학적 평가 결과는 다음과 같다는 것을 보여주었다: 포획 유체에서 세포의 WN 주사는 대조군과 비교했을 때 탄성 모듈리 (EM; 0.992 kPa)에 대하여 유의한 차이를 나타내지 않았다 (1.176 kPa; 도 ...

토론

본 연구에서, 우리는 WJ 세포 전달 절차에 대한 단계별 접근법을 입증하고 제시했으며, 세포 특성에 대한 WJ 전달의 효과를 평가하기 위해 정량적 조사의 후유증을 채택했다 : 세포 생존력 및 생체 역학적 특징 (즉, EM). WJ 주사 후, 수확된 세포의 85.9%가 생존 가능하였다. WN 주사의 관점에서, 세포의 97.2 %는 주사 후 생존력을 유지했다. 따라서, WJ 접근법은 임상 구현을 위한 절대적 요건을 충족시킨다:...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	227261
1 mL BD Luer-LokTM Syringe	BD Plastik Inc	n.a.
100 µm cell sieve	Greiner BioOne	542000
15 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	188271
75 cm2 tissue culture flask	Corning Incorporated	353136
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
AFM processing software	Bruker	JPK00518
AFM software	Bruker	JPK00518
AFM system Cell Hesion 200	Bruker	JPK00518
All-In-One-Al cantilever	Budget Sensors	AIO-10	tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
Amphotericin B solution	Sigma	A2942	250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
BD Microlance 3 18G	BD	304622
bovine serum albumin	Gibco	A10008-01
Cantilever	All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10	tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometer	NanoEnTek	631-1098
centrifuge: Rotina 420R	Hettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose	Sigma	D5546
Feather disposable scalpel (No. 10)	Feather	02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F7524
HEPES sodium salt solution (1 M)	Sigma	H3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
laboratory bags	Brand	759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine	Merck	F1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
L-glutamine	Lonza	BE 17-605C1	200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	L3224	Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6	Zeiss
Microscope: AxioVertA.1	Zeiss
Nelaton-Catheter female	Bicakcilar	19512051
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFM	Bruker	T-05-0117
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22	IBM
Sterile Petri dish - CellStar	Greiner BioOne	664160
Tissue culture dishes	TPP AG	TPP93040
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl	Lonza	17-942E
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
Waterjet: ERBEJET2 device	Erbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection Needle	Cook Medical	G14220	23G, 5.0 Fr, 35 cm