无需细胞分选即可从快速冷冻的异质组织样品中分离细胞类型特异性RNA

摘要

该协议旨在使用NuTRAP小鼠模型分离细胞类型特异性翻译核糖体mRNA。

摘要

细胞异质性对在转录组水平上理解复杂组织的功能提出了挑战。使用细胞类型特异性RNA可避免由组织异质性引起的潜在陷阱，并释放强大的转录组分析。此处描述的方案演示了如何使用翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法从复杂组织中的少量表达EGFP的细胞中分离核糖体结合的RNA，而无需细胞分选。该协议适用于使用最近可用的 NuTRAP 小鼠模型分离细胞类型特异性RNA，也可用于从任何表达EGFP的细胞中分离RNA。

引言

包括RNA测序（RNA-seq）和微阵列在内的高通量方法使得在全基因组水平上询问基因表达谱成为可能。对于心脏、大脑和睾丸等复杂组织，细胞类型特异性数据将提供更多细节，比较整个组织^{RNA 的使用 1}，^2，3。为了克服细胞异质性的影响，自 2010 年代初以来，已经开发了翻译核糖体亲和纯化 （TRAP） 方法⁴。TRAP能够从特定细胞类型中分离核糖体结合的RNA，而无需组织解离。该方法已用于不同生物体的翻译组（被募集到核糖体中进行翻译的mRNA）分析，包括靶向果蝇胚胎^中极其罕见的肌肉细胞群5，研究模式植物拟南芥⁶中的不同根细胞，以及对哺乳动物的内皮细胞进行转录组^分析7。

TRAP需要基因改造来标记模式生物的核糖体。Evan Rosen及其同事最近开发了一种名为核标记和翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）小鼠⁸的小鼠模型，该模型自2017年以来已通过杰克逊实验室提供。通过与Cre小鼠系杂交，研究人员可以使用这种 NuTRAP 小鼠模型从表达Cre的细胞中分离核糖体结合的RNA和细胞核，而无需细胞分选。在也携带 NuTRAP 等位基因的表达Cre的细胞中，EGFP/L10a标记的核糖体允许使用亲和下拉测定分离翻译mRNA。在同一细胞中，生物素连接酶识别肽（BLRP）标记的核膜也是mCherry阳性，通过使用亲和或荧光纯化允许核分离。同一研究小组还产生了类似的小鼠系，其中核膜仅用mCherry标记，而没有生物素⁸。这两种转基因小鼠系可以表征特定类型感兴趣细胞的配对表观基因组和转录组谱。

刺猬（Hh）信号通路在组织发育中起着关键作用⁹。GLI1是GLI家族的成员，充当转录激活剂并介导Hh信号。Gli1⁺细胞可以在许多激素分泌器官中找到，包括肾上腺和睾丸。为了使用NuTRAP小鼠模型从Gli1 +细胞中分离细胞类型特异性DNA和RNA，将Gli1-CreER^T2小鼠与NuTRAP小鼠杂交。Shh-CreER^T2小鼠也与NuTRAP小鼠杂交，旨在分离表达声波刺猬（Shh）的细胞。以下协议显示了如何使用 Gli1-CreER^T2;NuTRAP小鼠从成年小鼠睾丸中的Gli1 ⁺细胞中分离核糖体结合的RNA。

研究方案

所有进行的动物实验都遵循奥本大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议。

注意:以下方案使用来自 Gli1-CreER^T2 的 P28 的一个睾丸（约 100 mg）;NuTRAP 小鼠（Mus musculus）。试剂体积可能需要根据样品类型和组织数量进行调整。

1. 组织采集

1. 使用CO₂ 室对小鼠实施安乐死，用70%乙醇消毒腹部表面。
2. 用剪刀打开下腹部并取出睾丸。使用液氮（LN₂）立即快速冷冻睾丸。
3. 将样品储存在LN₂ 的气相中直至使用。

2. 试剂和磁珠制备

1. 制备匀浆储备溶液:加入 50 mM Tris （pH 7.4）、12 mM MgCl₂、100 mM KCl、1% NP-40 和 1 mg/mL 肝素。将溶液储存在4°C直至使用（长达1个月）。
2. 使用前从储备溶液（步骤2.1）新鲜制备均质工作缓冲液:向均质储备溶液中加入DTT（终浓度:1 mM）、环己酰亚胺（终浓度:100 μg/mL）、重组核糖核酸酶（终浓度:200 单位/mL）和蛋白酶抑制剂混合物（终浓度:1x），制成所需量的匀浆工作缓冲液。将新鲜制备的工作缓冲液储存在冰上直至使用。
3. 准备低盐和高盐洗涤缓冲液:
   1. 制备低盐洗涤缓冲液，混合50 mM Tris（pH 7.4），12 mM MgCl₂，100 mM KCl和1% NP-40。使用前加入DTT（终浓度:1 mM）和环己酰亚胺（终浓度:100 μg/mL）。
   2. 制备高盐洗涤缓冲液混合物50 mM Tris（pH 7.4），12 mM MgCl₂，300 mM KCl，1%NP-40。使用前加入DTT（终浓度:2 mM）和环己酰亚胺（终浓度:100 μg/mL）。
4. 制备蛋白G珠（材料表）:
   1. 每个样品需要 50 μL 蛋白 G 珠。将所需量的磁珠放入 1.5 mL 离心管中，并使用磁性架将磁珠与溶液分离，方法是将管留在管架上 30-60 秒。
   2. 通过移液除去上清液。每次用 1 mL 冰冷的低盐洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。

3. 组织裂解和均质

1. 将 2 mL 冰冷的均质工作缓冲液（从步骤 2.2 新鲜制备）添加到玻璃组织研磨机组中。快速将冷冻样品放入研磨机中，并使用松散的杵在冰上按 30 次冲程均质组织。
2. 将匀浆转移到2mL圆底管中，并在4°C下以12，000× g 离心10分钟。
3. 将上清液转移到新的 2 mL 管中。将 100 μL 保存到 1.5 mL 管中作为"输入"。
4. 将上清液与抗 GFP 抗体 （5 μg/mL; 1:400） 在 4 °C 下在端对端旋转器 （24 rpm） 下孵育过夜。

4. 免疫沉淀

1. 将匀浆/抗体混合物转移到新的 2 mL 圆底管中，该管含有步骤 2.4 中洗涤的蛋白质 G 珠。在4°C下在端对端旋转器（24rpm）上孵育2小时。
2. 使用磁铁架将磁珠与上清液分离。将上清液保存为"负级分"。阴性部分在EGFP阴性细胞中含有（1）RNA，在EGFP阳性细胞中含有（2）不与核糖体结合的RNA。
3. 向磁珠中加入 1 mL 高盐洗涤缓冲液，并短暂涡旋试管以洗涤珠子。将管子放在磁铁架中。
4. 取出洗涤缓冲液。再重复两次洗涤步骤。这些珠子现在含有来自EGFP阳性细胞的珠子 - 核糖体 - RNA复合物。

5. 核糖核酸提取

注意:以下步骤改编自RNA分离试剂盒（材料表）。将每个部分（即输入、阳性和阴性）视为独立样品并独立分离RNA。

1. 将步骤 4.4 中的磁珠与 50 μL 提取缓冲液（来自 RNA 分离试剂盒）在热混合器（42 °C，500 rpm）中孵育 30 分钟以释放磁珠中的 RNA。
2. 用磁架分离磁珠，将含有磁珠-核糖体-RNA复合物的上清液转移到1.5mL管中。
3. 将管以 3000 x g 离心 2 分钟，然后将上清液移液到新的 1.5 mL 管中。该管包含TRAP步骤的"正分数"。
   注意:对于起始和负性馏分，使用 1 mL 提取缓冲液从 25 μL 样品中提取 RNA。在热混合器（42°C，500rpm）中孵育30分钟。
4. 预处理RNA纯化柱:将250 μL预处理缓冲液移液到纯化柱上。在室温（RT）下孵育5分钟。将色谱柱以16，000× g 离心1分钟。
5. 将等体积的70%EtOH移液到步骤5.3的上清液中（正级分约50μL的70%EtOH和1mL的70%EtOH的进样和负级分）。通过上下移液充分混合。
6. 将混合物从步骤5.4移液到色谱柱中。
7. 将色谱柱以100 x g 离心2分钟，以使RNA与柱中的膜结合，然后立即继续以16，000 x g 离心30秒。丢弃流出物。
   注意:对于进样和负馏分，每次向色谱柱中加入250 μL混合物。重复步骤5.6和5.7，直到用完所有混合物。
8. 将 100 μL 洗涤缓冲液 1 （W1） 移液到色谱柱中，并以 8，000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
9. 将 75 μL 脱氧核糖核酸酶溶液直接混合到纯化柱膜中。在室温下孵育15分钟。
10. 将 40 μL W1 移液到色谱柱中，并以 8，000 x g 离心 30 秒。丢弃流出物。
11. 将 100 μL 洗涤缓冲液 2 （W2） 移液到色谱柱中，并以 8，000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
12. 将 100 μL W2 移液到色谱柱中，并以 16，000 x g 离心 2 分钟。丢弃流出物。在洗脱步骤之前，以16，000 x g 离心同一色谱柱1分钟，以除去所有痕量的洗涤缓冲液。
13. 将色谱柱转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
14. 将 12 μL 无 RNase 的水直接移液到纯化柱的膜上。移液器吸头不应接触膜。在室温下孵育1分钟，并以1000× g 离心1分钟。然后继续以16，000× g 离心1分钟以洗脱RNA。

6. RNA浓度和质量

1. 使用生物分析仪评估提取的RNA的质量和数量¹⁰.

7. 存储和进一步分析

1. 将RNA储存在-80°C（长达1年）直至进一步分析（例如，微阵列，定量PCR（qPCR）和RNA-seq等）。
   注意:有关qPCR分析的详细信息，包括cDNA合成，请参阅Lyu等人¹¹。qPCR的引物列在 材料表中。

结果

首先将Gli1-CreER^T2小鼠（杰克逊实验室库存号:007913）与NuTRAP报告小鼠（杰克逊实验室库存号:029899）杂交以产生双突变小鼠。携带两种基因工程基因等位基因（即Gli1-CreER^T2和NuTRAP）的小鼠每天注射一次他莫昔芬，每隔一天注射三次。在注射第1天后第^7天收集组织样本。免疫荧光分析显示，EGFP在睾丸的间质细胞中表达（图1）?...

讨论

全组织转录组分析的有用性可能会受到抑制，尤其是在研究复杂的异质组织时。如何获得细胞类型特异性RNA成为释放强大的RNA-seq技术的迫切需要。细胞类型特异性RNA的分离通常依赖于使用显微操作，荧光激活细胞分选（FACS）或激光捕获显微切割（LCM）收集特定类型的细胞¹⁸。还开发了其他现代高通量单细胞收集方法和仪器¹⁹。这些方法通常采用微流体技术对单?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actb	eurofins	qPCR primers	ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
Bioanalyzer	Agilent	2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Millipore	11836170001
cycloheximide	Millipore	239764-100MG
Cyp11a1	eurofins	qPCR primers	CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTP	Thermo Fisher Scientific	R0191
DTT, Dithiothreitol	Thermo Fisher Scientific	P2325
DynaMag-2 magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
Falcon tubes 15 mL	VWR	89039-666
GFP antibody	Abcam	ab290
Glass grinder set	DWK Life Sciences	357542
heparin	BEANTOWN CHEMICAL	139975-250MG
Hsd3b	eurofins	qPCR primers	GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KCl	Biosciences	R005
MgCl2	Biosciences	R004
Microcentrifuge tubes 2 mL	Thermo Fisher Scientific	02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarrays	Thermo Fisher Scientific		Microarray service
NP-40	Millipore	492018-50 Ml
oligo (dT)20	Invitrogen	18418020
PicoPure RNA Isolation Kit	Thermo Fisher Scientific	KIT0204
Protein G Dynabead	Thermo Fisher Scientific	10003D
RNase-free water	growcells	NUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019
Sox9	eurofins	qPCR primers	TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptase	Invitrogen	18090050
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155
Sycp3	eurofins	qPCR primers	GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
Tris	Alfa Aesar	J62848