Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
İğnesiz su jeti teknolojisi ile hücre enjeksiyonu yöntemini, hücresel canlılık, proliferasyon ve elastikiyet ölçümleri açısından doğum sonrası araştırmaların bir sekeli ile birlikte sunuyoruz.
Üriner inkontinans (UI), üretral sfinkter kasının eksikliği ile karakterize oldukça yaygın bir durumdur. Rejeneratif tıp dalları, özellikle hücre tedavisi, üretral sfinkter fonksiyonunu iyileştirmek ve restore etmek için yeni yaklaşımlardır. Aktif fonksiyonel hücrelerin enjeksiyonu rutin olarak klinik ortamlarda iğne ve şırınga ile yapılsa da bu yaklaşımların önemli dezavantajları ve kısıtlılıkları vardır. Bu bağlamda, iğnesiz su jeti (WJ) teknolojisi, üretral sfinkterde görsel rehberli sistoskopi ile canlı hücreleri enjekte edebilen uygulanabilir ve yenilikçi bir yöntemdir. Bu çalışmada, domuz yağ dokusu kaynaklı stromal hücreleri (pADSC'ler) kadavra üretral dokusuna vermek için WJ'yi kullandık ve daha sonra WJ doğumunun hücre verimi ve canlılığı üzerindeki etkisini araştırdık. Ayrıca biyomekanik özellikleri (yani elastikiyeti) atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ölçümleri ile değerlendirdik. WJ tarafından verilen pADSC'lerin hücresel elastikiyetlerinde önemli ölçüde azaldığını gösterdik. Canlılık kontrollere kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü, ancak hala% 80'in üzerinde.
Üriner inkontinans (UI), Avrupa popülasyonlarında prevalansı %1.8-30.5 arasında değişen yaygın bir hastalıktır1 ve öncelikle üretral sfinkterin fonksiyon bozukluğu ile karakterizedir. Klinik açıdan bakıldığında, cerrahi tedavi genellikle konservatif tedaviler veya fizyoterapi ortaya çıkan semptomları ele almadığında ve hafifletemediğinde hastalara sunulmaktadır.
Sfinkter kompleksi fonksiyon bozukluğunun potansiyel rejeneratif onarımı için hücre tedavisi, UI patolojisinin tedavisinde avangard bir yaklaşım olarak ortaya çıkmaktadır 2,3. Başlıca hedefleri, hasarlı dokunun biyolojik işlevselliğini değiştirmek, onarmak ve geri kazanmaktır. UI için hayvan modellerinde, kök hücre nakli ürodinamik sonuçlarda umut verici sonuçlar göstermiştir 2,4,5. Kök hücreler, kendini yenileme ve çok güçlü farklılaşma geçirme yeteneğine sahip oldukları için optimal hücresel adaylar olarak ortaya çıkarlar, böylece etkilenen doku yenilenmesine yardımcıolurlar 6. Yaklaşan rejeneratif potansiyele rağmen, hücre tedavisinin pratik kullanımı, hücrelerin minimal invaziv olarak verilmesi, enjeksiyon hassasiyeti ve hedefin kapsamı ile ilgili çeşitli zorluklarla karşı karşıya kaldığı için engellenmektedir. Hücre iletimi için kullanılan mevcut yaklaşım bir iğne-şırınga sistemi7 yoluyla enjeksiyon olsa da, genellikle transplantasyon sonrası% 1 -% 31 kadar düşük bildirilen canlılıklarla, genel olarak canlı hücrelerin eksikliğine neden olur8. Ek olarak, iğne enjeksiyonu yoluyla hücre iletiminin, yerleştirmeyi, tutma oranını ve nakledilen hücrelerin hedeflenen dokuya dağılımını etkilediği gösterilmiştir 9,10,11. Yukarıda belirtilen sınırlamanın üstesinden gelen uygulanabilir, yeni bir yaklaşım, su jeti teknolojisi ile iğnesiz hücre dağıtımıdır.
Su jeti (WJ) teknolojisi, üretral sfinkter12,13'te görsel kontrol altında sistoskop ile hücrelerin yüksek verimli bir şekilde verilmesini sağlayan yeni bir yaklaşım olarak ortaya çıkmaktadır. WJ, E5 ila E8013 arasında değişen farklı basınçlarda (E = çubuktaki etkiler) hücre iletimini sağlar. İlk aşamada, hedeflenen dokuyu çevreleyen hücre dışı matrisi gevşetmek ve birbirine bağlanan küçük mikro lakunayı açmak için yüksek basınçla (yani E60 veya E80) izotonik çözelti uygulanır. İkinci aşamada (enjeksiyon aşaması), hücreleri hedeflenen dokuya nazikçe iletmek için basınç milisaniyeler içinde (yani E10'a kadar) düşürülür. Bu iki aşamalı faz uygulamasını takiben, hücreler dışarı atıldığında dokuya karşı ek basınca maruz kalmazlar, ancak düşük basınçlı bir akışta sıvı dolu bir kavernöz alanayüzerler 13. Kök hücrelerin WJ yoluyla kadavra üretra dokusuna enjekte edildiği bir ex vivo model ortamında, canlı hücreler daha sonra aspire edilebilir ve dokudan alınabilir ve in vitro13 daha da genişletilebilir. Weber ve ark. tarafından yapılan bir 2020 çalışması, WJ'nin miyokard14'e ayak izi içermeyen kardiyomiyositler vermek için fizibilitesini ve uygulanabilirliğini göstermiş olsa da, WJ teknolojisinin hala prototip aşamasında olduğu akılda tutulmalıdır.
Aşağıdaki protokol, domuz yağ dokusundan türetilmiş stromal hücrelerin (pADSC) nasıl hazırlanacağını ve etiketleneceğini ve bunların WJ teknolojisi ve Williams sistoskopi iğneleri (WN) aracılığıyla yakalama sıvısı ve kadavra dokusuna nasıl iletileceğini açıklamaktadır. Hücresel enjeksiyon sonrası, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile hücresel canlılık ve elastikiyet değerlendirilir. Adım adım talimatlar aracılığıyla, protokol güvenilir veriler elde etmek için açık ve özlü bir yaklaşım sunar. Tartışma bölümü, tekniğin başlıca avantajlarını, sınırlamalarını ve gelecekteki perspektiflerini sunar ve açıklar. Hücrelerin WJ dağıtımı ve burada bildirilen sekel sonrası çeviri analizleri, standart iğne enjeksiyonunun yerini almakta ve hedef dokunun rejeneratif iyileşmesi için katı hücre dağıtım çerçevesi sağlamaktadır. Son çalışmalarımızda, WJ'nin iğne enjeksiyonlarına kıyasla hücreleri daha kesin ve en azından karşılaştırılabilir canlılıkta verdiğine dair kanıtlar sağladık15,16.
Domuz yağ dokusu örnekleri Tuebingen Üniversitesi Deneysel Cerrahi Enstitüsü'nden alındı. Tüm prosedürler yerel hayvan refahı yetkilileri tarafından CU1/16 hayvan deney numarası altında onaylanmıştır.
1. Domuz yağ dokusu kaynaklı stromal hücrelerin izolasyonu
2. Domuz yağ dokusu kaynaklı stromal hücrelerin hücre yetiştiriciliği
3. Kalsein-AM ile hücrelerin etiketlenmesi
NOT: Kadavra dokularına enjekte edilen hücreler, ekstrakte edilen hücrelerin üretranın doku parçalarıyla değil, enjekte edilen hücrelerle aynı olduğunu doğrulamak için yeşil floresan membran geçirgen canlı hücre boyası ve kırmızı floresan membran geçirimsiz canlılık göstergesi ile boyanır.
4. Enjeksiyonlar için üretral doku örnekleri hazırlayın
5. Williams iğnesi yoluyla sıvılara ve doku örneklerine hücre enjeksiyonları
6. Sıvılarda ve doku örneklerinde su jeti yoluyla hücre enjeksiyonları
7. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile hücresel elastikiyetin biyomekanik olarak değerlendirilmesi
8. İstatistiksel analiz
İki yaklaşımla hücre dağıtımını takiben, WN yoluyla verilen hücrelerin yaşayabilirliği (97.2 ±% 2, n = 10, p <0.002), E60-10 ayarları (85.9 ±% 0.16, n = 12) kullanılarak WJ tarafından yapılan enjeksiyonlara kıyasla daha yüksekti (Şekil 2). Biyomekanik değerlendirme sonuçları şunu göstermiştir: Yakalama sıvısındaki hücrelerin WN enjeksiyonları, kontrollere (1.176 kPa; 0.176 kPa; Şekil 3A), WJ enjeksiyonları hücresel EM'de öneml...
Bu çalışmada, WJ hücre dağıtım prosedürü için adım adım bir yaklaşım gösterdik ve sunduk ve WJ dağıtımının hücresel özellikler üzerindeki etkisini değerlendirmek için nicel araştırmaların bir sekelini kullandık: hücresel canlılık ve biyomekanik özellikler (yani, EM). WJ enjeksiyonunu takiben, hasat edilen hücrelerin% 85.9'u yaşayabilirdi. WN enjeksiyonu açısından, hücrelerin% 97.2'si enjeksiyondan sonra canlılıklarını korudu. Bu nedenle, WJ yaklaşımı klinik bir uygulama için...
Yazarların J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A.'nın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur. Yazarlar W.L. ve M.D.E., ERBEJet2'nin üreticisi ve bu çalışmada kullanılan WJ prototipi olan ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen'in çalışanlarıdır.
Orijinal yayınlardan ortak yazarlarımıza yardım ve destekleri için teşekkür ederiz.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
AFM software | Bruker | JPK00518 | |
AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
laboratory bags | Brand | 759705 | |
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır