JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى عزل mRNAs الريبوسومية المترجمة الخاصة بنوع الخلية باستخدام نموذج الماوس NuTRAP.

Abstract

يشكل عدم التجانس الخلوي تحديات لفهم وظيفة الأنسجة المعقدة على مستوى النسخ. يؤدي استخدام الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية إلى تجنب المزالق المحتملة الناجمة عن عدم تجانس الأنسجة ويطلق العنان لتحليل النسخ القوي. يوضح البروتوكول الموصوف هنا كيفية استخدام طريقة تنقية تقارب الريبوسوم المترجم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من كمية صغيرة من الخلايا المعبرة عن EGFP في نسيج معقد دون فرز الخلايا. هذا البروتوكول مناسب لعزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية باستخدام نموذج الماوس NuTRAP المتاح مؤخرا ويمكن استخدامه أيضا لعزل الحمض النووي الريبي عن أي خلايا تعبر عن EGFP.

Introduction

مكنت النهج عالية الإنتاجية ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) والمصفوفات الدقيقة ، من استجواب ملفات تعريف التعبير الجيني على مستوى الجينوم. بالنسبة للأنسجة المعقدة مثل القلب والدماغ والخصية ، ستوفر البيانات الخاصة بنوع الخلية مزيدا من التفاصيل التي تقارن استخدام الحمض النووي الريبي من الأنسجة بأكملها1،2،3. للتغلب على تأثير عدم التجانس الخلوي ، تم تطوير طريقة ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) منذ أوائل عام 20104. TRAP قادر على عزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من أنواع خلايا معينة دون تفكك الأنسجة. تم استخدام هذه الطريقة لتحليل translatome (mRNAs التي يتم تجنيدها إلى الريبوسوم للترجمة) في كائنات مختلفة ، بما في ذلك استهداف مجموعة نادرة للغاية من الخلايا العضلية في أجنة ذبابة الفاكهة5 ، ودراسة الخلايا الجذرية المختلفة في نموذج النبات Arabidopsis thaliana6 ، وإجراء تحليل النسخ للخلايا البطانية في الثدييات7.

يتطلب TRAP تعديلا وراثيا لتمييز الريبوسوم لكائن نموذجي. طور إيفان روزن وزملاؤه مؤخرا نموذجا للفأر يسمى وضع العلامات النووية وترجمة الماوس8 لتنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP) ، والذي كان متاحا من خلال مختبر جاكسون منذ عام 2017. من خلال العبور مع خط الماوس Cre ، يمكن للباحثين استخدام نموذج الماوس NuTRAP هذا لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم ونوى الخلايا من الخلايا المعبرة عن Cre دون فرز الخلايا. في الخلايا المعبرة عن Cre التي تحمل أيضا أليل NuTRAP ، يسمح الريبوسوم الموسوم EGFP / L10a بعزل ترجمة mRNAs باستخدام مقايسات القائمة المنسدلة للتقارب. في نفس الخلية ، يسمح الغشاء النووي الموسوم بببتيد التعرف على البيوتين (BLRP) ، والذي يكون أيضا إيجابيا ل mCherry ، بالعزل النووي باستخدام التنقية القائمة على التقارب أو التألق. قام فريق البحث نفسه أيضا بإنشاء خط فأر مشابه يتم فيه تسمية الغشاء النووي فقط ب mCherry بدون البيوتين8. يتيح هذان الخطان المعدلان وراثيا للفأر الوصول إلى توصيف الملامح الجينومية والنسخ المقترنة لأنواع معينة من الخلايا محل الاهتمام.

يلعب مسار إشارات القنفذ (Hh) دورا مهما في نمو الأنسجة9. يعمل GLI1 ، وهو عضو في عائلة GLI ، كمنشط نسخ ويتوسط إشارات Hh. يمكن العثور على خلايا Gli1 + في العديد من الأعضاء التي تفرز الهرمونات ، بما في ذلك الغدة الكظرية والخصية. لعزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من خلايا Gli1 + باستخدام نموذج الماوس NuTRAP ، تم تهجين الفئران Gli1-CreERT2 مع الفئران NuTRAP. كما تم تهجين فئران Shh-CreERT2 مع فئران NuTRAP بهدف عزل خلايا تعبير القنفذ الصوتي (Shh). يوضح البروتوكول التالي كيفية استخدام Gli1-CreERT2 ؛ فئران NuTRAP لعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم من خلايا Gli1 + في خصيتي الفئران البالغة.

Protocol

اتبعت جميع التجارب التي أجريت على الحيوانات البروتوكولات المعتمدة من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في جامعة أوبورن.

ملاحظة: يستخدم البروتوكول التالي خصية واحدة (حوالي 100 ملغ) في P28 من Gli1-CreERT2 ؛ فئران NuTRAP (Mus musculus). قد تحتاج أحجام الكواشف إلى التعديل بناء على أنواع العينات وعدد الأنسجة.

1. جمع الأنسجة

  1. القتل الرحيم للفئران باستخدام غرفة CO2 ، وتطهير سطح البطن مع 70 ٪ من الإيثانول.
  2. افتح أسفل البطن بالمقص وأزل الخصيتين. استخدم النيتروجين السائل (LN2) لتجميد الخصيتين على الفور.
  3. قم بتخزين العينات في مرحلة بخار LN2 حتى الاستخدام.

2. إعداد الكواشف والخرز

  1. تحضير محلول مخزون التجانس: أضف 50 mM Tris (pH 7.4) ، 12 mM MgCl2 ، 100 mM KCl ، 1٪ NP-40 ، و 1 mg / mL heparin. قم بتخزين المحلول في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام (حتى 1 شهر).
  2. قم بإعداد مخزن عمل التجانس من محلول المخزون (الخطوة 2.1) طازجا قبل الاستخدام: أضف DTT (التركيز النهائي: 1 mM) ، سيكلوهيكسيميد (التركيز النهائي: 100 ميكروغرام / مل) ، الريبونوكلياز المؤتلف (التركيز النهائي: 200 وحدة / مل) ، وكوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني (التركيز النهائي: 1x) إلى محلول مخزون التجانس لجعل الكمية المطلوبة من مخزن عمل التجانس. قم بتخزين المخزن المؤقت الطازج على الثلج حتى الاستخدام.
  3. تحضير مخازن الغسيل قليلة الملح وعالية الملح:
    1. لتحضير محلول غسيل قليل الملح ، امزج 50 مللي مول تريس (درجة حموضة 7.4) ، 12 مللي مول MgCl2 ، 100 مللي مول KCl ، و 1٪ NP-40. أضف DTT (التركيز النهائي: 1 مليمول) وسيكلوهكسيميد (التركيز النهائي: 100 ميكروغرام / مل) قبل الاستخدام.
    2. لتحضير محلول غسيل عالي الملح ، امزج 50 مللي مول تريس (درجة الحموضة 7.4) ، 12 مللي مول MgCl2 ، 300 مللي متر KCl ، 1٪ NP-40. أضف DTT (التركيز النهائي: 2 مللي مول) و Cycloheximide (التركيز النهائي: 100 ميكروغرام / مل) قبل الاستخدام.
  4. تحضير حبات البروتين G (جدول المواد):
    1. ستحتاج كل عينة إلى 50 ميكرولتر من حبات البروتين G. ضع الكمية المطلوبة من الخرز في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وافصل الخرز عن المحلول باستخدام رف مغناطيسي عن طريق ترك الأنبوب على الرف لمدة 30-60 ثانية.
    2. إزالة الطافت عن طريق سحب العينات. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام 1 مل من محلول الغسيل المثلج منخفض الملح في كل مرة.

3. تحلل الأنسجة والتجانس

  1. أضف 2 مل من محلول عمل التجانس المثلج البارد (محضر حديثا من الخطوة 2.2) إلى مجموعة مطحنة الأنسجة الزجاجية. ضع العينة المجمدة بسرعة في المطحنة وقم بتجانس الأنسجة ب 30 ضربة على الجليد باستخدام مدقة فضفاضة.
  2. انقل التجانس إلى أنبوب دائري القاع سعة 2 مل وأجهزة طرد مركزي عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 2 مل. حفظ 100 ميكرولتر إلى أنبوب 1.5 مل ك "إدخال".
  4. احتضان المادة الطافية في أنبوب سعة 2 مل مع الجسم المضاد ل GFP (5 ميكروغرام / مل ؛ 1: 400) عند 4 درجات مئوية على دوار من طرف إلى طرف (24 دورة في الدقيقة) طوال الليل.

4. الترسيب المناعي

  1. انقل خليط التجانس / الأجسام المضادة إلى أنبوب جديد مستدير القاع سعة 2 مل يحتوي على حبات البروتين G المغسولة من الخطوة 2.4. احتضان عند 4 درجات مئوية على دوار من طرف إلى طرف (24 دورة في الدقيقة) لمدة 2 ساعة.
  2. افصل الخرزات المغناطيسية عن المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي. احفظ الطافت ك "الكسر السالب". يحتوي الكسر السالب على (1) RNAs في الخلايا السالبة EGFP و (2) RNAs في الخلايا الإيجابية EGFP غير المرتبطة بالريبوسومات.
  3. أضف 1 مل من محلول الغسيل عالي الملح إلى الخرز وقم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لغسل الخرز. ضع الأنبوب في رف مغناطيسي.
  4. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل. كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين. تحتوي الخرزات الآن على مركب حبات الريبوسوم والحمض النووي الريبي من الخلايا الإيجابية EGFP.

5. استخراج الحمض النووي الريبي

ملاحظة: الخطوات التالية مقتبسة من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي (جدول المواد). تعامل مع كل جزء (أي المدخلات والإيجابية والسلبية) كعينة مستقلة واعزل الحمض النووي الريبي بشكل مستقل.

  1. احتضان الخرز من الخطوة 4.4 مع 50 ميكرولتر من محلول الاستخراج (من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي) في خلاط حراري (42 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة لتحرير الحمض النووي الريبي من الخرز.
  2. افصل الخرز برف مغناطيسي ، وانقل المادة الطافية التي تحتوي على مركب الخرز والريبوسوم والحمض النووي الريبي إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
  3. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 3000 × جم لمدة 2 دقيقة ، ثم ماصة الطافي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. يحتوي هذا الأنبوب على "الكسر الموجب" لخطوة TRAP.
    ملاحظة: بالنسبة للمدخلات والكسور السالبة ، استخرج الحمض النووي الريبي من 25 ميكرولتر من العينات باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للاستخراج. احتضان في خلاط حراري (42 درجة مئوية ، 500 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بتهيئة عمود تنقية الحمض النووي الريبي مسبقا: ماصة 250 ميكرولتر من التكييف المؤقت على عمود التنقية. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). جهاز طرد مركزي للعمود عند 16000 × جم لمدة 1 دقيقة.
  5. حجم ماصة متساوي من 70٪ EtOH في الطاف من الخطوة 5.3 (حوالي 50 ميكرولتر من 70٪ EtOH للكسر الموجب و 1 مل من 70٪ EtOH للمدخلات والكسور السالبة). تخلط جيدا عن طريق سحب لأعلى ولأسفل.
  6. ماصة الخليط في العمود من الخطوة 5.4.
  7. قم بالطرد المركزي للعمود عند 100 × جم لمدة 2 دقيقة للسماح بربط الحمض النووي الريبي بالغشاء الموجود في العمود ، ثم استمر في الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 30 ثانية على الفور. تخلص من التدفق من خلال.
    ملاحظة: بالنسبة للمدخلات والكسور السالبة ، أضف 250 ميكرولتر من الخليط إلى العمود في كل مرة. كرر الخطوتين 5.6 و 5.7 حتى يتم استخدام جميع المخاليط.
  8. ماصة 100 ميكرولتر من Wash Buffer 1 (W1) في العمود وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 8000 × جم لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق من خلال.
  9. ماصة 75 ميكرولتر من محلول DNase تمتزج مباشرة في غشاء عمود التنقية. احتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
  10. ماصة 40 ميكرولتر من W1 في العمود وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة 30 ثانية. تخلص من التدفق من خلال.
  11. ماصة 100 ميكرولتر من Wash Buffer 2 (W2) في العمود وأجهزة الطرد المركزي عند 8000 × جم لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق من خلال.
  12. ماصة 100 ميكرولتر من W2 في العمود وأجهزة الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة دقيقتين. تخلص من التدفق من خلال. أعد جهاز الطرد المركزي لنفس العمود عند 16000 × جم لمدة 1 دقيقة لإزالة جميع آثار المخزن المؤقت للغسيل قبل خطوة الشطف.
  13. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل.
  14. ماصة 12 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase مباشرة على غشاء عمود التنقية. يجب ألا يلمس طرف الماصة الغشاء. احتضان في RT لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 1 دقيقة. ثم استمر في الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 1 دقيقة لتهدئة الحمض النووي الريبي.

6. تركيز الحمض النووي الريبي وجودته

  1. استخدم محلل حيوي لتقييم جودة وكمية الحمض النووي الريبيالمستخرج 10.

7. التخزين ومزيد من التحليل

  1. قم بتخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية (حتى 1 سنة) حتى مزيد من التحليل (على سبيل المثال ، microararray ، PCR الكمي (qPCR) ، و RNA-seq ، إلخ).
    ملاحظة: للحصول على تفاصيل تحليل qPCR ، بما في ذلك تخليق cDNA ، راجع Lyu et al.11. يتم سرد الاشعال ل qPCR في جدول المواد.

النتائج

تم عبور الماوس Gli1-CreERT2 (رقم مخزون مختبر جاكسون: 007913) لأول مرة باستخدام فأر مراسل NuTRAP (رقم مخزون مختبر جاكسون: 029899) لتوليد فئران مزدوجة التحول. تم حقن الفئران التي تحمل أليلات الجينات المعدلة وراثيا (أي Gli1-CreERT2 و NuTRAP) بعقار تاموكسيفين مرة واحدة يوميا ، كل يومين ، لثلاث...

Discussion

يمكن أن تخفف فائدة تحليل نسخ الأنسجة الكاملة ، خاصة عند دراسة الأنسجة غير المتجانسة المعقدة. تصبح كيفية الحصول على الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية حاجة ملحة لإطلاق العنان لتقنية RNA-seq القوية. عادة ما يعتمد عزل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية على جمع نوع معين من الخلايا باستخدام...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا بواسطة NIH R00HD082686. نشكر زمالة الأبحاث الصيفية لجمعية الغدد الصماء إلى H.S.Z. كما نشكر الدكتور يوان كانغ على تربية مستعمرة الفئران والحفاظ عليها.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ActbeurofinsqPCR primersATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
BioanalyzerAgilent2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMillipore11836170001
cycloheximideMillipore239764-100MG
Cyp11a1eurofinsqPCR primersCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT, DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
DynaMag-2 magnetThermo Fisher Scientific12321D
Falcon tubes 15 mLVWR89039-666
GFP antibodyAbcamab290
Glass grinder setDWK Life Sciences357542
heparinBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
Hsd3beurofinsqPCR primersGACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
Microcentrifuge tubes 2 mLThermo Fisher Scientific02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarraysThermo Fisher ScientificMicroarray service
NP-40Millipore492018-50 Ml
oligo (dT)20Invitrogen18418020
PicoPure RNA Isolation KitThermo Fisher ScientificKIT0204
Protein G DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
RNase-free watergrowcellsNUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease InhibitorThermo Fisher Scientific10777019
Sox9eurofinsqPCR primersTGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptaseInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155
Sycp3eurofinsqPCR primersGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
TrisAlfa AesarJ62848

References

  1. Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
  2. Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
  3. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  4. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  5. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
  6. Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
  7. Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
  8. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  9. Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
  10. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
  11. Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  14. Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
  15. Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
  16. Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
  17. Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
  18. Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  19. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  20. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
  21. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
  22. Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
  23. Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178 EGFP Gli1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved