Isolare RNA specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare

Riepilogo

Questo protocollo mira a isolare mRNA ribosomiali traslatori specifici per tipo cellulare utilizzando il modello murino NuTRAP.

Abstract

L'eterogeneità cellulare pone sfide alla comprensione della funzione dei tessuti complessi a livello di trascrittoma. L'uso di RNA specifici del tipo di cellula evita potenziali insidie causate dall'eterogeneità dei tessuti e scatena la potente analisi del trascrittoma. Il protocollo qui descritto dimostra come utilizzare il metodo TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) per isolare gli RNA legati al ribosoma da una piccola quantità di cellule che esprimono EGFP in un tessuto complesso senza selezione cellulare. Questo protocollo è adatto per isolare RNA specifici del tipo di cellula utilizzando il modello murino NuTRAP recentemente disponibile e potrebbe anche essere utilizzato per isolare gli RNA da qualsiasi cellula che esprime EGFP.

Introduzione

Gli approcci ad alto rendimento, tra cui il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) e il microarray, hanno reso possibile interrogare i profili di espressione genica a livello dell'intero genoma. Per tessuti complessi come cuore, cervello e testicolo, i dati specifici del tipo di cellula forniranno maggiori dettagli confrontando l'uso di RNA dall'intero tessuto ^1,2,3. Per superare l'impatto dell'eterogeneità cellulare, il metodo Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) è stato sviluppato fin dai primi anni 2010⁴. TRAP è in grado di isolare RNA legati al ribosoma da specifici tipi di cellule senza dissociazione tissutale. Questo metodo è stato utilizzato per l'analisi del translatoma (mRNA che vengono reclutati nel ribosoma per la traduzione) in diversi organismi, incluso il targeting di una popolazione estremamente rara di cellule muscolari negli embrioni di Drosophila⁵, lo studio di diverse cellule radicali nella pianta modello Arabidopsis thaliana⁶ e l'esecuzione dell'analisi del trascrittoma delle cellule endoteliali nei mammiferi⁷.

La TRAP richiede una modificazione genetica per marcare il ribosoma di un organismo modello. Evan Rosen e colleghi hanno recentemente sviluppato un modello murino chiamato Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse⁸, che è disponibile attraverso il Jackson Laboratory dal 2017. Incrociando con una linea murina Cre, i ricercatori possono utilizzare questo modello murino NuTRAP per isolare gli RNA legati al ribosoma e i nuclei cellulari dalle cellule che esprimono Cre senza ordinamento cellulare. Nelle cellule che esprimono Cre, che trasportano anche l'allele NuTRAP , il ribosoma marcato EGFP/L10a consente l'isolamento degli mRNA traduttori mediante saggi di pulldown di affinità. Nella stessa cellula, la membrana nucleare marcata con peptide di riconoscimento della biotina ligasi (BLRP), che è anche mCherry positiva, consente l'isolamento nucleare utilizzando la purificazione basata sull'affinità o sulla fluorescenza. Lo stesso team di ricerca ha anche generato una linea di topi simile in cui la membrana nucleare è etichettata solo con mCherry senza biotina⁸. Queste due linee di topi geneticamente modificati danno accesso alla caratterizzazione di profili epigenomici e trascrittomici accoppiati di specifici tipi di cellule in interesse.

La via di segnalazione del riccio (Hh) svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo dei tessuti⁹. GLI1, un membro della famiglia GLI, agisce come attivatore trascrizionale e media la segnalazione Hh. Le cellule Gli1⁺ possono essere trovate in molti organi secernenti ormoni, tra cui la ghiandola surrenale e il testicolo. Per isolare DNA e RNA specifici del tipo di cellula dalle cellule Gli1⁺ utilizzando il modello murino NuTRAP, i topi Gli1-CreER^T2 sono stati incrociati con i topi NuTRAP. I topi Shh-CreER^T2 sono stati anche incrociati con i topi NuTRAP per isolare le cellule che esprimono il riccio sonico (Shh). Il seguente protocollo mostra come utilizzare Gli1-CreER^T2; Topi NuTRAP per isolare gli RNA legati al ribosoma dalle cellule Gli1⁺ nei testicoli di topo adulto.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti hanno seguito i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) dell'Università di Auburn.

NOTA: Il seguente protocollo utilizza un testicolo (circa 100 mg) a P28 da Gli1-CreER^T2; Topi NuTRAP (Mus musculus). Potrebbe essere necessario regolare i volumi dei reagenti in base ai tipi di campioni e al numero di tessuti.

1. Raccolta dei tessuti

1. Eutanasia i topi usando una camera CO₂ , disinfettare la superficie dell'addome con etanolo al 70%.
2. Aprire l'addome inferiore con le forbici e rimuovere i testicoli. Utilizzare azoto liquido (LN₂) per congelare immediatamente i testicoli.
3. Conservare i campioni nella fase vapore di LN₂ fino all'uso.

2. Preparazione di reagenti e perline

1. Preparare la soluzione madre di omogeneizzazione: aggiungere 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl₂, 100 mM KCl, 1% NP-40 e 1 mg/mL di eparina. Conservare la soluzione a 4 °C fino all'uso (fino a 1 mese).
2. Preparare il tampone di lavoro di omogeneizzazione dalla soluzione madre (fase 2.1) fresco prima dell'uso: aggiungere DTT (concentrazione finale: 1 mM), cicloeximide (concentrazione finale: 100 μg/ml), ribonucleasi ricombinante (concentrazione finale: 200 unità/ml) e cocktail inibitore della proteasi (concentrazione finale: 1x) alla soluzione madre di omogeneizzazione per ottenere la quantità necessaria del tampone di lavoro di omogeneizzazione. Conservare il tampone di lavoro appena preparato su ghiaccio fino all'uso.
3. Preparare i tamponi di lavaggio a basso contenuto di sale e ad alto contenuto di sale:
   1. Per preparare tamponi di lavaggio a basso contenuto di sale miscelare 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl₂, 100 mM KCl e 1% NP-40. Aggiungere DTT (concentrazione finale: 1 mM) e cicloeximide (concentrazione finale: 100 μg/ml) prima dell'uso.
   2. Per preparare la miscela tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl₂, 300 mM KCl, 1% NP-40. Aggiungere DTT (concentrazione finale: 2 mM) e Cycloheximide (concentrazione finale: 100 μg/mL) prima dell'uso.
4. Preparare le perle di proteina G (tabella dei materiali):
   1. Ogni campione avrà bisogno di 50 μL di perle di proteina G. Posizionare la quantità necessaria di sfere in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e separare le sfere dalla soluzione utilizzando un rack magnetico lasciando il tubo sul rack per 30-60 s.
   2. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Lavare le perline tre volte con 1 mL di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale ghiacciato ogni volta.

3. Lisi tissutale e omogeneizzazione

1. Aggiungere 2 ml di tampone di lavoro per omogeneizzazione ghiacciato (preparato al momento dal punto 2.2) a un set di smerigliatrice di tessuto di vetro. Posizionare rapidamente il campione congelato nel macinino e omogeneizzare il tessuto con 30 colpi sul ghiaccio usando un pestello sciolto.
2. Trasferire l'omogenato in una provetta a fondo tondo da 2 mL e centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
3. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 2 ml. Risparmiare 100 μL in un tubo da 1,5 mL come "input".
4. Incubare il surnatante nella provetta da 2 mL con l'anticorpo anti-GFP (5 μg/mL; 1:400) a 4 °C su un rotatore end-over-end (24 rpm) durante la notte.

4. Immunoprecipitazione

1. Trasferire la miscela omogenato/anticorpo in un nuovo tubo a fondo tondo da 2 mL contenente le sfere di proteina G lavate dal punto 2.4. Incubare a 4 °C su un rotatore end-over-end (24 rpm) per 2 ore.
2. Separare le sfere magnetiche dal surnatante usando un rack magnetico. Salva il surnatante come "frazione negativa". La frazione negativa contiene (1) RNA nelle cellule EGFP-negative e (2) RNA nelle cellule EGFP-positive che non sono legate ai ribosomi.
3. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale alle perline e ruotare brevemente il tubo per lavare le perline. Posizionare il tubo in un rack magnetico.
4. Rimuovere il tampone di lavaggio. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte. Le perle ora contengono il complesso beads-ribosoma-RNA da cellule EGFP-positive.

5. Estrazione dell'RNA

NOTA: I seguenti passaggi sono adattati dal kit di isolamento dell'RNA (Tabella dei materiali). Trattare ogni frazione (cioè input, positivo e negativo) come un campione indipendente e isolare gli RNA in modo indipendente.

1. Incubare le sfere dal punto 4.4 con 50 μL di tampone di estrazione (dal kit di isolamento dell'RNA) in un termomiscelatore (42 °C, 500 rpm) per 30 minuti per rilasciare RNA dalle perle.
2. Separare le perle con un rack magnetico, trasferire il surnatante che contiene il complesso perline-ribosoma-RNA in un tubo da 1,5 ml.
3. Centrifugare il tubo a 3000 x g per 2 minuti, quindi pipettare il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. Questo tubo contiene la "frazione positiva" del passo TRAP.
   NOTA: Per le frazioni in ingresso e negative, estrarre l'RNA da 25 μL di campioni utilizzando 1 mL di tampone di estrazione. Incubare in un termomiscelatore (42 °C, 500 giri/min) per 30 min.
4. Pre-condizionare la colonna di purificazione dell'RNA: pipettare 250 μL di tampone di condizionamento sulla colonna di purificazione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Centrifugare la colonna a 16.000 x g per 1 min.
5. Pipet uguale volume del 70% di EtOH nel surnatante dal passo 5.3 (circa 50 μL di 70% EtOH per la frazione positiva e 1 mL di 70% EtOH per la frazione in ingresso e la frazione negativa). Mescolare bene pipettando su e giù.
6. Pipettare la miscela nella colonna dal punto 5.4.
7. Centrifugare la colonna a 100 x g per 2 minuti per consentire il legame dell'RNA alla membrana nella colonna, quindi continuare la centrifuga a 16.000 x g per 30 s immediatamente. Eliminare il flusso in corso.
   NOTA: Per le frazioni in ingresso e negative, aggiungere ogni volta 250 μL della miscela alla colonna. Ripetere i punti 5.6 e 5.7 fino a utilizzare tutte le miscele.
8. Pipettare 100 μL di tampone di lavaggio 1 (W1) nella colonna e centrifugare a 8.000 x g per 1 minuto. Eliminare il flusso in corso.
9. Pipetta 75 μL di soluzione di DNasi miscelare direttamente nella membrana della colonna di purificazione. Incubare a RT per 15 min.
10. Pipettare 40 μL di W1 nella colonna e centrifugare a 8.000 x g per 30 s. Eliminare il flusso in corso.
11. Pipettare 100 μL di Wash Buffer 2 (W2) nella colonna e centrifugare a 8.000 x g per 1 min. Eliminare il flusso in corso.
12. Pipettare 100 μL di W2 nella colonna e centrifugare a 16.000 x g per 2 minuti. Eliminare il flusso in corso. Centrifugare nuovamente la stessa colonna a 16.000 x g per 1 minuto per rimuovere tutte le tracce di tampone di lavaggio prima della fase di eluizione.
13. Trasferire la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
14. Pipettare 12 μL di acqua priva di RNasi direttamente sulla membrana della colonna di purificazione. La punta del pipet non deve toccare la membrana. Incubare a RT per 1 min e centrifugare a 1000 x g per 1 min. Quindi continuare la centrifugazione a 16.000 x g per 1 minuto per eluire l'RNA.

6. Concentrazione e qualità dell'RNA

1. Utilizzare un bioanalizzatore per valutare la qualità e la quantità dell'RNA estratto¹⁰.

7. Conservazione e ulteriori analisi

1. Conservare l'RNA a -80 °C (fino a 1 anno) fino a ulteriori analisi (ad esempio, microarray, PCR quantitativa (qPCR) e RNA-seq, ecc.).
   NOTA: Per i dettagli dell'analisi qPCR, inclusa la sintesi del cDNA, fare riferimento a Lyu et ^al.11. I primer per qPCR sono elencati nella tabella dei materiali.

Risultati

Il topo Gli1-CreER^T2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) è stato prima incrociato con il topo reporter NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) per generare topi a doppio mutante. I topi portatori di entrambi gli alleli genici geneticamente modificati (cioè Gli1-CreER^T2 e NuTRAP) sono stati iniettati con tamoxifene una volta al giorno, a giorni alterni, per tre iniezioni. I campioni di tessuto sono stati raccolti il 7 ° giorno dopo il 1^° giorno de...

Discussione

L'utilità dell'analisi del trascrittoma dell'intero tessuto potrebbe essere smorzata, specialmente quando si studiano tessuti eterogenei complessi. Come ottenere RNA specifici del tipo di cellula diventa una necessità urgente per scatenare la potente tecnica RNA-seq. L'isolamento degli RNA specifici del tipo di cellula di solito si basa sulla raccolta di un tipo specifico di cellule mediante micromanipolazione, selezione cellulare attivata da fluorescente (FACS) o microdissezione a cattura laser (LCM)^...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actb	eurofins	qPCR primers	ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
Bioanalyzer	Agilent	2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Millipore	11836170001
cycloheximide	Millipore	239764-100MG
Cyp11a1	eurofins	qPCR primers	CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTP	Thermo Fisher Scientific	R0191
DTT, Dithiothreitol	Thermo Fisher Scientific	P2325
DynaMag-2 magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
Falcon tubes 15 mL	VWR	89039-666
GFP antibody	Abcam	ab290
Glass grinder set	DWK Life Sciences	357542
heparin	BEANTOWN CHEMICAL	139975-250MG
Hsd3b	eurofins	qPCR primers	GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KCl	Biosciences	R005
MgCl2	Biosciences	R004
Microcentrifuge tubes 2 mL	Thermo Fisher Scientific	02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarrays	Thermo Fisher Scientific		Microarray service
NP-40	Millipore	492018-50 Ml
oligo (dT)20	Invitrogen	18418020
PicoPure RNA Isolation Kit	Thermo Fisher Scientific	KIT0204
Protein G Dynabead	Thermo Fisher Scientific	10003D
RNase-free water	growcells	NUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019
Sox9	eurofins	qPCR primers	TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptase	Invitrogen	18090050
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155
Sycp3	eurofins	qPCR primers	GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
Tris	Alfa Aesar	J62848