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Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Nous présentons une méthode d’injection cellulaire via la technologie de jet d’eau sans aiguille couplée à une séquelle d’investigations post-accouchement en termes de viabilité cellulaire, de prolifération et de mesures d’élasticité.
L’incontinence urinaire (IU) est une affection très répandue caractérisée par une déficience du muscle du sphincter urétral. Les branches de la médecine régénérative, en particulier la thérapie cellulaire, sont de nouvelles approches pour améliorer et restaurer la fonction du sphincter urétral. Même si l’injection de cellules fonctionnelles actives est systématiquement effectuée en milieu clinique à l’aiguille et à la seringue, ces approches présentent des inconvénients et des limites importants. Dans ce contexte, la technologie du jet d’eau sans aiguille (WJ) est une méthode réalisable et innovante qui permet d’injecter des cellules viables par cystoscopie guidée visuellement dans le sphincter urétral. Dans la présente étude, nous avons utilisé WJ pour administrer des cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin (pADSC) dans le tissu urétral cadavérique et avons ensuite étudié l’effet de l’administration de WJ sur le rendement cellulaire et la viabilité. Nous avons également évalué les caractéristiques biomécaniques (c.-à-d. l’élasticité) par des mesures de microscopie à force atomique (AFM). Nous avons montré que les pADSC délivrés par WJ étaient significativement réduits dans leur élasticité cellulaire. La viabilité était significativement plus faible par rapport aux témoins, mais elle est toujours supérieure à 80%.
L’incontinence urinaire (IU) est un trouble répandu avec une prévalence de 1,8 à 30,5% dans les populations européennes1 et se caractérise principalement par un dysfonctionnement du sphincter urétral. D’un point de vue clinique, un traitement chirurgical est souvent offert aux patients lorsque les thérapies conservatrices ou la physiothérapie ne parviennent pas à traiter et à soulager les symptômes émergents.
La thérapie cellulaire pour la réparation régénérative potentielle du dysfonctionnement du complexe du sphincter est devenue une approche d’avant-garde pour le traitement de la pathologie de l’UI 2,3. Ses principaux objectifs sont de remplacer, réparer et restaurer la fonctionnalité biologique du tissu endommagé. Dans les modèles animaux pour l’IU, la greffe de cellules souches a montré des résultats prometteurs dans les résultats urodynamiques 2,4,5. Les cellules souches apparaissent comme des candidates cellulaires optimales car elles ont la capacité de subir un auto-renouvellement et une différenciation multipotente, aidant ainsi la régénération des tissus affectés6. Malgré le potentiel régénératif à venir, l’utilisation pratique de la thérapie cellulaire reste entravée car l’administration mini-invasive de cellules est toujours confrontée à plusieurs défis concernant la précision de l’injection et la couverture de la cible. Même si l’approche actuelle utilisée pour l’administration des cellules est l’injection par un système aiguille-seringue7, il en résulte généralement un déficit global de cellules viables, avec des viabilités rapportées aussi faibles que 1% à 31% après la transplantation8. En outre, il a également été démontré que l’administration de cellules par injection d’aiguille affecte le placement, le taux de rétention, ainsi que la distribution des cellules transplantées dans le tissu ciblé 9,10,11. Une approche novatrice réalisable qui surmonte la limitation susmentionnée est l’administration de cellules sans aiguille via la technologie du jet d’eau.
La technologie du jet d’eau (WJ) émerge comme une nouvelle approche qui permet l’administration à haut débit de cellules par cystoscope sous contrôle visuel dans le sphincter urétral12,13. Le WJ permet la livraison de cellules à différentes pressions (E = effets en bar) allant de E5 à E8013. Dans la première phase, une solution isotonique (phase de pénétration tissulaire) est appliquée à haute pression (c.-à-d. E60 ou E80) afin de desserrer la matrice extracellulaire entourant le tissu ciblé et d’ouvrir de petites micro-lacunes interconnectées. Dans la deuxième phase (la phase d’injection), la pression est abaissée en quelques millisecondes (c’est-à-dire jusqu’à E10) afin de délivrer doucement les cellules dans le tissu ciblé. Suite à cette application en deux phases, les cellules ne sont pas soumises à une pression supplémentaire contre le tissu lorsqu’elles sont éjectées, mais flottent dans un flux à basse pression dans une zone caverneuse remplie de liquide13. Dans un contexte de modèle ex vivo où des cellules souches ont été injectées via WJ dans le tissu urétral cadavérique, les cellules viables pourraient ensuite être aspirées et extraites du tissu et élargies in vitro13. Bien qu’une étude réalisée en 2020 par Weber et al. ait démontré la faisabilité et l’applicabilité de WJ pour délivrer des cardiomyocytes sans empreinte dans le myocarde14, il faut garder à l’esprit que la technologie WJ est encore au stade de prototype.
Le protocole suivant décrit comment préparer et étiqueter les cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin (pADSC) et comment les administrer dans le liquide de capture et le tissu cadavérique via la technologie WJ et les aiguilles de cystoscopie Williams (WN). Après injection cellulaire, la vitalité et l’élasticité cellulaires par microscopie à force atomique (AFM) sont évaluées. Via des instructions étape par étape, le protocole donne une approche claire et concise pour acquérir des données fiables. La section de discussion présente et décrit les principaux avantages, limites et perspectives d’avenir de la technique. L’administration de cellules par WJ ainsi que les analyses post-traduction de séquelles rapportées ici remplacent l’injection d’aiguille standard et fournissent un cadre d’administration de cellules solides pour la guérison régénérative du tissu cible. Dans nos études récentes, nous avons fourni des preuves que WJ a délivré des cellules plus précisément et au moins à une viabilité comparable par rapport aux injections d’aiguilles 15,16.
Les échantillons de tissu adipeux porcin ont été obtenus à l’Institut de chirurgie expérimentale de l’Université de Tuebingen. Toutes les procédures ont été approuvées par les autorités locales de protection des animaux sous le numéro d’expérimentation animale CU1/16.
1. Isolement des cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin
2. Culture cellulaire de cellules stromales dérivées du tissu adipeux porcin
3. Marquage des cellules avec la calcéine-AM
REMARQUE: Les cellules injectées dans les tissus cadavériques sont colorées avec une coloration de cellules vivantes perméable à la membrane fluorescente verte et un indicateur de viabilité imperméable à la membrane fluorescente rouge pour vérifier que les cellules extraites sont les mêmes que les cellules injectées et non les fragments de tissu de l’urètre.
4. Préparer des échantillons de tissu urétral pour les injections
5. Injections de cellules via une aiguille Williams dans des fluides et des échantillons de tissus
6. Injections de cellules par jet d’eau dans des fluides et des échantillons de tissus
7. Évaluation biomécanique de l’élasticité cellulaire par microscopie à force atomique (AFM)
8. Analyse statistique
Après l’administration de cellules par les deux approches, la viabilité des cellules délivrées par le WN (97,2 ± 2 %, n = 10, p<0,002) était plus élevée que celle des injections par WJ utilisant les paramètres E60-10 (85,9 ± 0,16 %, n = 12) (Figure 2). Les résultats de l’évaluation biomécanique ont montré que : les injections de cellules dans le liquide de capture n’ont montré aucune différence significative par rapport aux modules élastiques (EM; 0,992 kPa) par rappor...
Dans la présente étude, nous avons démontré et présenté une approche étape par étape pour la procédure d’administration de cellules WJ et utilisé une séquelle d’investigations quantitatives pour évaluer l’effet de l’administration WJ sur les caractéristiques cellulaires: viabilité cellulaire et caractéristiques biomécaniques (c.-à-d. EM). Après l’injection de WJ, 85,9% des cellules récoltées étaient viables. En termes d’injection de WN, 97,2% des cellules ont conservé leur viabilité apr...
Les auteurs J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. n’ont rien à divulguer. Les auteurs W.L. et M.D.E. sont des employés d’ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, le producteur de l’ERBEJet2 et du prototype WJ utilisé dans cette étude.
Nous remercions nos co-auteurs des publications originales pour leur aide et leur soutien.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
AFM software | Bruker | JPK00518 | |
AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
laboratory bags | Brand | 759705 | |
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
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