Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים שיטה להזרקת תאים באמצעות טכנולוגיית הזרקת מים ללא מחט יחד עם המשך של חקירות לאחר הלידה במונחים של כדאיות תאית, התפשטות ומדידות גמישות.

Abstract

בריחת שתן (UI) היא מצב שכיח מאוד המאופיין במחסור בשריר הסוגר בשופכה. ענפי הרפואה הרגנרטיבית, ובמיוחד הטיפול בתאים, הם גישות חדשניות לשיפור ושיקום תפקוד הסוגר בשופכה. למרות שהזרקה של תאים פונקציונליים פעילים מתבצעת באופן שגרתי במסגרות קליניות על ידי מחט ומזרק, לגישות אלה יש חסרונות ומגבלות משמעותיות. בהקשר זה, טכנולוגיית הזרקת מים ללא מחטים (WJ) היא שיטה אפשרית וחדשנית שיכולה להזריק תאים בני קיימא על ידי ציסטוסקופיה מונחית חזותית בסוגר השופכה. במחקר הנוכחי, השתמשנו ב-WJ כדי להעביר תאים סטרומליים שמקורם ברקמת השומן החזירי (pADSCs) לתוך רקמת השופכה הקדבורית, ולאחר מכן חקרנו את ההשפעה של אספקת WJ על תפוקת התאים ועל הכדאיות שלהם. הערכנו גם את התכונות הביו-מכניות (כלומר, גמישות) על ידי מדידות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). הראינו כי מחשבי ה-pADSCs של WJ הופחתו באופן משמעותי בגמישות התאית שלהם. הכדאיות הייתה נמוכה משמעותית בהשוואה לבקרות, אך היא עדיין מעל 80%.

Introduction

בריחת שתן (UI) היא הפרעה נפוצה עם שכיחות של 1.8 - 30.5% באוכלוסיות אירופה1 ומאופיינת בעיקר על ידי תקלה של הסוגר השופכה. מנקודת מבט קלינית, טיפול כירורגי מוצע לעתים קרובות לחולים כאשר טיפולים שמרניים או פיזיותרפיה אינם מצליחים לטפל ולהקל על הסימפטומים המתעוררים.

טיפול תאי לתיקון רגנרטיבי פוטנציאלי של תקלה בקומפלקס הסוגר התגלה כגישה אוונגרדית לטיפול בפתולוגיה של ממשק משתמש 2,3. מטרותיו העיקריות הן להחליף, לתקן ולשחזר את הפונקציונליות הביולוגית של הרקמה הפגועה. במודלים של בעלי חיים עבור ממשק משתמש, השתלת תאי גזע הראתה תוצאות מבטיחות בתוצאות אורודינמיות 2,4,5. תאי גזע מתעוררים כמועמדים תאיים אופטימליים שכן יש להם את היכולת לעבור התחדשות עצמית והתמיינות רב-פוטנטית, ובכך לסייע להתחדשות הרקמה הפגועה6. למרות הפוטנציאל הרגנרטיבי הצפוי, השימוש המעשי בטיפול בתאים נותר מעוכב מכיוון שמסירה זעיר פולשנית של תאים עדיין מתמודדת עם מספר אתגרים הנוגעים לדיוק ההזרקה ולכיסוי המטרה. אף על פי שהגישה הנוכחית המשמשת להעברת תאים היא הזרקה דרך מערכת מזרק מחט7, היא בדרך כלל גורמת לגירעון כולל של תאים בני קיימא, כאשר הכדאיות המדווחת נמוכה עד כדי 1%-31% לאחרההשתלה 8. בנוסף, הודגם כי העברת תאים באמצעות הזרקת מחט משפיעה גם על המיקום, על קצב השמירה, כמו גם על התפלגות התאים המושתלים לתוך הרקמה הממוקדת 9,10,11. גישה ריאלית וחדשנית המתגברת על המגבלה הנ"ל היא אספקת תאים ללא מחט באמצעות טכנולוגיית סילון מים.

טכנולוגיית Waterjet (WJ) מתפתחת כגישה חדשה המאפשרת העברת תפוקה גבוהה של תאים על ידי ציסטוסקופ תחת שליטה חזותית בסוגר השופכה12,13. ה- WJ מאפשר העברת תאים בלחצים שונים (E = אפקטים בסרגל) הנעים בין E5 ל- E8013. בשלב הראשון, (שלב חדירת רקמות) תמיסה איזוטונית מופעלת בלחץ גבוה (כלומר, E60 או E80) על מנת לשחרר את המטריצה החוץ-תאית המקיפה את הרקמה הממוקדת ולפתוח מיקרו-לקונה מקשרת קטנה. בשלב השני (שלב ההזרקה), הלחץ יורד תוך אלפיות השנייה (כלומר, עד E10) על מנת להעביר בעדינות את התאים לתוך הרקמה הממוקדת. בעקבות יישום דו-שלבי זה, התאים אינם נתונים ללחץ נוסף על הרקמה כאשר הם נפלטים, אלא צפים בזרם בלחץ נמוך לתוך אזור מערות מלא בנוזל13. במסגרת מודל ex vivo שבה תאי גזע הוזרקו דרך WJ לתוך רקמת השופכה הקדברית, ניתן היה לשאוף לאחר מכן תאים בני קיימא ולשלוף אותם מהרקמה ולהרחיב עוד יותר במבחנה13. למרות שמחקר שנערך בשנת 2020 על ידי Weber et al. הדגים את ההיתכנות והישימות של WJ לספק קרדיומיוציטים ללא טביעת רגל לתוך שריר הלב14, יש לזכור שטכנולוגיית WJ עדיין נמצאת בשלב אב טיפוס.

הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין ולתייג תאים סטרומליים שמקורם ברקמת שומן חזירי (pADSC) וכיצד להעביר אותם לתוך נוזל לכידה ורקמה קדברית באמצעות טכנולוגיית WJ ומחטי ציסטוסקופיה של ויליאמס (WN). לאחר ההזרקה התאית, מעריכים את החיוניות התאית והגמישות באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). באמצעות הוראות שלב אחר שלב, הפרוטוקול נותן גישה ברורה ותמציתית להשגת נתונים אמינים. פרק הדיון מציג ומתאר את היתרונות, המגבלות והפרספקטיבות העתידיות של הטכניקה. העברת התאים על ידי WJ, כמו גם ניתוחי ההמשך לאחר התרגום המדווחים כאן, מחליפים את הזרקת המחט הסטנדרטית ומספקים מסגרת אספקת תאים מוצקה לריפוי רגנרטיבי של רקמת המטרה. במחקרים האחרונים שלנו סיפקנו ראיות לכך ש-WJ העביר תאים בצורה מדויקת יותר ולפחות בכדאיות דומה בהשוואה לזריקות מחט 15,16.

Protocol

דגימות רקמת השומן החזירי התקבלו מהמכון לכירורגיה ניסויית באוניברסיטת טובינגן. כל ההליכים אושרו על ידי הרשויות המקומיות לרווחת בעלי חיים תחת מספר הניסוי בבעלי חיים CU1/16.

1. בידוד של תאים סטרומליים שמקורם ברקמת השומן החזירי

  1. השתמש ברקמת שומן חזירית המועברת מהמכון לכירורגיה ניסיונית בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל למעבדה.
  2. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי סטרילית מתחת לספסל הסטרילי וכורכים אותה עם שני אזמלים (מס' 10) לרסיסים קטנים ועיסה.
    הערה: ניתן להשתמש במספריים גם על מנת לקבל שברים קטנים. ככל שהשברים קטנים יותר, כך טוב יותר לעיכול הבא.
    1. מעבירים את השברים הקטנים/ערפל לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומדגרים אותו עם 5 מ"ל של תמיסת הומוגנייזר למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר. תמיסת ההומוגנייזר היא PBS עם 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) (תמיסת מלאי: 1% (w/v) BSA ב-PBS) ו-0.1% קולגן מסוג I.
      הערה: הכינו תמיד תמיסת הומוגנייזר טרייה. לשייקר יש תנועת טלטול מעגלית במהירות איטית 25-500 סל"ד.
  3. כדי לעצור את הדגירה, הוסיפו 10 מ"ל של מדיית גדילה [המדיום של הנשר המעובד של Dulbecco - גלוקוז נמוך (DMEM-LG), 2.5% תמיסת מלח נתרן HEPES (1 M), 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין (200 mM), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (10000 U/mL פניצילין; 10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) ו-1% אמפוטומיצין B (250 מיקרוגרם/מ"ל)].
    הערה: ניתן להכין מדיית צמיחה מראש. אנטיביוטיקה ותרופות נגד פטריות נחוצות בהכנת אמצעי הגדילה לתרבית תאים כדי להגן על תאים מפני זיהומים.
  4. דגירה של צינורות הצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לשאוף את השבר עם אדיפוציטים, שהוא קל יותר ולכן שוחה על גבי הנוזל, עם פיפטה 10 מ"ל ולהשליך אותו.
  6. סנן את השבר הסטרומי הנותר דרך מסננת של 100 מיקרומטר עם קרום פוליאתילן טרפתלט (PET) נקי ממתכות כבדות כדי למנוע שברי רקמות שומן ולאחזר רק את תרחיף התא.
  7. צנטריפוגה של תרחיף התא המסונן למשך 7 דקות ב-630 x גרם בטמפרטורת החדר.
  8. בצעו החייאה של כדורי התא ב-2 מ"ל של PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת.
  9. צנטריפוגה שוב את מתלה התא למשך 7 דקות ב 630 x g בטמפרטורת החדר.
  10. לאחר צנטריפוגה והחזרה חוזרת ונשנית של כדורי התא ב-10 מ"ל של מדיית גדילה לכל בקבוק, תאי זרעים בבקבוקי תרבית תאים של 75 ס"מ2 .
    הערה: בהתאם לגודל כדור התא לאחר שלב הכביסה עם PBS, תאי זרעים בבקבוקון אחד עד ארבעה.

2. גידול תאים של תאים סטרומליים שמקורם ברקמת שומן חזירית

  1. תאי קציר ומעבר כאשר הם מגיעים ל-70% מפגש.
  2. לשטוף תאים עם 10 מ"ל של PBS פעמיים ולשאוף PBS לחלוטין.
    הערה: שלב זה נחוץ כדי להסיר את מדיית הצמיחה הנותרת, אשר משלימה 10% FBS. ל- FBS יש מספר מעכבי פרוטאזות אשר יכולים לעכב את תפקוד הטריפסיניזציה הבאה.
  3. הוסף 3 מ"ל של 0.05%-טריפסין-EDTA לכל בקבוקון כדי לנתק את התאים.
  4. אינקובציה של צלוחיות במשך 3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. בדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים מנותקים.
    הערה: לפעמים לוקח קצת יותר זמן לנתק את התאים. במקרה זה, דגירה של צלוחיות למשך 5 דקות לכל היותר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  6. כדי לעצור את תהליך הדגירה והניתוק, הוסף 3 מ"ל של מדיית גדילה.
    הערה: כפי שצוין לעיל, מדיית גדילה משלימה 10% FBS המכילה מעכבי פרוטאזות.
  7. מעבירים את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה למשך 7 דקות ב-630 x גרם בטמפרטורת החדר.
  8. בצעו החייאה של התאים ב-10 מ"ל של מדיית גדילה וספרו אותם באמצעות המוציטומטר.
  9. תאי זרעים עם צפיפות חיסון של 3 x 105 תאים לכל 75 ס"מ2 בקבוקונים.

3. תיוג של תאים עם calcein-AM

הערה: תאים המוזרקים לרקמות קדבוריות מוכתמים בכתם ירוק-פלואורסצנטי חדיר של ממברנה חיה ומחוון כדאיות אטום בממברנה אדומה-פלואורסצנטית כדי לוודא שהתאים המופקים זהים לתאים המוזרקים ולא לשברי הרקמות של השופכה.

  1. לשטוף תאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS.
  2. הוסף 5 מ"ל של תמיסת צבע לכל 75 ס"מ2 צלוחית. תמיסת הצבע מורכבת ממדיית גדילה עם 2 μM של צבע תא חי חדיר של ממברנה ירוקה-פלואורסצנטית ו-4 μM אדום-פלואורסצנטי-ממברנה-אטום-אינדיקטור כדאיות אטום.
  3. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  4. לשאוף ולהשליך את תמיסת הצבע.
  5. לשטוף את התאים שוב פעמיים עם 10 מ"ל של PBS.
  6. הוסיפו מדיית גדילה ותעדו את האות הפלואורסצנטי הירוק והאדום על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
    1. הניחו את הבקבוקון בקוטר 75 ס"מ2 על שולחן המיקרוסקופ, השתמשו במטרה של פי 10, בחרו ללא מסנן פלואורסצנטי וודאו שנתיב האור המועבר פעיל.
      הערה: שלבים אלה מבוצעים כולם באופן ידני במיקרוסקופ.
    2. במקביל לשלב 3.6.1, פתח את התוכנה.
    3. לחץ על לחצן Live מתחת לכרטיסיה איתור כדי לקבל תמונה חיה של התאים בבקבוקון שעל השולחן והתמקד בהם באמצעות כונני ההתאמה הגסים והעדינים.
      הערה: במראה הימנית התמונה החיה תופיע לאחר הפעלת לחצן Live .
    4. בתת-לשונית רכיבי מיקרוסקופ, בחר את המטרה הנכונה (10x).
    5. בכרטיסיית המשנה מצלמה, החל סימן ביקורת עבור חשיפה אוטומטית.
    6. לחץ על הלחצן הצמד כדי לצלם את התמונה הראשונה עם אור משודר.
    7. הוסף את סרגל קנה המידה באמצעות הכרטיסיה גרפיקה בשורת התפריטים ובחירה בסרגל קנה מידה.
    8. שמור את התמונה באמצעות הכרטיסיה קבצים בשורת התפריטים ובחירה באפשרות שמור כ- czi.
    9. עבור תמונות הפלואורסצנציה, שנו את המסנן לזה הספציפי לפלואורסצנציה ירוקה או אדומה ובחרו את נתיב האור המוחזר.
      הערה: שינויים אלה צריכים להיעשות באופן ידני במיקרוסקופ.
    10. לחץ שוב על לחצן Live מתחת לכרטיסיה איתור כדי לקבל תמונה חיה של התאים.
    11. לחץ על הלחצן הצמד כדי לצלם את התמונה השנייה עם פלואורסצנציה ירוקה או אדומה.
    12. הוסף את סרגל קנה המידה באמצעות הכרטיסיה גרפיקה בשורת התפריטים ובחירה בסרגל קנה מידה.
    13. שמור את התמונה באמצעות הכרטיסיה קבצים בשורת התפריטים ובחירה באפשרות שמור כ- czi.
    14. חזור על שלבים 3.6.9 עד 3.6.13 עם ערוץ הפלואורסצנציה האחר.

4. הכינו דגימות רקמת שופכה להזרקות

  1. לנתח את השופכה ואת שלפוחית השתן המחברת מתוך החזיר.
    הערה: דגימות רקמת שופכה מדגימות קדבוריות טריות של נקבות חזירי קרקע בוגרים שימשו לניסויים.
  2. העבירו אותו למעבדה בשקיות על קרח רטוב.
    הערה: יש להשאיר את הדגימות על קרח עד לעיבוד נוסף. לא נוספו תוספים לדגימות.
  3. מניחים את השופכה עם שלפוחית השתן על ספוג, המחקה את האלסטיות של רצפת האגן התחתונה.
    1. השתמש בשלפוחית השתן כדי לקבוע את הכיוון (פרוקסימלי, דיסטלי, הגבי והגחוני) של השופכה. זה אפשרי בשל לוקליזציה של השופכנים ושלוש הרצועות אשר מקבעים את שלפוחית השתן בחלל הבטן והאגן. שלוש הרצועות הן שתי רצועות ה-vesicae lateralia בצידי שלפוחית השתן וה-vesicae medianum, הנובעות מהמשטח הגחוני של שלפוחית השתן (איור 1).
  4. חותכים את השופכה באורך בצד הגב בעזרת קטטר.
  5. הזריקו את התאים לשופכה הפתוחה כמתואר בפרקים הבאים.

5. זריקות של תאים באמצעות מחט וויליאמס בנוזלים ובדגימות רקמות

  1. תאי קציר כמתואר בשלב 2.
  2. בניגוד לשלב 2.9, התאימו את צפיפות התאים להזרקות ל-2.4 x 106 תאים למ"ל.
    הערה: עבור הזרקות לדגימות רקמה, סמן את התאים בתא חי ירוק-פלואורסצנטי הניתן לחדיר ממברנה.
  3. לשאוף את תרחיף התא עם מזרק ולמרוח עליו את מחט ההזרקה הציסטוסקופית של ויליאמס (WN).
  4. או להחזיק את המחט מעט מעל 2 מ"ל של מדיית גדילה בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל או להכניס את המחט לתוך רקמת השופכה שנפתחה. בשני המקרים להזריק 250 μL של תאים באופן ידני.
    הערה: תאים המוזרקים לשופכה הקדבורית יוצרים כיפת הזרקה.
  5. אסוף תאים שהוזרקו למדיה ישירות על ידי צנטריפוגה למשך 7 דקות ב-630 x גרם בטמפרטורת החדר.
  6. עבור תאים המוזרקים לשופכה הקדברית, שאפו אותם מתוך כיפת ההזרקה עם מחט 18G המופעלת על מזרק.
  7. מעבירים את התאים המוזרקים והשואפים לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה למשך 7 דקות בטמפרטורה של 630 x גרם בטמפרטורת החדר בהשוואה לתאים המוזרקים למדיה.
  8. לאחר צנטריפוגה, החייאת התאים ב -4 מ"ל של מדיית גדילה בשני המקרים.
  9. קבע את תפוקת התאים ואת הכדאיות בעזרת אי הכללת הצבע הכחול של טריפאן באמצעות המוציטומטר.
    1. יש לערבב היטב 20 μL של תרחיף התא עם 20 μL של טריפאן כחול.
    2. מלא 10 μL של תערובת זו בכל תא של המוציטומטר.
      הערה: שני התאים מתמלאים ונספרים כדי לקבל אופטימיזציה סטטיסטית על ידי הכפלת הדגימה.
    3. תחת מיקרוסקופ, ספרו תאים בכל ארבעת הריבועים הפינתיים.
      הערה: ספירת תאים בוהקים בלבן (לא מוכתמים) כתאים בני קיימא, בעוד שתאים בוהקים בכחול (מוכתמים) נספרים כתאים מתים.
    4. כדי לחשב את מספר התא לכל מ"ל, חשב את הממוצע של שני התאים, חלק מספר זה בשניים והכפל אותו ב- 104.

6. הזרקות של תאים באמצעות Waterjet בנוזלים ובדגימות רקמות

  1. תאי קציר כמתואר בשלב 2.
  2. בניגוד לשלבים 2.9 ו-5.2, התאימו את צפיפות התאים להזרקות ל-6 x 106 תאים למ"ל.
    הערה: עבור הזרקות לדגימות רקמה, השתמש בתאים המסומנים בתא חי חדיר בעל קרום ירוק-פלואורסצנטי.
  3. מלא את מתלי התא ליחידת המינון של התקן WJ.
  4. או להחזיק את זרבובית ההזרקה מעט מעל 2 מ"ל של מדיית גדילה בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל או מעט מעל רקמת השופכה שנפתחה.
  5. בשני המקרים להזריק 100 μL של תאים על ידי המכשיר באמצעות לחץ גבוה לחדירת רקמות ואחריו שלב בלחץ נמוך להזרקת תאים. השתמש בהגדרות הלחץ E60-10.
    הערה: תאים המוזרקים לשופכה הקדבורית יוצרים כיפת הזרקה.
  6. אסוף תאים שהוזרקו למדיה ישירות על ידי צנטריפוגה למשך 7 דקות ב-630 x גרם בטמפרטורת החדר.
  7. עבור תאים המוזרקים לשופכה הקדברית, שאפו אותם מתוך כיפת ההזרקה עם מחט 18G המופעלת על מזרק.
  8. מעבירים את התאים המוזרקים והשואפים לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה למשך 7 דקות בטמפרטורה של 630 x גרם בטמפרטורת החדר בהשוואה לתאים המוזרקים למדיה.
  9. לאחר צנטריפוגה, resuspend תאים ב 4 מ"ל של מדיית גדילה בשני המקרים.
  10. קבע את תפוקת התאים ואת יכולת הכדאיות בעזרת אי הכללת הצבע הכחול של טריפאן באמצעות המוציטומטר כמתואר בפירוט ב-5.10.

7. הערכה ביומכנית של גמישות תאית על ידי מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM)

  1. הכנת דוגמאות
    הערה: התאים המוחזרים לאחר ההזרקה כפופים כעת לניתוחים נוספים על ידי AFM. בנוסף, תאים שלא הוזרקו משמשים כבקרות.
    1. תאי זרעים במנות תרביות רקמה עם צפיפות של 5 x 105 תאים לכל מנה.
      הערה: זרע צלחת תרבית רקמה אחת לכל מצב. התנאים הם בקרות, ADSCs המוזרקים על ידי WJ או WN לתוך מדיה ו- ADSCs המוזרקים על ידי WJ או WN לתוך רקמה cadavery.
    2. הדגירה של תאים במנות תרבית רקמה במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: כדי למנוע שונות עקב תאים בשלב G1 ובמהלך מיטוזה, ביצענו מדידות AFM 3 שעות לאחר שלב זריעת התא.
    3. ממש לפני המדידה עם ה-AFM החליפו את מדיית הגדילה ב-3 מ"ל של מדיית L-15 של ליבוביץ' ללא L-גלוטמין.
    4. מניחים את צלחת תרבית הרקמה במחזיק הדגימה של מכשיר ה-AFM ומפעילים את תנור החימום של פטרי שנקבע על 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת AFM וכיול קנטילבר
    1. השתמש בבלוק זכוכית שצוין למדידות בנוזלים והתאם אותו למחזיק ה- AFM.
      הערה: המשטח העליון של בלוק הזכוכית חייב להיות ישר ובמקביל למחזיק ה- AFM.
    2. בזהירות להניח את הקנטיל על פני השטח של בלוק הזכוכית. קצה A חייב להיות מונח מעל המישור האופטי המלוטש.
      הערה: אל תגרד את המשטח האופטי המלוטש של בלוק הזכוכית מכיוון ששריטות עלולות להוביל להפרעות במדידות. קצה A חייב לבלוט מעל המישור האופטי המלוטש מכיוון שאחרת השתקפות הלייזר של ה- AFM לפוטודקטור אינה אפשרית.
    3. כדי לייצב את הקנטילבר על בלוק הזכוכית, הוסיפו קפיץ מתכתי בעזרת פינצטה.
    4. כאשר הכנף קבועה על בלוק הזכוכית מניחים את הבלוק על ראש ה-AFM ונועלים את מנגנון הנעילה המשולב.
    5. הר את ראש ה- AFM במכשיר ה- AFM.
      הערה: הקפיץ חייב לפנות לצד שמאל כדי להיות ממוקם כראוי. אם זה לא המקרה, תקן את המיקום של בלוק הזכוכית והתאם שוב את ראש ה- AFM.
    6. אתחל את הגדרת התוכנה ופתח את התוכנה יחד עם חלון יישור הלייזר והגדרות פרמטר הגישה. בנוסף, הפעל את מנוע הסטפר, את אור הלייזר ואת מצלמת ה- CCD.
    7. זהה את קצה הקנטילבר A באמצעות מצלמת CCD.
    8. הנמיכו את הקנטילבר עד שהוא טבול במלואו במדיום. השתמש בפונקציה המוטורית של stepper כדי להגיע למטרה זו.
    9. לאחר שהקנטילבר מכוסה במלואו על ידי בינוני, הלייזר מיושר על גבי הקנטילבר באמצעות ברגי הכוונון. הקרן המוחזרת חייבת ליפול על מרכז הפוטודטקטור וסכום האותות חייב להיות 1 V ומעלה. הסטיות הצדדיות והאנכיות צריכות להיות קרובות ל-0.
      הערה: אם מגיעים למרכז ניתן לנטר זאת בפונקציית יישור הלייזר וכן בערכי האות. אם ערכי האות אינם נכונים, יש צורך בהתאמות נוספות.
    10. הפעל כעת את גישת הסורק עם פרמטרי הגישה (טבלה 1).
    11. חזור על הפחית ב-100 מיקרומטר ברגע שהיא מגיעה לתחתית על ידי לחיצה על כפתור Retract .
      הערה: ודא שאף תא לא מחובר בשדה זה אם הגישה נעשתה מכיוון שהדבר היה מזייף את הכיול.
    12. הגדר את הפרמטרים Run בהתאם למפרטים הבאים: Setpoint 1 V, אורך משיכה 90 μm, מהירות: 5 μm/s, קצב דגימה: 2000 Hz וכמצב השהיה: כוח קבוע.
    13. התחל את מדידת עקומת מרחק כוח הכיול על-ידי לחיצה על הלחצן הפעל.
      הערה: על-ידי לחיצה על לחצן הפעל בתוכנה מתקבלת עקומת מרחק כוח.
    14. בחר את אזור ההתאמה הליניארית של העקומה הנסוגה בתוכנה על עקומת כוח-מרחק הכיול שהתקבלה. חשב את המדידה הקבועה של הקפיץ על ידי התוכנה.
    15. כיול הקנטילבר בהתאם לפרמטרים ולשלבים המדויקים כפי שתוארו על ידי Danalache et al.17.
  3. מדידת האלסטיות של תאים בודדים
    1. לזהות באופן חזותי תא ולהתמקד בו. מקם את עכבר המחשב במרכז התא. כדי לשפר את דיוק המדידות, מקם את קצה ה-AFM ישירות מעל גרעין התא.
      הערה: עכבר המחשב משמש כסמן חזותי לזיהוי אתר היעד של ההזחה.
    2. כעת התמקדו בקנטילבר והזיזו אותו על עכבר המחשב.
    3. התחל את המדידה עם הפעלה עם הפרמטרים המופיעים בטבלה 2.
      הערה: נעשה שימוש בפרמטר הנקודה המוגדרת המתקבלת על ידי כיול הקנטילבר. יתר על כן, תא אחד נמדד שלוש פעמים. מדוד לפחות 50 תאים.
  4. עיבוד נתונים
    1. עיבד את הנתונים בהתאם לשלבים ופרמטרים מדויקים כפי שתואר קודם לכן על ידי Danalache17.
    2. שמור וייצא את הקובץ.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. פתח את התוכנה הסטטיסטית.
  2. בחר את הבחירה של ערכת נתונים חדשה.
    הערה: שני קבצים נפתחים. האחד הוא "DataSet" והשני הוא קובץ "פלט".
  3. בחר את קובץ DataSet ופתח את הכרטיסיה תצוגה משתנה .
  4. הכנס את המשתנים המספריים להזרקת האתר (לכידת נוזל או רקמה קדבורית), קטגוריה (בקרה, הזרקת WJ, הזרקת WN) וגמישות.
  5. הכנס את נתוני האלסטיות הנמדדים עם הזרקת האתר ומספר הקטגוריה המתאימים שלהם בכרטיסיה תצוגת נתונים .
  6. נתח את הנתונים על-ידי בחירה בכרטיסיה שורת תפריטים נתח | סטטיסטיקה תיאורית ובחר ניתוח נתונים אקספלורטוריים.
  7. כמשתנה התלוי, בחר גמישות ורשימת גורמים בחר קטגוריה.
    הערה: התוצאות מוצגות בקובץ "פלט" כולל תרשים תיבה המשמש למקטע התוצאות.
  8. כדי לבצע בדיקה סטטיסטית, בחר את הדגימות הבלתי תלויות בתוך הבדיקה הלא-פרמטרית תחת הכרטיסיה ניתוח בשורת התפריטים.
  9. בקובץ החדש שנפתח שמור את ההגדרות בכרטיסייה מטרה והגדרות.
  10. פתח את שדות הכרטיסייה ובחר גמישות כשדות בדיקה וקטגוריה כקבוצות.
  11. לחץ על הפעל.
    הערה: התוצאות מוצגות בקובץ "פלט". עבור ניתוחים אלה מבוצעת בדיקת מאן-או-וויטני.
  12. כלול את התוצאה של הבדיקה הלא-פאראמטרית בחלקת התיבה של ניתוח הנתונים החקרניים.
  13. שמור את הקבצים על-ידי בחירת קובץ בשורת התפריטים ובחירה באפשרות שמור.

תוצאות

לאחר העברת תאים באמצעות שתי הגישות, הכדאיות של תאים שהועברו דרך ה-WN (97.2 ± 2%, n=10, p<0.002) הייתה גבוהה יותר בהשוואה לזריקות של WJ באמצעות הגדרות E60-10 (85.9 ± 0.16%, n=12) (איור 2). תוצאות הערכה ביומכנית הראו כי: זריקות WN של תאים בנוזל לכידה לא הראו הבדל משמעותי ביחס למודולי האלסטי (EM; 0.992 kPa) בהש?...

Discussion

במחקר הנוכחי, הדגמנו והצגנו גישה שלב אחר שלב להליך מסירת תאי WJ והשתמשנו בהמשך של מחקרים כמותיים כדי להעריך את ההשפעה של אספקת WJ על מאפיינים תאיים: כדאיות תאית ותכונות ביומכניות (כלומר, EM). לאחר הזרקת WJ, 85.9% מהתאים שנקטפו היו בני קיימא. במונחים של הזרקת WN, 97.2% מהתאים שמרו על הכדאיות שלהם לאחר הה...

Disclosures

למחברים J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. אין מה לחשוף. המחברים W.L. ו- M.D.E. הם עובדים של ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen, המפיק של ERBEJet2 ואב הטיפוס של WJ שהועסק במחקר זה.

Acknowledgements

אנו מודים למחברים השותפים שלנו מהפרסומים המקוריים על עזרתם ותמיכתם.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL centrifuge tubeGreiner BioOne227261
1 mL BD Luer-LokTM SyringeBD Plastik Incn.a.
100 µm cell sieveGreiner BioOne542000
15 mL centrifuge tubeGreiner BioOne188271
75 cm2 tissue culture flaskCorning Incorporated353136
AFM head(CellHesion 200) JPKJPK00518
AFM processing softwareBrukerJPK00518
AFM softwareBrukerJPK00518
AFM system Cell Hesion 200BrukerJPK00518
All-In-One-Al cantileverBudget SensorsAIO-10tip A, Conatct Mode, Shape: Beam
Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m)
Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz)
Length: 500 µm (490 - 510 µm)
Width: 30 µm (35 - 45 µm)
Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm)
Amphotericin B solutionSigmaA2942250 µg/ml
Atomic Force Microscope (AFM)CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, GermanyJPK00518
BD Microlance 3 18GBD304622
bovine serum albuminGibcoA10008-01
Cantilever All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, BulgariaAIO-TL-10tip A, k ¼ 0.2 N/m
C-chip disposable hemocytometerNanoEnTek631-1098
centrifuge: Rotina 420RHettich Zentrifugen
Collagenase, Type I, powderGibco17100-017
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucoseSigmaD5546
Feather disposable scalpel (No. 10)Feather02.001.30.010
fetal bovine serum (FBS)SigmaF7524
HEPES sodium salt solution (1 M)SigmaH3662
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, GermanyL201306_03
laboratory bagsBrand759705
Leibovitz's L-15 medium without l-glutamineMerckF1315
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)F1315
L-glutamineLonzaBE 17-605C1200 mM
LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity KitInvitrogen by Thermo Fisher ScientificL3224Calcein AM and EthD-1 are used from this kit.
Microscope software: Zen 2.6Zeiss
Microscope: AxioVertA.1Zeiss
Nelaton-Catheter femaleBicakcilar19512051
Penicillin-StreptomycinGibco15140-12210000 U/ml Penicillin
10000 µg/ml Streptomycin
Petri dish heater associated with AFMBrukerT-05-0117
Petri dish heater associated with AFMJPK Instruments AG, Berlin, GermanyT-05-0117
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010-015
Statistical Software: SPSS Statistics 22IBM
Sterile Petri dish - CellStarGreiner BioOne664160
Tissue culture dishesTPP AGTPP93040
Tissue culture dishesTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, SwitzerlandTPP93040
Trypan Blue 0.4%
0.85% NaCl		Lonza17-942E
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
Waterjet: ERBEJET2 deviceErbe Elektromedizin GmbH
Williams Cystoscopic Injection NeedleCook MedicalG1422023G, 5.0 Fr, 35 cm

References

  1. Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
  2. Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
  3. Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
  4. Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
  5. Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
  6. Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
  7. Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, 110-113 (2006).
  8. Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
  9. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
  10. Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
  11. Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
  12. Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
  13. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  14. Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
  15. Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
  16. Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
  17. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  18. Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
  19. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
  20. Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
  21. Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
  22. Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
  23. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  24. Ding, Y., Xu, G. -. K., Wang, G. -. F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
  25. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  26. Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
  27. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
  28. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  29. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  30. Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
  31. Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
  32. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
  33. Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
  34. Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
  35. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  36. Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
  37. Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
  38. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
  39. Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
  40. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
  41. Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
  42. Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved