Zelltypspezifische RNAs aus eingefrorenen heterogenen Gewebeproben ohne Zellsortierung isolieren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zelltypspezifisch translatierende ribosomale mRNAs mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren.

Zusammenfassung

Die zelluläre Heterogenität stellt das Verständnis der Funktion komplexer Gewebe auf Transkriptomebene vor Herausforderungen. Die Verwendung zelltypspezifischer RNAs vermeidet potenzielle Fallstricke, die durch die Heterogenität von Geweben verursacht werden, und löst die leistungsstarke Transkriptomanalyse aus. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) verwendet werden kann, um Ribosomen-gebundene RNAs aus einer kleinen Menge EGFP-exprimierender Zellen in einem komplexen Gewebe ohne Zellsortierung zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich für die Isolierung zelltypspezifischer RNAs mit dem kürzlich verfügbaren NuTRAP-Mausmodell und könnte auch verwendet werden, um RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen zu isolieren.

Einleitung

Hochdurchsatzansätze, einschließlich RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und Microarray, haben es ermöglicht, Genexpressionsprofile auf genomweiter Ebene abzufragen. Für komplexe Gewebe wie Herz, Gehirn und Hoden liefern die zelltypspezifischen Daten mehr Details zum Vergleich der Verwendung von RNAs aus dem gesamten Gewebe ^1,2,3. Um die Auswirkungen der zellulären Heterogenität zu überwinden, wurde seit Anfang der 2010er Jahre die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) entwickelt⁴. TRAP ist in der Lage, Ribosom-gebundene RNAs aus bestimmten Zelltypen ohne Gewebedissoziation zu isolieren. Diese Methode wurde für die Translatomanalyse (mRNAs, die zur Translation in das Ribosom rekrutiert werden) in verschiedenen Organismen verwendet, einschließlich der Ausrichtung auf eine extrem seltene Population von Muskelzellen in Drosophila-Embryonen⁵, der Untersuchung verschiedener Wurzelzellen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana⁶ und der Durchführung einer Transkriptomanalyse von Endothelzellen in Säugetieren⁷.

TRAP erfordert eine genetische Veränderung, um das Ribosom eines Modellorganismus zu markieren. Evan Rosen und Kollegen entwickelten kürzlich ein Mausmodell namens Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse⁸, das seit 2017 über das Jackson Laboratory erhältlich ist. Durch Kreuzung mit einer Cre-Mauslinie können Forscher dieses NuTRAP-Mausmodell verwenden, um Ribosomen-gebundene RNAs und Zellkerne aus Cre-exprimierenden Zellen ohne Zellsortierung zu isolieren. In Cre-exprimierenden Zellen, die auch das NuTRAP-Allel tragen, ermöglicht das EGFP/L10a-markierte Ribosom die Isolierung translatierender mRNAs unter Verwendung von Affinitäts-Pulldown-Assays. An derselben Zelle ermöglicht die Biotin-Ligase-Erkennungspeptid (BLRP)-markierte Kernmembran, die ebenfalls mCherry-positiv ist, die nukleare Isolierung durch affinitäts- oder fluoreszenzbasierte Reinigung. Das gleiche Forscherteam erzeugte auch eine ähnliche Mauslinie, in der die Kernmembran nur mit mCherry ohne Biotin⁸ markiert ist. Diese beiden genetisch veränderten Mauslinien ermöglichen die Charakterisierung gepaarter epigenomischer und transkriptomischer Profile bestimmter Zelltypen.

Der Hedgehog (Hh)-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle bei der Gewebeentwicklung⁹. GLI1, ein Mitglied der GLI-Familie, fungiert als transkriptioneller Aktivator und vermittelt die Hh-Signalisierung. Gli1⁺ Zellen können in vielen hormonsezernierenden Organen gefunden werden, einschließlich der Nebenniere und des Hodens. Um zelltypspezifische DNAs und RNAs aus Gli1⁺-Zellen mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren, wurden Gli1-CreER^T2-Mäuse mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt. Shh-CreER^T2-Mäuse wurden auch mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt, um Schalligel (Shh) exprimierende Zellen zu isolieren. Das folgende Protokoll zeigt, wie Gli1-CreER^T2 verwendet wird. NuTRAP-Mäuse isolieren Ribosomen-gebundene RNAs aus Gli1⁺-Zellen in erwachsenen Maushoden.

Protokoll

Alle durchgeführten Tierversuche folgten den Protokollen, die von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) der Auburn University genehmigt wurden.

HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet einen Hoden (ca. 100 mg) bei P28 von Gli1-CreER^T2; NuTRAP-Mäuse (Mus musculus). Das Volumen der Reagenzien muss möglicherweise basierend auf der Art der Proben und der Anzahl der Gewebe angepasst werden.

1. Gewebeentnahme

1. Euthanasieren Sie die Mäuse mit einer_CO2-Kammer , desinfizieren Sie die Bauchoberfläche mit 70% Ethanol.
2. Öffnen Sie den Unterbauch mit einer Schere und entfernen Sie die Hoden. Verwenden Sie flüssigen Stickstoff (LN₂), um die Hoden sofort einzufrieren.
3. Lagern Sie Proben in der Dampfphase von LN₂ bis zur Verwendung.

2. Zubereitung von Reagenzien und Perlen

1. Bereiten Sie die Homogenisierungsstammlösung vor: Fügen Sie 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl₂, 100 mM KCl, 1% NP-40 und 1 mg/ml Heparin hinzu. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C bis zur Verwendung (bis zu 1 Monat).
2. Bereiten Sie den Homogenisierungsarbeitspuffer aus der Stammlösung (Schritt 2.1) frisch vor Gebrauch vor: Fügen Sie DTT (Endkonzentration: 1 mM), Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml), rekombinante Ribonuklease (Endkonzentration: 200 Einheiten/ml) und Proteaseinhibitorcocktail (Endkonzentration: 1x) zur Homogenisierungsstammlösung hinzu, um die erforderliche Menge des Homogenisierungsarbeitspuffers herzustellen. Lagern Sie den frisch zubereiteten Arbeitspuffer bis zum Gebrauch auf Eis.
3. Bereiten Sie die salzarmen und salzreichen Waschpuffer vor:
   1. Zur Herstellung eines salzarmen Waschpuffers mischen Sie 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl₂, 100 mM KCl und 1% NP-40. Fügen Sie vor Gebrauch DVB-T (Endkonzentration: 1 mM) und Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml) hinzu.
   2. Zur Herstellung eines salzreichen Waschpuffers mischen Sie 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM_MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Fügen Sie vor Gebrauch DVB-T (Endkonzentration: 2 mM) und Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml) hinzu.
4. Protein G-Perlen vorbereiten (Materialtabelle):
   1. Jede Probe benötigt 50 μL Protein-G-Perlen. Legen Sie die erforderliche Menge an Perlen in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und trennen Sie die Perlen mit einem Magnetgestell von der Lösung, indem Sie das Röhrchen für 30-60 s auf dem Rack belassen.
   2. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Waschen Sie die Perlen dreimal mit jeweils 1 ml eiskaltem, salzarmem Waschpuffer.

3. Gewebelyse und Homogenisierung

1. Fügen Sie 2 mL eiskalten Homogenisierungsarbeitspuffer (frisch zubereitet aus Schritt 2.2) zu einem Glasgewebeschleifer-Set hinzu. Legen Sie die gefrorene Probe schnell in die Mühle und homogenisieren Sie das Gewebe mit 30 Schlägen auf Eis mit einem losen Stößel.
2. Das Homogenat in ein 2-ml-Rundbodenröhrchen überführen und 10 min bei 4 °C bei 12.000 x g zentrifugieren.
3. Überstand wird in ein neues 2-ml-Röhrchen überführt. Speichern Sie 100 μL in eine 1,5 mL Röhre als "Eingang".
4. Inkubieren Sie den Überstand im 2-ml-Röhrchen mit dem Anti-GFP-Antikörper (5 μg/ml; 1:400) bei 4 °C auf einem End-over-End-Rotator (24 U/min) über Nacht.

4. Immunpräzipitation

1. Das Homogenat/Antikörper-Gemisch wird in ein neues 2-ml-Rundbodenröhrchen überführt, das die gewaschenen Protein-G-Perlen aus Schritt 2.4 enthält. Bei 4 °C auf einem End-over-End-Rotator (24 U/min) für 2 h inkubieren.
2. Trennen Sie die magnetischen Kügelchen mit einem Magnetgestell vom Überstand. Speichern Sie den Überstand als "negativen Bruch". Die negative Fraktion enthält (1) RNAs in EGFP-negativen Zellen und (2) RNAs in EGFP-positiven Zellen, die nicht an Ribosomen gebunden sind.
3. Fügen Sie 1 ml salzreichen Waschpuffer zu den Perlen hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen kurz an, um die Perlen zu waschen. Legen Sie das Rohr in ein Magnetgestell.
4. Entfernen Sie den Waschpuffer. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch zwei weitere Male. Die Beads enthalten nun den Beads-Ribosom-RNA-Komplex aus EGFP-positiven Zellen.

5. RNA-Extraktion

HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden aus dem RNA-Isolierkit (Table of Materials) adaptiert. Behandeln Sie jede Fraktion (d. H. Input, positiv und negativ) als unabhängige Probe und isolieren Sie RNAs unabhängig.

1. Inkubieren Sie die Beads aus Schritt 4.4 mit 50 μL Extraktionspuffer (aus dem RNA-Isolierkit) in einem Thermomixer (42 °C, 500 U/min) für 30 min, um RNAs aus Beads freizusetzen.
2. Trennen Sie die Beads mit einem Magnetgestell, übertragen Sie den Überstand, der den Beads-Ribosom-RNA-Komplex enthält, in ein 1,5 ml Röhrchen.
3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 3000 x g für 2 min, dann pipetten Sie den Überstand zu einem neuen 1,5 ml Röhrchen. Dieses Röhrchen enthält den "positiven Anteil" des TRAP-Schritts.
   HINWEIS: Für den Input und die negativen Fraktionen extrahieren Sie RNA aus 25 μL Proben unter Verwendung von 1 mL Extraktionspuffer. In einem Thermomixer (42 °C, 500 U/min) 30 min inkubieren.
4. Vorkonditionierung der RNA-Reinigungssäule: Pipettieren Sie 250 μL Konditionierungspuffer auf die Reinigungssäule. 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Zentrifugieren Sie die Säule bei 16.000 x g für 1 min.
5. Pipet gleiches Volumen von 70% EtOH in den Überstand aus Schritt 5.3 (ca. 50 μL 70% EtOH für die positive Fraktion und 1 ml 70% EtOH für die Eingangs- und die negativen Fraktionen). Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
6. Die Mischung aus Schritt 5.4 in die Säule pipettieren.
7. Zentrifugieren Sie die Säule bei 100 x g für 2 Minuten, damit RNA an die Membran in der Säule bindet, und zentrifugieren Sie dann sofort bei 16.000 x g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss.
   HINWEIS: Für die Eingabe und die negativen Fraktionen fügen Sie jedes Mal 250 μL der Mischung in die Säule ein. Wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7, bis alle Gemische verwendet sind.
8. 100 μL Waschpuffer 1 (W1) in die Säule pipettieren und bei 8.000 x g für 1 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
9. 75 μL DNase-Lösungsmischung werden direkt in die Membran der Reinigungskolonne pipettiert. Inkubieren bei RT für 15 min.
10. 40 μL W1 in die Säule pipettieren und bei 8.000 x g für 30 s zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
11. 100 μL Waschpuffer 2 (W2) in die Säule pipettieren und bei 8.000 x g für 1 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
12. 100 μL W2 in die Säule pipettieren und bei 16.000 x g für 2 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss. Zentrifugieren Sie dieselbe Säule bei 16.000 x g für 1 Minute, um alle Spuren des Waschpuffers vor dem Elutionsschritt zu entfernen.
13. Die Säule wird in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
14. Pipettieren Sie 12 μL RNase-freies Wasser direkt auf die Membran der Reinigungssäule. Die Pipettenspitze sollte die Membran nicht berühren. Inkubieren bei RT für 1 min und Zentrifugieren bei 1000 x g für 1 min. Dann setzen Sie die Zentrifugation bei 16.000 x g für 1 min fort, um die RNA zu eluieren.

6. RNA-Konzentration und -Qualität

1. Verwenden Sie einen Bioanalysator, um die Qualität und Quantität der extrahierten RNA¹⁰ zu beurteilen.

7. Speicherung und weitere Analyse

1. Lagern Sie die RNA bei -80 °C (bis zu 1 Jahr) bis zur weiteren Analyse (z. B. Microarray, quantitative PCR (qPCR) und RNA-seq usw.).
   HINWEIS: Einzelheiten zur qPCR-Analyse, einschließlich der cDNA-Synthese, finden Sie in Lyu et ^al.11. Primer für qPCR sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Ergebnisse

Die Gli1-CreER^T2-Maus (Jackson Lab Stock Number: 007913) wurde zuerst mit der NuTRAP-Reportermaus (Jackson Lab Stock Number: 029899) gekreuzt, um Doppelmutantenmäuse zu erzeugen. Mäusen, die beide gentechnisch veränderten Genallele (d.h. Gli1-CreER^T2 und NuTRAP) trugen, wurde Tamoxifen einmal täglich, jeden zweiten Tag, für drei Injektionen injiziert. Die Gewebeproben wurden am 7. Tag nach dem 1^{. Tag der} Injektion entnommen^. Die Immunfluoreszenza...

Diskussion

Die Nützlichkeit der Ganzgewebe-Transkriptom-Analyse könnte gedämpft werden, insbesondere bei der Untersuchung komplexer heterogener Gewebe. Wie man zelltypspezifische RNAs erhält, wird zu einer dringenden Notwendigkeit, die leistungsstarke RNA-seq-Technik zu entfesseln. Die Isolierung zelltypspezifischer RNAs beruht in der Regel auf der Sammlung eines bestimmten Zelltyps mittels Mikromanipulation, fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM)¹⁸. Andere ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actb	eurofins	qPCR primers	ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
Bioanalyzer	Agilent	2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Millipore	11836170001
cycloheximide	Millipore	239764-100MG
Cyp11a1	eurofins	qPCR primers	CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTP	Thermo Fisher Scientific	R0191
DTT, Dithiothreitol	Thermo Fisher Scientific	P2325
DynaMag-2 magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
Falcon tubes 15 mL	VWR	89039-666
GFP antibody	Abcam	ab290
Glass grinder set	DWK Life Sciences	357542
heparin	BEANTOWN CHEMICAL	139975-250MG
Hsd3b	eurofins	qPCR primers	GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KCl	Biosciences	R005
MgCl2	Biosciences	R004
Microcentrifuge tubes 2 mL	Thermo Fisher Scientific	02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarrays	Thermo Fisher Scientific		Microarray service
NP-40	Millipore	492018-50 Ml
oligo (dT)20	Invitrogen	18418020
PicoPure RNA Isolation Kit	Thermo Fisher Scientific	KIT0204
Protein G Dynabead	Thermo Fisher Scientific	10003D
RNase-free water	growcells	NUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019
Sox9	eurofins	qPCR primers	TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptase	Invitrogen	18090050
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155
Sycp3	eurofins	qPCR primers	GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
Tris	Alfa Aesar	J62848