JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İğnesiz su jeti teknolojisi ile hücre enjeksiyonu yöntemini, hücresel canlılık, proliferasyon ve elastikiyet ölçümleri açısından doğum sonrası araştırmaların bir sekeli ile birlikte sunuyoruz.

Özet

Üriner inkontinans (UI), üretral sfinkter kasının eksikliği ile karakterize oldukça yaygın bir durumdur. Rejeneratif tıp dalları, özellikle hücre tedavisi, üretral sfinkter fonksiyonunu iyileştirmek ve restore etmek için yeni yaklaşımlardır. Aktif fonksiyonel hücrelerin enjeksiyonu rutin olarak klinik ortamlarda iğne ve şırınga ile yapılsa da bu yaklaşımların önemli dezavantajları ve kısıtlılıkları vardır. Bu bağlamda, iğnesiz su jeti (WJ) teknolojisi, üretral sfinkterde görsel rehberli sistoskopi ile canlı hücreleri enjekte edebilen uygulanabilir ve yenilikçi bir yöntemdir. Bu çalışmada, domuz yağ dokusu kaynaklı stromal hücreleri (pADSC'ler) kadavra üretral dokusuna vermek için WJ'yi kullandık ve daha sonra WJ doğumunun hücre verimi ve canlılığı üzerindeki etkisini araştırdık. Ayrıca biyomekanik özellikleri (yani elastikiyeti) atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ölçümleri ile değerlendirdik. WJ tarafından verilen pADSC'lerin hücresel elastikiyetlerinde önemli ölçüde azaldığını gösterdik. Canlılık kontrollere kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü, ancak hala% 80'in üzerinde.

Giriş

Üriner inkontinans (UI), Avrupa popülasyonlarında prevalansı %1.8-30.5 arasında değişen yaygın bir hastalıktır1 ve öncelikle üretral sfinkterin fonksiyon bozukluğu ile karakterizedir. Klinik açıdan bakıldığında, cerrahi tedavi genellikle konservatif tedaviler veya fizyoterapi ortaya çıkan semptomları ele almadığında ve hafifletemediğinde hastalara sunulmaktadır.

Sfinkter kompleksi fonksiyon bozukluğunun potansiyel rejeneratif onarımı için hücre tedavisi, UI patolojisinin tedavisinde avangard bir yaklaşım olarak ortaya çıkmaktadır 2,3. Başlıca hedefleri, hasarlı dokunun biyolojik işlevselliğini değiştirmek, onarmak ve geri kazanmaktır. UI için hayvan modellerinde, kök hücre nakli ürodinamik sonuçlarda umut verici sonuçlar göstermiştir 2,4,5. Kök hücreler, kendini yenileme ve çok güçlü farklılaşma geçirme yeteneğine sahip oldukları için optimal hücresel adaylar olarak ortaya çıkarlar, böylece etkilenen doku yenilenmesine yardımcıolurlar 6. Yaklaşan rejeneratif potansiyele rağmen, hücre tedavisinin pratik kullanımı, hücrelerin minimal invaziv olarak verilmesi, enjeksiyon hassasiyeti ve hedefin kapsamı ile ilgili çeşitli zorluklarla karşı karşıya kaldığı için engellenmektedir. Hücre iletimi için kullanılan mevcut yaklaşım bir iğne-şırınga sistemi7 yoluyla enjeksiyon olsa da, genellikle transplantasyon sonrası% 1 -% 31 kadar düşük bildirilen canlılıklarla, genel olarak canlı hücrelerin eksikliğine neden olur8. Ek olarak, iğne enjeksiyonu yoluyla hücre iletiminin, yerleştirmeyi, tutma oranını ve nakledilen hücrelerin hedeflenen dokuya dağılımını etkilediği gösterilmiştir 9,10,11. Yukarıda belirtilen sınırlamanın üstesinden gelen uygulanabilir, yeni bir yaklaşım, su jeti teknolojisi ile iğnesiz hücre dağıtımıdır.

Su jeti (WJ) teknolojisi, üretral sfinkter12,13'te görsel kontrol altında sistoskop ile hücrelerin yüksek verimli bir şekilde verilmesini sağlayan yeni bir yaklaşım olarak ortaya çıkmaktadır. WJ, E5 ila E8013 arasında değişen farklı basınçlarda (E = çubuktaki etkiler) hücre iletimini sağlar. İlk aşamada, hedeflenen dokuyu çevreleyen hücre dışı matrisi gevşetmek ve birbirine bağlanan küçük mikro lakunayı açmak için yüksek basınçla (yani E60 veya E80) izotonik çözelti uygulanır. İkinci aşamada (enjeksiyon aşaması), hücreleri hedeflenen dokuya nazikçe iletmek için basınç milisaniyeler içinde (yani E10'a kadar) düşürülür. Bu iki aşamalı faz uygulamasını takiben, hücreler dışarı atıldığında dokuya karşı ek basınca maruz kalmazlar, ancak düşük basınçlı bir akışta sıvı dolu bir kavernöz alanayüzerler 13. Kök hücrelerin WJ yoluyla kadavra üretra dokusuna enjekte edildiği bir ex vivo model ortamında, canlı hücreler daha sonra aspire edilebilir ve dokudan alınabilir ve in vitro13 daha da genişletilebilir. Weber ve ark. tarafından yapılan bir 2020 çalışması, WJ'nin miyokard14'e ayak izi içermeyen kardiyomiyositler vermek için fizibilitesini ve uygulanabilirliğini göstermiş olsa da, WJ teknolojisinin hala prototip aşamasında olduğu akılda tutulmalıdır.

Aşağıdaki protokol, domuz yağ dokusundan türetilmiş stromal hücrelerin (pADSC) nasıl hazırlanacağını ve etiketleneceğini ve bunların WJ teknolojisi ve Williams sistoskopi iğneleri (WN) aracılığıyla yakalama sıvısı ve kadavra dokusuna nasıl iletileceğini açıklamaktadır. Hücresel enjeksiyon sonrası, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile hücresel canlılık ve elastikiyet değerlendirilir. Adım adım talimatlar aracılığıyla, protokol güvenilir veriler elde etmek için açık ve özlü bir yaklaşım sunar. Tartışma bölümü, tekniğin başlıca avantajlarını, sınırlamalarını ve gelecekteki perspektiflerini sunar ve açıklar. Hücrelerin WJ dağıtımı ve burada bildirilen sekel sonrası çeviri analizleri, standart iğne enjeksiyonunun yerini almakta ve hedef dokunun rejeneratif iyileşmesi için katı hücre dağıtım çerçevesi sağlamaktadır. Son çalışmalarımızda, WJ'nin iğne enjeksiyonlarına kıyasla hücreleri daha kesin ve en azından karşılaştırılabilir canlılıkta verdiğine dair kanıtlar sağladık15,16.

Protokol

Domuz yağ dokusu örnekleri Tuebingen Üniversitesi Deneysel Cerrahi Enstitüsü'nden alındı. Tüm prosedürler yerel hayvan refahı yetkilileri tarafından CU1/16 hayvan deney numarası altında onaylanmıştır.

1. Domuz yağ dokusu kaynaklı stromal hücrelerin izolasyonu

  1. Deneysel Cerrahi Enstitüsü'nden laboratuvara 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde verilen domuz yağ dokusunu kullanın.
  2. Dokuyu steril tezgahın altındaki steril bir Petri kabına aktarın ve iki neşterle (No. 10) küçük parçalara ve çamura kıyın.
    NOT: Makas, küçük parçalar elde etmek için de kullanılabilir. Parçalar ne kadar küçük olursa, bir sonraki sindirim için o kadar iyidir.
    1. Küçük parçaları/mantarı 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir çalkalayıcı üzerinde 37 °C'de 30 dakika boyunca 5 mL homojenizatör çözeltisi ile inkübe edin. Homojenizatör çözeltisi, %1 sığır serum albümini (BSA) (stok çözeltisi: PBS'de %1 (w/v) BSA) ve %0,1 kollajenaz tip I içeren PBS'dir.
      NOT: Homojenizatör solüsyonunu her zaman taze olarak hazırlayın. Çalkalayıcı, 25-500 rpm yavaş bir hızda dairesel bir sallama hareketine sahiptir.
  3. Kuluçkayı durdurmak için, 10 mL büyüme ortamı ekleyin [Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta - düşük glikoz (DMEM-LG),% 2.5 HEPES sodyum tuzu çözeltisi (1 M),% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 L-Glutamin (200 mM), % 1 Penisilin-Streptomisin (10000 U / mL Penisilin; 10.000 μg / mL Streptomisin) ve% 1 Amfoterisin B (250 μg / mL)].
    NOT: Büyüme ortamı önceden hazırlanabilir. Hücreleri kontaminasyonlardan korumak için hücre kültürü için büyüme ortamının hazırlanmasında antibiyotikler ve antifungal ilaçlar gereklidir.
  4. Santrifüj tüplerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Fraksiyonu daha hafif olan ve bu nedenle sıvının üzerinde yüzen adipositlerle 10 mL'lik bir pipetle aspire edin ve atın.
  6. Yağ dokusu fragmanlarını tutmak ve sadece hücre süspansiyonunu geri almak için kalan stromal fraksiyonu, ağır metallerden arındırılmış bir polietilen tereftalat (PET) membranlı 100 μm'lik bir hücre eleğinden süzün.
  7. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 630 x g'da 7 dakika santrifüj yapın.
  8. Hücreleri bir kez yıkamak için hücre peletini 2 mL PBS'de yeniden askıya alın.
  9. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 630 x g'da 7 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.
  10. Santrifüjleme ve hücre peletinin şişe başına 10 mL büyüme ortamında tekrar tekrar askıya alınmasından sonra, 75cm2 hücre kültürü şişelerindeki tohum hücreleri.
    NOT: PBS ile yıkama adımından sonra hücre peletinin boyutuna bağlı olarak, bir ila dört şişede tohum hücreleri.

2. Domuz yağ dokusu kaynaklı stromal hücrelerin hücre yetiştiriciliği

  1. Hücreleri %70 birleşime ulaştıklarında hasat edin ve geçirin.
  2. 10 mL PBS içeren hücreleri iki kez yıkayın ve PBS'yi tamamen aspire edin.
    NOT: Bu adım, %10 FBS ile tamamlanan kalan büyüme ortamını kaldırmak için gereklidir. FBS, aşağıdaki tripsinizasyonun işlevini engelleyebilecek birkaç proteaz inhibitörüne sahiptir.
  3. Hücreleri ayırmak için şişe başına 3 mL% 0.05-Tripsin-EDTA ekleyin.
  4. Şişeleri 37 °C'de 3 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Mikroskop altında hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.
    NOT: Bazen hücrelerin ayrılması biraz daha zaman alır. Bu durumda, şişeleri 37 ° C'de maksimum 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Kuluçka ve ayrılma işlemini durdurmak için, 3 mL büyüme ortamı ekleyin.
    NOT: Yukarıda belirtildiği gibi, büyüme ortamı proteaz inhibitörleri içeren% 10 FBS ile tamamlanmaktadır.
  7. Ayrılan hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 630 x g'de 7 dakika boyunca santrifüj yapın.
  8. Hücreleri 10 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın ve bir hemositometre ile sayın.
  9. 75cm2 şişe başına 3 x 105 hücre aşılama yoğunluğuna sahip tohum hücreleri.

3. Kalsein-AM ile hücrelerin etiketlenmesi

NOT: Kadavra dokularına enjekte edilen hücreler, ekstrakte edilen hücrelerin üretranın doku parçalarıyla değil, enjekte edilen hücrelerle aynı olduğunu doğrulamak için yeşil floresan membran geçirgen canlı hücre boyası ve kırmızı floresan membran geçirimsiz canlılık göstergesi ile boyanır.

  1. Hücreleri 10 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  2. 75cm2 şişe başına 5 mL boya çözeltisi ekleyin. Boya çözeltisi, 2 μM yeşil floresan membran geçirgen canlı hücre boyası ve 4 μM kırmızı floresan membran geçirimsiz canlılık göstergesi içeren büyüme ortamından oluşur.
  3. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Boya çözeltisini aspire edin ve atın.
  5. Hücreleri 10 mL PBS ile iki kez tekrar yıkayın.
  6. Büyüme ortamı ekleyin ve floresan mikroskobu ile yeşil ve kırmızı floresan sinyalini belgeleyin.
    1. 75cm2'lik şişeyi mikroskop masasına yerleştirin, 10x hedefini kullanın, floresan filtresi seçmeyin ve iletilen ışık yolunun aktif olduğundan emin olun.
      NOT: Bu adımların tümü mikroskopta manuel olarak gerçekleştirilir.
    2. Adım 3.6.1'e paralel olarak, yazılım programını açın.
    3. Masanın üzerindeki şişedeki hücrelerin canlı bir görüntüsünü elde etmek için Bul sekmesinin altındaki Canlı düğmesine basın ve kaba ve ince ayar sürücüleriyle bunlara odaklanın.
      NOT: Sağ görüşte, Canlı düğmesi etkinleştirildikten sonra canlı görüntü görünecektir.
    4. Mikroskop Bileşenleri alt sekmesinde, doğru hedefi (10x) seçin.
    5. Kamera alt sekmesinde, Otomatik Pozlama için bir onay işareti uygulayın.
    6. İletilen ışıkla ilk fotoğrafı çekmek için Tutturma düğmesine basın.
    7. Menü çubuğundaki Grafikler sekmesini kullanarak ve Ölçek Çubuğu'nu seçerek ölçek çubuğunu ekleyin.
    8. Menü çubuğundaki Dosyalar sekmesini kullanarak ve czi olarak kaydet'i seçerek görüntüyü kaydedin.
    9. Floresan resimler için filtreyi yeşil veya kırmızı floresan için özel olanla değiştirin ve yansıyan ışık yolunu seçin.
      NOT: Bu değişiklikler mikroskopta manuel olarak yapılmalıdır.
    10. Hücrelerin canlı görüntüsünü elde etmek için Bul sekmesinin altındaki Canlı düğmesine tekrar basın.
    11. Yeşil veya kırmızı floresan ile ikinci fotoğrafı çekmek için Tutturma düğmesine basın.
    12. Menü çubuğundaki Grafikler sekmesini kullanarak ve Ölçek Çubuğu'nu seçerek ölçek çubuğunu ekleyin.
    13. Menü çubuğundaki Dosyalar sekmesini kullanarak ve czi olarak kaydet'i seçerek görüntüyü kaydedin.
    14. 3.6.9 ile 3.6.13 arasındaki adımları diğer floresan kanalıyla yineleyin.

4. Enjeksiyonlar için üretral doku örnekleri hazırlayın

  1. Üretrayı ve bağlantı mesanesini domuzdan disseke edin.
    NOT: Deneyler için yetişkin dişi landrace domuzlarının taze kadavra örneklerinden üretral doku örnekleri kullanılmıştır.
  2. Islak buz üzerindeki torbalarda laboratuvara taşıyın.
    NOT: Numuneler daha sonraki işlemlere kadar buz üzerinde bırakılmalıdır. Numunelere hiçbir katkı maddesi eklenmedi.
  3. Üretrayı mesane ile birlikte alt pelvik tabanın elastikiyetini taklit eden bir sünger üzerine yerleştirin.
    1. Üretranın oryantasyonunu (proksimal, distal, dorsal ve ventral) belirlemek için mesaneyi kullanın. Bu, üreterlerin lokalizasyonu ve mesaneyi karın ve pelvik boşlukta sabitleyen üç ligament nedeniyle mümkündür. Üç ligament, mesanenin yanlarındaki iki vesicae lateralia ligamenti ve mesanenin ventral yüzeyinden kaynaklanan vesicae medianum'dur (Şekil 1).
  4. Bir kateter yardımıyla üretrayı dorsal tarafta uzunlamasına kesin.
  5. Hücreleri, aşağıdaki bölümlerde açıklandığı gibi açılan üretraya enjekte edin.

5. Williams iğnesi yoluyla sıvılara ve doku örneklerine hücre enjeksiyonları

  1. Adım 2'de açıklandığı gibi hücreleri toplayın.
  2. Adım 2.9'un aksine, enjeksiyonlar için hücre yoğunluğunu mL başına 2.4 x 106 hücreye ayarlayın.
    NOT: Doku örneklerine enjeksiyonlar için hücreleri yeşil floresan membran geçirgen canlı hücre ile etiketleyin.
  3. Hücre süspansiyonunu bir şırınga ile aspire edin ve Williams sistoskopik enjeksiyon iğnesini (WN) uygulayın.
  4. İğneyi 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 2 mL'lik büyüme ortamının kısa bir süre üzerinde tutun veya iğneyi açılan üretra dokusuna yerleştirin. Her iki durumda da 250 μL hücreyi manuel olarak enjekte edin.
    NOT: Kadavra üretrasına enjekte edilen hücreler bir enjeksiyon kubbesi oluşturur.
  5. Oda sıcaklığında 630 x g'da 7 dakika boyunca santrifüjleme yoluyla doğrudan ortama enjekte edilen hücreleri toplayın.
  6. Kadavra üretraya enjekte edilen hücreler için, bir şırınga üzerine uygulanan 18G iğne ile enjeksiyon kubbesinden aspire edin.
  7. Enjekte edilen ve aspire edilen hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve ortama enjekte edilen hücrelere kıyasla oda sıcaklığında 630 x g'da 7 dakika boyunca santrifüj yapın.
  8. Santrifüjlemeden sonra, her iki durumda da hücreleri 4 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın.
  9. Bir hemositometre ile Trypan mavi boya dışlaması yardımıyla hücre verimini ve canlılığını belirleyin.
    1. 20 μL hücre süspansiyonunu 20 μL Tripan mavisi ile iyice karıştırın.
    2. Bu karışımın 10 μL'sini hemositometrenin her odasına doldurun.
      NOT: Her iki oda da doldurulur ve örneklemeyi iki katına çıkararak istatistiksel optimizasyon elde etmek için sayılır.
    3. Mikroskop altında, dört köşe karesinin tümündeki hücreleri sayın.
      NOT: Beyaz (lekesiz) renkte parlayan hücreleri canlı hücreler olarak sayarken, mavi (lekeli) parlayan hücreler ölü hücreler olarak sayılır.
    4. mL başına hücre sayısını hesaplamak için, iki odanın ortalamasını hesaplayın, bu sayıyı ikiye bölün ve 104 ile çarpın.

6. Sıvılarda ve doku örneklerinde su jeti yoluyla hücre enjeksiyonları

  1. Adım 2'de açıklandığı gibi hücreleri toplayın.
  2. Adım 2.9 ve 5.2'nin aksine, enjeksiyonlar için hücre yoğunluğunu mL başına 6 x 106 hücreye ayarlayın.
    NOT: Doku örneklerine enjeksiyonlar için, yeşil floresan membran geçirgen canlı hücre ile etiketlenmiş hücreler kullanın.
  3. Hücre süspansiyonunu WJ cihazının dozaj ünitesine doldurun.
  4. Enjeksiyon nozulunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 2 mL'lik büyüme ortamının kısa bir süre üzerinde veya açılan üretra dokusunun kısa bir süre üzerinde tutun.
  5. Her iki durumda da, doku penetrasyonu için yüksek basınç kullanarak cihaz tarafından 100 μL hücre enjekte edin ve ardından hücre enjeksiyonları için düşük basınçlı bir faz uygulayın. E60-10 basınç ayarlarını kullanın.
    NOT: Kadavra üretrasına enjekte edilen hücreler bir enjeksiyon kubbesi oluşturur.
  6. Oda sıcaklığında 630 x g'da 7 dakika boyunca santrifüjleme yoluyla doğrudan ortama enjekte edilen hücreleri toplayın.
  7. Kadavra üretraya enjekte edilen hücreler için, bir şırınga üzerine uygulanan 18G iğne ile enjeksiyon kubbesinden aspire edin.
  8. Enjekte edilen ve aspire edilen hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve ortama enjekte edilen hücrelere kıyasla oda sıcaklığında 630 x g'da 7 dakika boyunca santrifüj yapın.
  9. Santrifüjlemeden sonra, her iki durumda da 4 mL büyüme ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.
  10. 5.10'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir hemositometre ile Trypan mavi boya dışlaması yardımıyla hücre verimini ve canlılığını belirleyin.

7. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile hücresel elastikiyetin biyomekanik olarak değerlendirilmesi

  1. Numunelerin hazırlanması
    NOT: Enjeksiyondan sonra alınan hücreler şimdi AFM tarafından daha ileri analizlere tabidir. Ek olarak, enjekte edilmeyen hücreler kontrol olarak kullanılır.
    1. Doku kültürü kaplarındaki tohum hücreleri, yemek başına 5 x 105 hücre yoğunluğa sahiptir.
      NOT: Koşul başına bir doku kültürü kabını tohumlayın. Koşullar kontroller, WJ veya WN tarafından ortama enjekte edilen ADSC'ler ve WJ veya WN tarafından kadavra dokusuna enjekte edilen ADSC'lerdir.
    2. Doku kültürü kaplarındaki hücreleri 37 °C'de 3 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: G1 fazındaki hücrelere bağlı varyansları önlemek için ve mitoz sırasında, hücre tohumlama adımından 3 saat sonra AFM ölçümleri yaptık.
    3. AFM ile yapılan ölçümden hemen önce, büyüme ortamını L-glutaminsiz Leibovitz'in L-15 ortamının 3 mL'si ile değiştirin.
    4. Doku kültürü kabını AFM cihazının numune tutucusuna yerleştirin ve 37 °C'ye ayarlanmış Petri kabı ısıtıcısını açın.
  2. AFM ve konsol kalibrasyonunun hazırlanması
    1. Sıvılardaki ölçümler için belirtilen bir cam blok kullanın ve AFM tutucu üzerinde ayarlayın.
      NOT: Cam bloğun üst yüzeyi düz ve AFM tutucuya paralel olmalıdır.
    2. Konsolu cam bloğun yüzeyine dikkatlice yerleştirin. A ucu, cilalı optik düzlemin üzerine yerleştirilmelidir.
      NOT: Cam bloğun cilalı optik yüzeyini çizmeyin, çünkü çizikler ölçümlerde parazite neden olabilir. A ucu cilalı optik düzlem üzerinde çıkıntı yapmalıdır, aksi takdirde AFM'nin lazerinin fotodetektöre yansıması mümkün değildir.
    3. Cam blok üzerindeki konsolunu stabilize etmek için, cımbız yardımıyla metalik bir yay ekleyin.
    4. Konsol cam blok üzerine sabitlendiğinde, bloğu AFM kafasına yerleştirin ve entegre kilitleme mekanizmasını kilitleyin.
    5. AFM kafasını AFM aygıtına takın.
      NOT: Yay doğru yerleştirilebilmesi için sol tarafa bakmalıdır. Durum böyle değilse, cam bloğun konumunu düzeltin ve AFM kafasını tekrar ayarlayın.
    6. Yazılım kurulumunu başlatın ve yazılımı lazer hizalama penceresi ve yaklaşım parametresi ayarlarıyla birlikte açın. Ek olarak, step motoru, lazer ışığını ve CCD kamerayı açın.
    7. CCD kamerayı kullanarak konsol ucu A'yı tanımlayın.
    8. Konsolu ortama tamamen daldırılana kadar indirin. Bu amaca ulaşmak için step motor fonksiyonunu kullanın.
    9. Konsol tamamen ortamla kaplandıktan sonra, lazer ayar vidaları kullanılarak konsol üstüne hizalanır. Yansıyan ışın fotodetektörün merkezine düşmeli ve sinyallerin toplamı 1 V veya daha yüksek olmalıdır. Yanal ve dikey sapmalar 0'a yakın olmalıdır.
      NOT: Merkeze ulaşılırsa sinyal değerlerinin yanı sıra lazer hizalama fonksiyonu da izlenebilir. Sinyal değerleri doğru değilse, daha fazla ayarlama yapılması gerekir.
    10. Şimdi yaklaşım parametreleriyle tarayıcı Yaklaşımı'nı çalıştırın (Tablo 1).
    11. Geri Çek düğmesine basarak konsol dibe ulaştığında 100 μm geri çekin .
      NOT: Yaklaşım yapıldığında o alana hiçbir hücrenin bağlı olmadığından emin olun, çünkü bu kalibrasyonu tahrif eder.
    12. Çalışma parametrelerini aşağıdaki özelliklere göre ayarlayın: Ayar Noktası 1 V, Çekme Uzunluğu 90 μm, Hız: 5 μm/s, Örnekleme hızı: 2000 Hz ve Gecikme Modu olarak: Sabit Kuvvet.
    13. Çalıştır düğmesine basarak kalibrasyon kuvvet-mesafe eğrisi ölçümünü başlatın.
      NOT: Yazılımdaki Çalıştır düğmesine tıklanarak bir kuvvet-mesafe eğrisi elde edilir.
    14. Elde edilen kalibrasyon kuvvet-mesafe eğrisi üzerindeki yazılımda geri çekilen eğrinin doğrusal uyum bölgesini seçin. Yazılım tarafından yay sabiti ölçümünü hesaplayın.
    15. Konsolu, Danalache ve ark.17 tarafından açıklandığı gibi tam parametreleri ve adımları izleyerek kalibre edin.
  3. Tek tek hücrelerin elastikiyetini ölçme
    1. Bir hücreyi görsel olarak tanımlayın ve ona odaklanın. Bilgisayar faresini hücrenin ortasına yerleştirin. Ölçüm hassasiyetini artırmak için, AFM ucunu doğrudan hücre çekirdeğinin üzerine yerleştirin.
      NOT: Bilgisayar faresi, hedef girinti bölgesini tanımlamak için görsel işaretçi olarak kullanılır.
    2. Şimdi konsola odaklanın ve bilgisayar faresinde hareket ettirin.
    3. Ölçümü Tablo 2'de verilen parametrelerle Run ile başlatın.
      NOT: Konsol kalibrasyonu ile elde edilen ayar noktası parametresi kullanılır. Ayrıca, bir hücre üç kez ölçülür. En az 50 hücre ölçün.
  4. Bilgi işlem
    1. Danalache 17 tarafından daha önce açıklandığı gibi tam adımları ve parametreleri izleyerek verileriişleyin.
    2. Dosyayı kaydedin ve dışa aktarın.

8. İstatistiksel analiz

  1. İstatistik yazılımını açın.
  2. Yeni Veri Kümesi seçimini seçin.
    Not: iki dosya açılır. Biri "DataSet", diğeri ise "Output" dosyasıdır.
  3. DataSet dosyasını seçin ve Değişken Görünümü sekmesini açın.
  4. Saha enjeksiyonu (yakalama sıvısı veya kadavra dokusu), kategori (kontrol, WJ enjeksiyonu, WN enjeksiyonu) ve elastikiyet için sayısal değişkenleri ekleyin.
  5. Ölçülen esneklik verilerini, Veri Görünümü sekmesinde karşılık gelen site ekleme ve kategori numaralarıyla birlikte ekleyin.
  6. Menü çubuğu sekmesini seçerek verileri analiz edin | analiz edin Tanımlayıcı İstatistikler ve Keşifsel veri analizi'ni seçin.
  7. Bağımlı değişken olarak Esneklik'i ve faktör listesi Kategori'yi seçin.
    NOT: Sonuçlar, sonuçlar bölümü için kullanılan bir kutu grafiği de dahil olmak üzere "Çıktı" dosyasında görüntülenir.
  8. İstatistiksel bir test gerçekleştirmek için, Analiz et menü çubuğu sekmesinin altındaki Parametrik Olmayan Test içindeki Bağımsız Numuneler'i seçin.
  9. Yeni açılan dosyada Amaç ve Ayarlar sekmesindeki ayarları saklayın.
  10. Alanlar sekmesini açın ve Test Alanları olarak Esneklik'i ve Gruplar olarak Kategori'yi seçin.
  11. Çalıştır'a basın.
    NOT: Sonuçlar "Çıktı" dosyasında görüntülenir. Bu analizler için Mann-U-Whitney testi yapılır.
  12. Parametrik olmayan testin sonucunu keşifsel veri analizinin kutu grafiğine ekleyin.
  13. Menü çubuğunda Dosya'yı seçip Kaydet'i seçerek dosyaları kaydedin.

Sonuçlar

İki yaklaşımla hücre dağıtımını takiben, WN yoluyla verilen hücrelerin yaşayabilirliği (97.2 ±% 2, n = 10, p <0.002), E60-10 ayarları (85.9 ±% 0.16, n = 12) kullanılarak WJ tarafından yapılan enjeksiyonlara kıyasla daha yüksekti (Şekil 2). Biyomekanik değerlendirme sonuçları şunu göstermiştir: Yakalama sıvısındaki hücrelerin WN enjeksiyonları, kontrollere (1.176 kPa; 0.176 kPa; Şekil 3A), WJ enjeksiyonları hücresel EM'de öneml...

Tartışmalar

Bu çalışmada, WJ hücre dağıtım prosedürü için adım adım bir yaklaşım gösterdik ve sunduk ve WJ dağıtımının hücresel özellikler üzerindeki etkisini değerlendirmek için nicel araştırmaların bir sekelini kullandık: hücresel canlılık ve biyomekanik özellikler (yani, EM). WJ enjeksiyonunu takiben, hasat edilen hücrelerin% 85.9'u yaşayabilirdi. WN enjeksiyonu açısından, hücrelerin% 97.2'si enjeksiyondan sonra canlılıklarını korudu. Bu nedenle, WJ yaklaşımı klinik bir uygulama için...

Açıklamalar

Yazarların J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A.'nın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur. Yazarlar W.L. ve M.D.E., ERBEJet2'nin üreticisi ve bu çalışmada kullanılan WJ prototipi olan ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen'in çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Orijinal yayınlardan ortak yazarlarımıza yardım ve destekleri için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL centrifuge tubeGreiner BioOne227261
1 mL BD Luer-LokTM SyringeBD Plastik Incn.a.
100 µm cell sieveGreiner BioOne542000
15 mL centrifuge tubeGreiner BioOne188271
75 cm2 tissue culture flaskCorning Incorporated353136
AFM head(CellHesion 200) JPKJPK00518
AFM processing softwareBrukerJPK00518
AFM softwareBrukerJPK00518
AFM system Cell Hesion 200BrukerJPK00518
All-In-One-Al cantileverBudget SensorsAIO-10tip A, Conatct Mode, Shape: Beam
Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m)
Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz)
Length: 500 µm (490 - 510 µm)
Width: 30 µm (35 - 45 µm)
Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
Amphotericin B solutionSigmaA2942250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, GermanyJPK00518
BD Microlance 3 18GBD304622
bovine serum albuminGibcoA10008-01
Cantilever All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, BulgariaAIO-TL-10tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometerNanoEnTek631-1098
centrifuge: Rotina 420RHettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powderGibco17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucoseSigmaD5546
Feather disposable scalpel (No. 10)Feather02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)SigmaF7524
HEPES sodium salt solution (1 M)SigmaH3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
laboratory bagsBrand759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamineMerckF1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)F1315
L-glutamineLonzaBE 17-605C1200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity KitInvitrogen by Thermo Fisher ScientificL3224Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6Zeiss
Microscope: AxioVertA.1Zeiss
Nelaton-Catheter femaleBicakcilar19512051
Penicillin-StreptomycinGibco15140-12210000 U/ml Penicillin
10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFMBrukerT-05-0117
Petri dish heater associated with AFMJPK Instruments AG, Berlin, GermanyT-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22IBM
Sterile Petri dish - CellStarGreiner BioOne664160
Tissue culture dishesTPP AGTPP93040
Tissue culture dishesTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Trypan Blue 0.4%
0.85% NaCl		Lonza17-942E
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
Waterjet: ERBEJET2 deviceErbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection NeedleCook MedicalG1422023G, 5.0 Fr, 35 cm

Referanslar

  1. Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
  2. Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
  3. Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
  4. Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
  5. Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
  6. Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
  7. Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, 110-113 (2006).
  8. Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
  9. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
  10. Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
  11. Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
  12. Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
  13. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  14. Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
  15. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  16. Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
  17. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  18. Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
  19. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
  20. Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
  21. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
  22. Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
  23. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  24. Ding, Y., Xu, G. -. K., Wang, G. -. F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
  25. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  26. Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
  27. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
  28. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  29. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  30. Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
  31. Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
  32. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
  33. Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
  34. Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
  35. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  36. Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
  37. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  38. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
  39. Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
  40. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
  41. Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
  42. Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 177atomik kuvvet mikroskobuelastikiyetstromal h crelerrejenerasyoncanl l kidrar ka rmasu jeti

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır