Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

Résumé

Ce protocole vise à isoler les ARNm ribosomales de traduction spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP.

Résumé

L’hétérogénéité cellulaire pose des défis pour comprendre la fonction des tissus complexes au niveau du transcriptome. L’utilisation d’ARN spécifiques au type cellulaire évite les pièges potentiels causés par l’hétérogénéité des tissus et libère la puissante analyse du transcriptome. Le protocole décrit ici montre comment utiliser la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purity) pour isoler les ARN liés aux ribosomes à partir d’une petite quantité de cellules exprimant l’EGFP dans un tissu complexe sans tri cellulaire. Ce protocole convient à l’isolement d’ARN spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP récemment disponible et pourrait également être utilisé pour isoler les ARN de toutes les cellules exprimant l’EGFP.

Introduction

Les approches à haut débit, y compris le séquençage de l’ARN (RNA-seq) et les microarrays, ont permis d’interroger les profils d’expression génique à l’échelle du génome. Pour les tissus complexes tels que le cœur, le cerveau et les testicules, les données spécifiques au type cellulaire fourniront plus de détails comparant l’utilisation des ARN du tissu entier ^1,2,3. Pour surmonter l’impact de l’hétérogénéité cellulaire, la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purifie) est développée depuis le début des années 2010⁴. TRAP est capable d’isoler le....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux effectuées ont suivi les protocoles approuvés par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’Auburn.

REMARQUE: Le protocole suivant utilise un testicule (environ 100 mg) à P28 de Gli1-CreER^T2; Souris NuTRAP (Mus musculus). Les volumes de réactifs peuvent devoir être ajustés en fonction des types d’échantillons et du nombre de tissus.

1. Prélèvement de tissus

1. Euthanasier les souris à l’aide d’une chambre CO₂ , désinfecter la surface de l’abdomen avec de l’éthanol....

Résultats

Les souris Gli1-CreER^T2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) ont d’abord été croisées avec la souris rapporteure NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) pour générer des souris double-mutantes. Des souris portant les deux allèles génétiques génétiquement modifiés (c.-à-d. Gli1-CreER^T2 et NuTRAP) ont reçu une injection de tamoxifène une fois par jour, tous les deux jours, pour trois injections. Des échantillons de tissus ont été prélevés le 7^ème

Discussion

L’utilité de l’analyse du transcriptome des tissus entiers pourrait être atténuée, en particulier lors de l’étude de tissus hétérogènes complexes. Comment obtenir des ARN spécifiques au type cellulaire devient un besoin urgent de libérer la puissante technique de séquençage de l’ARN. L’isolement d’ARN spécifiques à un type cellulaire repose généralement sur la collecte d’un type spécifique de cellules à l’aide de la micromanipulation, du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actb	eurofins	qPCR primers	ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
Bioanalyzer	Agilent	2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Millipore	11836170001
cycloheximide	Millipore	239764-100MG
Cyp11a1	eurofins	qPCR primers	CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTP	Thermo Fisher Scientific	R0191
DTT, Dithiothreitol	Thermo Fisher Scientific	P2325
DynaMag-2 magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
Falcon tubes 15 mL	VWR	89039-666
GFP antibody	Abcam	ab290
Glass grinder set	DWK Life Sciences	357542
heparin	BEANTOWN CHEMICAL	139975-250MG
Hsd3b	eurofins	qPCR primers	GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KCl	Biosciences	R005
MgCl2	Biosciences	R004
Microcentrifuge tubes 2 mL	Thermo Fisher Scientific	02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarrays	Thermo Fisher Scientific		Microarray service
NP-40	Millipore	492018-50 Ml
oligo (dT)20	Invitrogen	18418020
PicoPure RNA Isolation Kit	Thermo Fisher Scientific	KIT0204
Protein G Dynabead	Thermo Fisher Scientific	10003D
RNase-free water	growcells	NUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019
Sox9	eurofins	qPCR primers	TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptase	Invitrogen	18090050
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155
Sycp3	eurofins	qPCR primers	GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
Tris	Alfa Aesar	J62848