通过水射流技术注射猪脂肪组织衍生的基质细胞

摘要

我们提出了一种通过无针水射流技术进行细胞注射的方法，以及细胞活力，增殖和弹性测量方面的交付后研究的后遗症。

摘要

尿失禁（UI）是一种非常普遍的疾病，其特征在于尿道括约肌缺乏。再生医学分支，特别是细胞疗法，是改善和恢复尿道括约肌功能的新方法。尽管在临床环境中常规通过针头和注射器注射活性功能细胞，但这些方法具有显着的缺点和局限性。在这种情况下，无针水刀（WJ）技术是一种可行且创新的方法，可以通过视觉引导膀胱镜在尿道括约肌中注射活细胞。在本研究中，我们使用WJ将猪脂肪组织来源的基质细胞（pADSC）递送到尸体尿道组织中，并随后研究了WJ递送对细胞产量和活力的影响。我们还通过原子力显微镜（AFM）测量评估了生物力学特征（即弹性）。我们发现，WJ递送的pADSC的细胞弹性显着降低。与对照组相比，存活率明显较低，但仍高于80%。

引言

尿失禁 （UI） 是一种广泛存在的疾病，在欧洲人群中患病率为 1.8 - 30.5%，主要表现为尿道括约肌功能障碍。从临床角度来看，当保守疗法或物理治疗无法解决和缓解新出现的症状时，通常会向患者提供手术治疗。

用于括约肌复合物故障的潜在再生修复的细胞疗法已成为治疗UI病理学的前卫方法^2，3。其主要目标是替换，修复和恢复受损组织的生物功能。在UI的动物模型中，干细胞移植在尿动力学结果中显示出有希望的结果^2，4，5。干细胞作为最佳细胞候选者出现，因为它们具有经历自我更新和多能分化的能力，从而有助于受影响的组织再生⁶。尽管即将到来的再生潜力，但细胞疗法的实际使用仍然受到阻碍，因为细胞的微创递送仍然面临有关注射精度和靶标覆盖率的几个挑战。尽管目前用于细胞递送的方法是通过针刺系统⁷注射，但它通常会导致活细胞的整体缺陷，据报道移植后的活力低至1%-31%⁸。此外，通过针头注射的细胞递送也被证明会影响放置，保留率，以及移植细胞向靶组织^9，10，11的分布。克服上述限制的一种可行的新颖方法是通过水射流技术进行无针细胞递送。

水射流（WJ）技术正在成为一种新方法，它能够在尿道括约肌^12，13的视觉控制下通过膀胱镜高通量递送细胞。WJ可在E5至E80¹³的不同压力（E = 以巴为单位的效应）下进行细胞递送。在第一阶段，（组织渗透阶段）用高压（即E60或E80）施加等渗溶液，以松动靶向组织周围的细胞外基质并打开小的互连微腔。在第二阶段（注射阶段），压力在几毫秒内降低（即，高达E10），以便将细胞轻轻地输送到靶组织中。在这种两步相施用之后，细胞在射出时不会受到针对组织的额外压力，而是以低压流漂浮到充满液体的海绵状区域¹³中。在通过WJ将干细胞注射到尸体尿道组织中的离体模型设置中，活细胞随后可以从组织中抽吸并取出并在体外进一步扩增¹³。尽管Weber等人2020年的一项研究证明了WJ将无足迹心肌细胞输送到^心肌14中的可行性和适用性，但必须记住，WJ技术仍处于原型阶段。

以下方案描述了如何制备和标记猪脂肪组织来源的基质细胞（pADSC），以及如何通过WJ技术和威廉姆斯膀胱镜检查针（WN）将它们递送到捕获液和尸体组织中。细胞注射后，通过原子力显微镜（AFM）评估细胞活力和弹性。通过分步说明，该协议提供了一种清晰简洁的方法来获取可靠的数据。讨论部分介绍并描述了该技术的主要优点，局限性和未来前景。WJ细胞递送以及这里报道的翻译后遗症分析正在取代标准的针头注射，并为靶组织的再生愈合提供固体细胞递送框架。在我们最近的研究中，我们提供的证据显示，与针头注射相比，WJ更精确地递送细胞，并且至少具有相当的活力^15，16。

研究方案

猪脂肪组织样本是从图宾根大学实验外科研究所获得的。所有程序均由当地动物福利机构批准，动物实验编号为CU1/16。

1. 猪脂肪组织源性基质细胞的分离

1. 使用从实验外科研究所在50 mL离心管中输送到实验室的猪脂肪组织。
2. 将组织转移到无菌工作台下的无菌培养皿中，并用两把手术刀（10号）将其切碎成小碎片和糊状物。
   注意:也可以使用剪刀来获得小碎片。碎片越小，对下面的消化越好。
   1. 将小片段/糊状物转移到50mL离心管中，并将其与5mL均质器溶液在振荡器上在37°C下孵育30分钟。均质器溶液是含有1%牛血清白蛋白（BSA）（储备溶液:PBS中1%（w / v）BSA）和0.1%I型胶原酶的PBS。
      注意:始终新鲜准备均质机溶液。振动台以25-500 rpm的低速进行圆周振动运动。
3. 为了停止孵育，加入10毫升生长培养基[Dulbecco的改良鹰中 - 低葡萄糖（DMEM-LG），2.5%HEPES钠盐溶液（1 M），10%胎牛血清（FBS），1%L-谷氨酰胺（200mM），1%青霉素 - 链霉素（10000 U / mL青霉素;10，000μg/ mL链霉素）和1%两性霉素B（250μg/ mL）]。
   注意:生长培养基可以事先准备好。抗生素和抗真菌药物在制备细胞培养生长培养基以保护细胞免受污染时是必要的。
4. 在室温下孵育离心管10分钟。
5. 用脂肪细胞吸出该部分，脂肪细胞较轻，因此在液体顶部游动，用10mL移液管将其丢弃。
6. 用不含重金属的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜通过100μm细胞筛过滤剩余的基质部分，以阻止脂肪组织片段并仅取回细胞悬浮液。
7. 在室温下以630×g离心过滤的细胞悬浮液7分钟。
8. 将细胞沉淀重悬于2mLPBS中以洗涤细胞一次。
9. 在室温下以630×g再次离心细胞悬浮液7分钟。
10. 离心后，将细胞沉淀在每个烧瓶中10mL生长培养基中反复重悬，在75cm² 细胞培养瓶中培养细胞。
    注意:根据PBS洗涤步骤后细胞沉淀的大小，将细胞在一到四个烧瓶中。

2. 猪脂肪组织源性基质细胞的细胞培养

1. 当细胞达到70%汇合时收获和传代细胞。
2. 用10毫升PBS洗涤细胞两次，并完全吸出PBS。
   注意:此步骤对于移除剩余的生长培养基是必要的，该培养基由10%FBS补充。FBS具有几种蛋白酶抑制剂，可以阻碍以下胰蛋白酶消化的功能。
3. 每个烧瓶加入3毫升0.05%胰蛋白酶EDTA以分离细胞。
4. 在37°C下孵育烧瓶3分钟。
5. 在显微镜下检查细胞是否脱落。
   注意:有时需要更多时间来分离单元格。在这种情况下，在37°C下孵育烧瓶最多5分钟。
6. 为了停止孵育和分离过程，加入3 mL生长培养基。
   注意:如上所述，生长培养基由含有蛋白酶抑制剂的10%FBS补充。
7. 将分离的细胞转移到离心管中，并在室温下以630×g离心7分钟。
8. 将细胞重悬于10mL生长培养基中，并用血细胞计数器计数。
9. 接种密度为每^{75cm 2} 烧瓶3×10 5个细胞的种子细胞。

3. 用钙黄绿素-AM标记细胞

注意:注射到尸体组织中的细胞用绿色荧光膜渗透性活细胞染色剂和红色荧光膜不透性活力指示剂染色，以验证提取的细胞与注射的细胞相同，而不是尿道的组织片段。

1. 用10毫升PBS洗涤细胞两次。
2. 每75cm² 烧瓶加入5mL染料溶液。染料溶液由生长培养基组成，其中2μM的绿色荧光膜渗透活细胞染料和4μM红色荧光膜不透性活力指示剂。
3. 在室温下在黑暗中孵育30分钟。
4. 吸出并丢弃染料溶液。
5. 用10毫升PBS再次洗涤细胞两次。
6. 加入生长培养基，通过荧光显微镜记录绿色和红色荧光信号。
   1. 将75 cm² 的烧瓶放在显微镜工作台上，使用10x物镜，选择无荧光滤光片并确保透射光路处于活动状态。
      注意:这些步骤都是在显微镜上手动执行的。
   2. 与步骤3.6.1并行，打开软件程序。
   3. 按"定位"选项卡下的"实时"按钮，获取桌子上烧瓶中细胞的实时图像，并使用粗微调驱动器聚焦于它们。
      注意:激活"实时"按钮后，将在右侧视线中显示 实时 图像。
   4. 在子选项卡" 显微镜组件"中，选择正确的物镜（10x）。
   5. 在子选项卡" 相机"中，应用 "自动曝光"的复选标记。
   6. 按" 捕捉 "按钮，使用透射光拍摄第一张照片。
   7. 通过使用菜单栏中的" 图形 "选项卡并选择"比例尺"来插入 比例尺。
   8. 通过使用菜单栏中的" 文件 "选项卡并选择" 另存为 czi"来保存图像。
   9. 对于荧光图片，将滤光片更改为绿色或红色荧光的特定滤光片，然后选择反射光路。
      注意:这些更改必须在显微镜上手动完成。
   10. 再次按"定位"选项卡下的"实时"按钮以获取单元格的实时图像。
   11. 按下" 捕捉 "按钮，以绿色或红色荧光拍摄第二张照片。
   12. 通过使用菜单栏中的" 图形 "选项卡并选择"比例尺"来插入 比例尺。
   13. 通过使用菜单栏中的"文件"选项卡并选择"另存为 czi"来保存图像。
   14. 对另一个荧光通道重复步骤3.6.9至3.6.13。

4. 准备用于注射的尿道组织样本

1. 从猪中解剖尿道和连接膀胱。
   注意:来自成年雌性地方品种猪的新鲜尸体样本的尿道组织样本用于实验。
2. 将其装在湿冰袋中运输到实验室。
   注意:样品应留在冰上，直到进一步处理。样品中未添加添加剂。
3. 将尿道和膀胱放在海绵上，这模仿了下盆底的弹性。
   1. 使用膀胱确定尿道的方向（近端、远端、背侧和腹侧）。这是可能的，因为输尿管和三条韧带的定位将膀胱固定在腹部和盆腔中。这三条韧带是膀胱两侧的两条侧水疱韧带和内侧水疱，它们起源于膀胱的腹侧表面（图1）。
4. 借助导管，在背侧纵向切开尿道。
5. 将细胞注射到打开的尿道中，如以下各章所述。

5. 通过威廉姆斯针在液体和组织样品中注射细胞

1. 如步骤2中所述收获细胞。
2. 与步骤2.9相比，将注射的细胞密度调整为每mL2.4×10⁶ 个细胞。
   注意:对于注射到组织样品中，用绿色荧光膜渗透性活细胞标记细胞。
3. 用注射器吸出细胞悬浮液，并将威廉姆斯膀胱镜注射针（WN）施加在其上。
4. 将针头保持在15 mL离心管中2 mL生长培养基上方，或将针头插入打开的尿道组织中。在这两种情况下，手动注入250μL细胞。
   注意:注射到尸体尿道中的细胞形成注射圆顶。
5. 收集在室温下以630×g离心7分钟直接注入培养基的细胞。
6. 对于注射到尸体尿道中的细胞，用注射器上施加的18G针头将它们从注射圆顶中抽出。
7. 将注射和抽出的细胞转移到离心管中，并在室温下以630×g离心7分钟，与注射到培养基中的细胞相比。
8. 离心后，在这两种情况下，将细胞重悬于4 mL生长培养基中。
9. 通过血细胞计数器帮助台盼蓝染料排除来确定细胞产量和活力。
   1. 将20μL细胞悬浮液与20μL台盼蓝彻底混合。
   2. 在血细胞计数器的每个腔室中填充10μL该混合物。
      注意:两个腔室都经过填充和计数，以通过加倍采样来获得统计优化。
   3. 在显微镜下，计算所有四个角方块中的细胞。
      注意:将白色（未染色）中闪亮的细胞计数为活细胞，而闪亮蓝色（染色）的细胞被计为死细胞。
   4. 要计算每mL的细胞数，请计算两个腔室的平均值，将此数字除以2并将其乘以10⁴。

6. 通过水刀在液体和组织样品中注射细胞

1. 如步骤2中所述收获细胞。
2. 与步骤2.9和5.2相比，将注射的细胞密度调整为每毫升6×10⁶ 个细胞。
   注意:对于注射到组织样品中，使用用绿色荧光膜渗透活细胞标记的细胞。
3. 将细胞悬浮液填充到WJ设备的加样单元中。
4. 将注射喷嘴保持在 15 mL 离心管中 2 mL 生长培养基的正上方，或紧靠打开的尿道组织上方。
5. 在这两种情况下，设备使用高压进行组织渗透，然后使用低压进行细胞注射100μL细胞，然后使用低压相进行细胞注射。使用压力设置 E60-10。
   注意:注射到尸体尿道中的细胞形成注射圆顶。
6. 收集在室温下以630×g离心7分钟直接注入培养基的细胞。
7. 对于注射到尸体尿道中的细胞，用注射器上施加的18G针头将它们从注射圆顶中抽出。
8. 将注射和抽出的细胞转移到离心管中，并在室温下以630×g离心7分钟，与注射到培养基中的细胞相比。
9. 离心后，在这两种情况下，将细胞重悬于4 mL生长培养基中。
10. 通过借助台盼蓝染料排除与血细胞计数器确定细胞产量和活力，如5.10中所述。

7. 通过原子力显微镜（AFM）对细胞弹性进行生物力学评估

1. 样品制备
   注意:注射后检索到的细胞现在接受AFM的进一步分析。此外，未注射的细胞用作对照。
   1. 组织培养皿中的种子细胞，密度为每培养皿5×10⁵ 个细胞。
      注意:每种条件下播种一个组织培养皿。条件是对照，由WJ或WN注射到培养基中的ADSC和由WJ或WN注射到尸体组织中的ADSC。
   2. 将细胞在组织培养皿中在37°C下孵育3小时。
      注意:为了避免由于G1期和有丝分裂期间细胞引起的差异，我们在细胞接种步骤后3小时进行了AFM测量。
   3. 在用AFM测量之前，用3 mL的Leibovitz的L-15培养基代替生长培养基，没有L-谷氨酰胺。
   4. 将组织培养皿置于AFM装置的样品架中，并打开设置为37°C的培养皿加热器。
2. AFM和悬臂校准的制备
   1. 使用指定用于液体测量的玻璃块，并在AFM支架上进行调整。
      注:玻璃块的上表面必须笔直且与AFM支架平行。
   2. 小心地将悬臂放在玻璃块的表面上。尖端A必须放在抛光的光学平面上。
      注意:不要划伤玻璃块的抛光光学表面，因为划痕可能导致测量中的干扰。尖端A必须突出在抛光的光学平面上，否则AFM的激光无法反射到光电探测器。
   3. 为了稳定玻璃块上的悬臂，请借助镊子添加金属弹簧。
   4. 当悬臂固定在玻璃块上时，将块放在AFM头上并锁定集成的锁定机构。
   5. 将 AFM 头安装在 AFM 设备上。
      注意:弹簧必须朝向左侧才能正确放置。如果不是这种情况，请更正玻璃块的位置并再次调整AFM头。
   6. 初始化软件设置并打开软件以及激光对准窗口和接近参数设置。此外，打开步进电机、激光灯和CCD相机。
   7. 使用CCD相机识别悬臂尖端A。
   8. 降低悬臂，直到它完全浸入介质中。使用步进电机功能来达到这个目的。
   9. 一旦悬臂被介质完全覆盖，激光器就会使用调节螺钉在悬臂顶部对齐。反射光束必须落在光电探测器的中心，信号的总和必须为1 V或更高。横向和垂直挠度应接近 0。
      注意:如果到达中心，可以在激光对准功能中监控信号值。如果信号值不正确，则需要进一步调整。
   10. 立即使用 接近 参数运行扫描仪方法（表1）。
   11. 悬臂到达底部后，按下"缩回"按钮，将悬臂 缩回 100 μm。
       注意:如果该方法完成，请确保该字段没有连接任何单元，因为这会伪造校准。
   12. 根据以下规格设置 运行 参数:设定点 1 V，拉取长度 90 μm，速度:5 μm/s，采样率:2000 Hz，作为延迟模式:恒定力。
   13. 通过按按钮 运行开始校准力 - 距离曲线测量。
       注:通过单击软件中的" 运行 "按钮，可获得力-距离曲线。
   14. 在软件中，在获得的校准力-距离曲线上选择退刀曲线的线性拟合区域。通过软件计算弹簧常数测量值。
   15. 按照Danalache等人描述的确切参数和步骤校准悬^臂。
3. 测量单个细胞的弹性
   1. 直观地识别细胞并专注于它。将计算机鼠标放在单元格的中间。为了提高测量精度，请将AFM尖端直接放置在细胞核上方。
      注:计算机鼠标用作视觉标记，以识别压痕的目标部位。
   2. 现在专注于悬臂，并在计算机鼠标上移动它。
   3. 使用表 2 中给出的参数从 Run 开始测量。
      注:使用通过悬臂校准获得的设定点参数。此外，一个细胞被测量三次。测量至少50个细胞。
4. 数据处理
   1. 按照Danalache¹⁷之前描述的确切步骤和参数处理数据。
   2. 保存并导出文件。

8. 统计分析

1. 打开统计软件。
2. 选择"新建数据集"。
   注意:打开了两个文件。一个是"数据集"，另一个是"输出"文件。
3. 选择 数据集 文件，然后打开 变量视图 选项卡。
4. 插入用于部位注射（捕获液体或尸体组织）、类别（对照、WJ 注射、WN 注射）和弹性的数字变量。
5. 在" 数据视图 "选项卡中插入测量的弹性数据及其相应的站点注入和类别编号。
6. 通过选择菜单栏选项卡分析数据 |描述性统计， 然后选择 探索性数据分析。
7. 作为因变量 ，选择弹性 ，因子列表选择 类别。
   注意:结果显示在"输出"文件中，包括用于结果部分的框图。
8. 要执行统计检验，请在菜单栏选项卡"分析"下的"非参数检验"中选择"独立样本"。
9. 在新打开的文件中，保留" 目标 "和" 设置"选项卡中的设置。
10. 打开选项卡 字段， 然后选择 弹性 作为测试字段和 类别 作为组。
11. 按 "运行"。
    注意:结果显示在"输出"文件中。对于这些分析，执行Mann-U-Whitney测试。
12. 将非参数检验的结果包括在探索性数据分析的箱形图中。
13. 通过在菜单栏中选择" 文件 "并选择" 保存"来保存文件。

结果

通过两种方法递送细胞后，与使用E60-10设置的WJ注射相比，通过WN递送的细胞的活力（97.2 ±±2%，n = 10，p<0.002）更高（图2）。生物力学评估结果表明:捕获液中细胞的WN注射与对照组（1.176 kPa）相比，弹性模量（EM;0.992 kPa）无显着差异; 图3A），而WJ注射触发了细胞EM的显着降低（0.440 kPa，p<0.001， 图3B）。注意到WJ注射后EM降低40-50%。?...

讨论

在本研究中，我们展示并提出了WJ细胞递送程序的分步方法，并采用定量研究的后遗症来评估WJ递送对细胞特征的影响:细胞活力和生物力学特征（即EM）。注射WJ后，85.9%的收获细胞是活的。在WN注射方面，97.2%的细胞在注射后保持其活力。因此，WJ方法满足了临床实施的绝对要求:超过80%的活细胞在递送后¹⁸。虽然使用WJ方法实现了标准化和可重复的方案，但针头注射的结果高度依赖...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	227261
1 mL BD Luer-LokTM Syringe	BD Plastik Inc	n.a.
100 µm cell sieve	Greiner BioOne	542000
15 mL centrifuge tube	Greiner BioOne	188271
75 cm2 tissue culture flask	Corning Incorporated	353136
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
AFM processing software	Bruker	JPK00518
AFM software	Bruker	JPK00518
AFM system Cell Hesion 200	Bruker	JPK00518
All-In-One-Al cantilever	Budget Sensors	AIO-10	tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
Amphotericin B solution	Sigma	A2942	250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
BD Microlance 3 18G	BD	304622
bovine serum albumin	Gibco	A10008-01
Cantilever	All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10	tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometer	NanoEnTek	631-1098
centrifuge: Rotina 420R	Hettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose	Sigma	D5546
Feather disposable scalpel (No. 10)	Feather	02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F7524
HEPES sodium salt solution (1 M)	Sigma	H3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
laboratory bags	Brand	759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine	Merck	F1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
L-glutamine	Lonza	BE 17-605C1	200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	L3224	Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6	Zeiss
Microscope: AxioVertA.1	Zeiss
Nelaton-Catheter female	Bicakcilar	19512051
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFM	Bruker	T-05-0117
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22	IBM
Sterile Petri dish - CellStar	Greiner BioOne	664160
Tissue culture dishes	TPP AG	TPP93040
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl	Lonza	17-942E
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
Waterjet: ERBEJET2 device	Erbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection Needle	Cook Medical	G14220	23G, 5.0 Fr, 35 cm