JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה נועד לבודד mRNA ריבוזומלי ספציפי לסוג התא באמצעות מודל העכבר NuTRAP.

Abstract

הטרוגניות תאית מציבה אתגרים להבנת תפקודן של רקמות מורכבות ברמת שעתוק. שימוש ב-RNA ספציפי לסוג התא מונע מלכודות פוטנציאליות הנגרמות על ידי ההטרוגניות של רקמות ומשחרר את ניתוח השעתוק העוצמתי. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כיצד להשתמש בשיטת טיהור זיקת ריבוזום (TRAP) לבודד רנ"א הקשורים לריבוזום מכמות קטנה של תאים המבטאים EGFP ברקמה מורכבת ללא מיון תאים. פרוטוקול זה מתאים לבידוד רנ"א ספציפיים לסוג התא באמצעות מודל עכבר NuTRAP הזמין לאחרונה, וניתן להשתמש בו גם לבידוד רנ"א מכל תא המבטא EGFP.

Introduction

גישות בעלות תפוקה גבוהה, כולל ריצוף RNA (RNA-seq) ומיקרו-מערך, אפשרו לחקור פרופילי ביטוי גנים ברמה הגנומית כולה. עבור רקמות מורכבות כמו הלב, המוח והאשכים, הנתונים הספציפיים לסוג התא יספקו פרטים נוספים המשווים את השימוש ב-RNA מכל הרקמה 1,2,3. כדי להתגבר על ההשפעה של הטרוגניות תאית, שיטת טיהור זיקת הריבוזום המתורגמת (TRAP) פותחה מאז תחילת שנות ה-20104. TRAP מסוגל לבודד רנ"א הקשורים לריבוזום מסוגי תאים ספציפיים ללא דיסוציאציה של רקמות. שיטה זו שימשה לניתוח טרנסלטום (mRNA המגויס לריבוזום לתרגום) באורגניזמים שונים, כולל התמקדות באוכלוסייה נדירה ביותר של תאי שריר בעוברי Drosophila5, חקר תאי שורש שונים בצמח המודל Arabidopsis thaliana6, וביצוע ניתוח תעתיק של תאי אנדותל ביונקים7.

TRAP דורש שינוי גנטי כדי לתייג את הריבוזום של אורגניזם מודל. אוון רוזן ועמיתיו פיתחו לאחרונה מודל עכבר בשם תיוג גרעיני ותרגום של עכברטיהור זיקה ריבוזום (NuTRAP) 8, הזמין דרך מעבדת ג'קסון מאז 2017. על ידי חצייה עם קו עכבר Cre, חוקרים יכולים להשתמש במודל עכבר NuTRAP זה כדי לבודד רנ"א הקשורים לריבוזום וגרעיני תאים מתאים המבטאים Cre ללא מיון תאים. בתאים המבטאים Cre הנושאים גם את אלל NuTRAP, הריבוזום המתויג EGFP/L10a מאפשר בידוד של תרגום mRNA באמצעות מבחני משיכה של זיקה. באותו תא, הממברנה הגרעינית המתויגת כפפטיד זיהוי ביוטין ליגאז (BLRP), שגם היא חיובית ל-mCherry, מאפשרת בידוד גרעיני באמצעות טיהור מבוסס זיקה או פלואורסצנציה. אותו צוות מחקר גם יצר קו עכברים דומה שבו קרום הגרעין מסומן רק עם mCherry ללא ביוטין8. שני קווי עכבר מהונדסים גנטית אלה נותנים גישה לאפיין פרופילים אפיגנומיים ותעתיקיים זוגיים של סוגים ספציפיים של תאים בעלי עניין.

מסלול האיתות של הקיפוד (Hh) ממלא תפקיד קריטי בהתפתחות רקמות9. GLI1, בן למשפחת GLI, פועל כמפעיל תעתוק ומתווך את איתות ה-HH. תאי Gli1+ יכולים להימצא באיברים רבים המפרישים הורמונים, כולל בלוטת יותרת הכליה והאשכים. כדי לבודד דנ"א ו-RNA ספציפיים לסוג התא מתאי Gli1+ באמצעות מודל העכבר NuTRAP, עכברי Gli1-CreERT2 הוצלבו עם עכברי NuTRAP. עכברי Shh-CreERT2 נחצו גם הם כאשר עכברי NuTRAP נועדו לבודד תאים המבטאים קיפוד קולי (Shh). הפרוטוקול הבא מראה כיצד להשתמש ב- Gli1-CreERT2; עכברי NuTRAP לבידוד רנ"א הקשורים לריבוזום מתאי Gli1+ באשכים של עכברים בוגרים.

Protocol

כל הניסויים שבוצעו בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת אובורן.

הערה: הפרוטוקול הבא משתמש באשכים אחד (כ-100 מ"ג) ב-P28 מ-Gli1-CreERT2; עכברי NuTRAP (Mus musculus). ייתכן שיהיה צורך להתאים נפחים של ריאגנטים על סמך סוגי הדגימות ומספר הרקמות.

1. איסוף רקמות

  1. להרדים את העכברים באמצעות תא CO2 , לחטא את משטח הבטן עם 70% אתנול.
  2. פתח את הבטן התחתונה עם מספריים ולהסיר את האשכים. השתמש בחנקן נוזלי (LN2) כדי להקפיא את האשכים באופן מיידי.
  3. יש לאחסן דגימות בשלב האדים של LN2 עד לשימוש.

2. הכנת ריאגנטים וחרוזים

  1. הכן את תמיסת מלאי ההומוגניזציה: הוסף 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40, ו 1 מ"ג / מ"ל הפרין. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש (עד חודש).
  2. הכן את מאגר העבודה של ההומוגניזציה מתמיסת המלאי (שלב 2.1) לפני השימוש: הוסף DTT (ריכוז סופי: 1 מ"מ), ציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל), ריבונוקלאז רקומביננטי (ריכוז סופי: 200 יחידות/מ"ל), וקוקטייל מעכבי פרוטאז (ריכוז סופי: 1x) לתמיסת מלאי ההומוגניזציה כדי להפוך את הכמות הנדרשת של מאגר העבודה של ההומוגניזציה. אחסנו את חיץ העבודה הטרי על הקרח עד לשימוש.
  3. הכינו את מאגרי המלח הנמוכים ואת מאגרי הכביסה עתירי המלח:
    1. להכנת תערובת חיץ עם מלח נמוך 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl ו-1% NP-40. יש להוסיף DTT (ריכוז סופי: 1 מ"מ) וציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל) לפני השימוש.
    2. להכנת תערובת חיץ עשירה במלח 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. יש להוסיף DTT (ריכוז סופי: 2 mM) וציקלוהקסימיד (ריכוז סופי: 100 מיקרוגרם/מ"ל) לפני השימוש.
  4. הכינו חרוזי חלבון G (טבלת חומרים):
    1. כל דגימה תצטרך 50 μL של חרוזי חלבון G. מניחים את כמות החרוזים הנדרשת בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומפרידים את החרוזים מהתמיסה באמצעות מתלה מגנטי על ידי השארת הצינור על המדף למשך 30-60 שניות.
    2. הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטציה. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של חיץ שטיפה קר כקרח דל מלח בכל פעם.

3. תזה של רקמות והומוגניות

  1. הוסף 2 מ"ל של חיץ עבודה הומוגניזציה קר כקרח (מוכן טרי משלב 2.2) לסט מטחנת רקמת זכוכית. הכנס במהירות את הדגימה הקפואה לתוך המטחנה והומוגני את הרקמה עם 30 משיכות על קרח באמצעות מזיק רופף.
  2. מעבירים את ההומוגנט לצינור בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 2 מ"ל. חסוך 100 μL לצינור 1.5 מ"ל כ"קלט ".
  4. דגירה של הסופר-נטנט בצינור 2 מ"ל עם הנוגדן נגד GFP (5 מיקרוגרם/מ"ל; 1:400) ב-4 מעלות צלזיוס על גבי סיבוב מקצה לקצה (24 סל"ד) למשך הלילה.

4. מיצוי חיסוני

  1. העבירו את תערובת ההומוגנט/נוגדנים לצינור חדש בעל תחתית עגולה של 2 מ"ל המכיל את חרוזי החלבון G השטופים משלב 2.4. דגירה ב-4°C על סיבוב מקצה לקצה (24 סל"ד) למשך שעתיים.
  2. הפרידו את החרוזים המגנטיים מהסופר-נטנט באמצעות מתלה מגנטים. שמור את הסופרנטנט כ"שבר השלילי ". השבר השלילי מכיל (1) רנ"א בתאים שליליים ל-EGFP ו-(2) רנ"א בתאים חיוביים ל-EGFP שאינם קשורים לריבוזומים.
  3. הוסיפו 1 מ"ל של חיץ שטיפה עתיר מלח לחרוזים ומערבבים לזמן קצר את הצינור כדי לשטוף את החרוזים. הניחו את הצינור במדף מגנט.
  4. מוציאים את מאגר הכביסה. חזרו על שלב הכביסה פעמיים נוספות. החרוזים מכילים כעת את קומפלקס החרוזים-ריבוזום-RNA מתאים חיוביים ל-EGFP.

5. מיצוי RNA

הערה: השלבים הבאים מותאמים מתוך ערכת בידוד RNA (טבלת חומרים). התייחסו לכל שבר (כלומר, קלט, חיובי ושלילי) כדגימה עצמאית ובודדו רנ"א באופן עצמאי.

  1. דגירה של החרוזים משלב 4.4 עם 50 μL של מאגר מיצוי (מתוך ערכת בידוד ה-RNA) בתרמומיקסר (42 °C, 500 סל"ד) למשך 30 דקות כדי לשחרר רנ"א מחרוזים.
  2. מפרידים את החרוזים בעזרת מתלה מגנטים, מעבירים את הסופר-נאטנט המכיל את קומפלקס החרוזים-ריבוזום-רנ"א לצינור של 1.5 מ"ל.
  3. צנטריפוגה את הצינור ב 3000 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן פיפטה את supernatant לצינור חדש 1.5 מ"ל. צינור זה מכיל את "החלק החיובי" של שלב TRAP.
    הערה: עבור הקלט והשברים השליליים, חלץ RNA מ- 25 μL של דגימות באמצעות 1 מ"ל של מאגר מיצוי. דגירה בתרמומיקסר (42°C, 500 סל"ד) למשך 30 דקות.
  4. תנאי מראש את עמודת טיהור ה-RNA: פיפטה 250 μL של חיץ התניה על עמודת הטיהור. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). צנטריפוגה של העמודה ב 16,000 x גרם במשך דקה אחת.
  5. פיפט שווה נפח של 70% EtOH לתוך supernatant משלב 5.3 (סביב 50 μL של 70% EtOH עבור השבר החיובי ו 1 מ"ל של 70% EtOH עבור הקלט ואת השברים השליליים). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
  6. צמחו את התערובת לתוך העמודה משלב 5.4.
  7. צנטריפוגה העמודה ב 100 x g במשך 2 דקות כדי לאפשר RNA קשירה לממברנה בעמודה, ולאחר מכן להמשיך צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 30 שניות מיד. בטל את הזרימה.
    הערה: עבור הקלט והשברים השליליים, הוסף 250 μL של התערובת לעמודה בכל פעם. חזור על שלבים 5.6 ו- 5.7 עד לשימוש בכל התערובות.
  8. פיפטה 100 μL של Wash Buffer 1 (W1) לתוך העמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.
  9. Pipette 75 μL של תמיסת DNase מתערבבים ישירות לתוך קרום עמודת הטיהור. דגירה ב- RT במשך 15 דקות.
  10. פיפטה 40 μL של W1 לתוך העמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 30 שניות. בטל את הזרימה.
  11. פיפטה 100 μL של Wash Buffer 2 (W2) לתוך העמודה וצנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.
  12. פיפטה 100 μL של W2 לתוך העמוד וצנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 2 דקות. בטל את הזרימה. סובבו מחדש את אותו עמוד בגודל 16,000 x g למשך דקה אחת כדי להסיר את כל עקבות חיץ הכביסה לפני שלב ההדחה.
  13. העבר את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל.
  14. פיפטה 12 μL של מים ללא RNase ישירות על הממברנה של עמוד הטיהור. קצה הפיפט לא צריך לגעת בממברנה. דגירה ב-RT למשך דקה אחת וצנטריפוגה ב-1000 x גרם למשך דקה אחת. לאחר מכן המשיכו את הצנטריפוגה ב-16,000 x g למשך דקה אחת כדי לחדד את הרנ"א.

6. ריכוז ואיכות RNA

  1. השתמש בביואנליזה כדי להעריך את האיכות והכמות של ה-RNA10 המופק.

7. אחסון וניתוח נוסף

  1. אחסן את הרנ"א בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (עד שנה אחת) עד לניתוח נוסף (למשל, מיקרו-מערך, PCR כמותי (qPCR), ו-RNA-seq וכו').
    הערה: לפרטים על ניתוח qPCR, כולל סינתזת cDNA, עיין ב- Lyu et al.11. פריימרים עבור qPCR מפורטים בטבלת החומרים.

תוצאות

עכבר Gli1-CreERT2 (מספר מלאי של מעבדת ג'קסון: 007913) נחצה לראשונה עם עכבר הכתב NuTRAP (מספר מלאי של מעבדת ג'קסון: 029899) כדי ליצור עכברים בעלי מוטציה כפולה. עכברים שנשאו את שני אללי הגנים המהונדסים גנטית (כלומר, Gli1-CreERT2 ו-NuTRAP) הוזרקו טמוקסיפן פעם ביום, אחת ליומיים, במשך שלוש זריקות....

Discussion

התועלת של ניתוח תעתיק רקמה שלמה יכולה להיות מעומעמת, במיוחד כאשר חוקרים רקמות הטרוגניות מורכבות. כיצד להשיג רנ"א ספציפי לסוג התא הופך לצורך דחוף לשחרר את טכניקת ה-RNA-seq רבת העוצמה. הבידוד של רנ"א ספציפיים לסוג התא מסתמך בדרך כלל על איסוף של סוג מסוים של תאים באמצעות מיקרומניפולציה, מיון תאים ...

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי NIH R00HD082686. אנו מודים למלגת מחקר הקיץ של החברה האנדוקרינית ל- H.S.Z. אנו מודים גם לד"ר יואן קאנג על הרבייה והשמירה על מושבת העכברים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ActbeurofinsqPCR primersATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
BioanalyzerAgilent2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMillipore11836170001
cycloheximideMillipore239764-100MG
Cyp11a1eurofinsqPCR primersCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT, DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
DynaMag-2 magnetThermo Fisher Scientific12321D
Falcon tubes 15 mLVWR89039-666
GFP antibodyAbcamab290
Glass grinder setDWK Life Sciences357542
heparinBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
Hsd3beurofinsqPCR primersGACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
Microcentrifuge tubes 2 mLThermo Fisher Scientific02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarraysThermo Fisher ScientificMicroarray service
NP-40Millipore492018-50 Ml
oligo (dT)20Invitrogen18418020
PicoPure RNA Isolation KitThermo Fisher ScientificKIT0204
Protein G DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
RNase-free watergrowcellsNUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease InhibitorThermo Fisher Scientific10777019
Sox9eurofinsqPCR primersTGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptaseInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155
Sycp3eurofinsqPCR primersGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
TrisAlfa AesarJ62848

References

  1. Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
  2. Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
  3. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  4. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  5. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
  6. Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
  7. Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
  8. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  9. Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
  10. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
  11. Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  14. Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
  15. Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
  16. Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
  17. Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
  18. Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  19. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  20. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
  21. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
  22. Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
  23. Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178RNAEGFPGli1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved