JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozomal mRNA'ları izole etmeyi amaçlamaktadır.

Özet

Hücresel heterojenlik, transkriptom düzeyinde karmaşık dokuların işlevini anlamada zorluklar yaratır. Hücre tipine özgü RNA'ların kullanılması, dokuların heterojenliğinin neden olduğu potansiyel tuzakları önler ve güçlü transkriptom analizini serbest bırakır. Burada açıklanan protokol, ribozoma bağlı RNA'ları, hücre sıralaması olmadan karmaşık bir dokudaki az miktarda EGFP eksprese eden hücrelerden izole etmek için Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yönteminin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu protokol, yakın zamanda mevcut olan NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü RNA'ları izole etmek için uygundur ve RNA'ları herhangi bir EGFP eksprese eden hücreden izole etmek için de kullanılabilir.

Giriş

RNA dizilimi (RNA-seq) ve mikroarray dahil olmak üzere yüksek verimli yaklaşımlar, gen ekspresyon profillerinin genom çapında sorgulanmasını mümkün kılmıştır. Kalp, beyin ve testis gibi karmaşık dokular için, hücre tipine özgü veriler, RNA'ların tüm dokudaki kullanımını karşılaştıran daha fazla ayrıntı sağlayacaktır 1,2,3. Hücresel heterojenliğin etkisinin üstesinden gelmek için, Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yöntemi 2010'ların başından berigeliştirilmiştir4. TRAP, ribozoma bağlı RNA'ları doku ayrışması olmadan spesifik hücre tiplerinden izole edebilir. Bu yöntem, Drosophila embriyoları5'te son derece nadir görülen bir kas hücresi popülasyonunu hedeflemek, Arabidopsis thaliana6 model bitkisindeki farklı kök hücreleri incelemek ve memelilerde endotel hücrelerinin transkriptom analizini yapmak da dahil olmak üzere farklı organizmalarda translatom (çeviri için ribozoma alınan mRNA'lar) analizi için kullanılmıştır7.

TRAP, bir model organizmanın ribozomunu etiketlemek için genetik bir modifikasyon gerektirir. Evan Rosen ve meslektaşları yakın zamanda Jackson Laboratuvarı'nda 2017'den beri mevcut olan Nükleer etiketleme ve Çeviri Ribozom Afinite Saflaştırma (NuTRAP) fare8 adlı bir fare modeli geliştirdiler. Bir Cre fare çizgisiyle geçerek, araştırmacılar bu NuTRAP fare modelini, ribozom bağlı RNA'ları ve hücre çekirdeklerini, hücre sıralama olmadan Cre-eksprese eden hücrelerden izole etmek için kullanabilirler. NuTRAP alelini de taşıyan Cre-eksprese eden hücrelerde, EGFP / L10a etiketli ribozom, afinite pulldown tahlilleri kullanarak mRNA'ların çevrilmesinin izolasyonuna izin verir. Aynı hücrede, aynı zamanda mCherry pozitif olan biyotin ligaz tanıma peptidi (BLRP) etiketli nükleer membran, afinite veya floresan bazlı saflaştırma kullanarak nükleer izolasyona izin verir. Aynı araştırma ekibi, nükleer membranın sadece biyotin8 içermeyen mCherry ile etiketlendiği benzer bir fare hattı da üretti. Genetiği değiştirilmiş bu iki fare çizgisi, ilgilenilen belirli hücre tiplerinin eşleştirilmiş epigenomik ve transkriptomik profillerini karakterize etmek için erişim sağlar.

Kirpi (Hh) sinyal yolu doku gelişiminde kritik bir rol oynar9. GLI ailesinin bir üyesi olan GLI1, transkripsiyonel bir aktivatör görevi görür ve Hh sinyaline aracılık eder. Gli1 + hücreleri, adrenal bez ve testis de dahil olmak üzere birçok hormon salgılayan organda bulunabilir. NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü DNA'ları ve RNA'ları Gli1 + hücrelerinden izole etmek için, Gli1-CreERT2 fareleri NuTRAP fareleri ile çaprazlandı. Shh-CreERT2 fareleri, sonik kirpi (Shh) eksprese eden hücreleri izole etmeyi amaçlayan NuTRAP fareleri ile de geçti. Aşağıdaki protokol Gli1-CreERT2'nin nasıl kullanılacağını gösterir; NuTRAP fareleri, yetişkin fare testislerinde ribozoma bağlı RNA'ları Gli1 + hücrelerinden izole etmek için kullanılır.

Protokol

Yapılan tüm hayvan deneyleri, Auburn Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanan protokolleri takip etti.

NOT: Aşağıdaki protokol, Gli1-CreERT2'den P28'de bir testis (yaklaşık 100 mg) kullanır; NuTRAP fareleri (Mus musculus). Reaktiflerin hacimlerinin, numune tiplerine ve doku sayısına göre ayarlanması gerekebilir.

1. Doku toplama

  1. Bir CO2 odası kullanarak fareleri ötenazileştirin,% 70 etanol ile karın yüzeyini sterilize edin.
  2. Alt karın bölgesini makasla açın ve testisleri çıkarın. Testisleri hemen çıtçıtlamak için sıvı azot (LN2) kullanın.
  3. Numuneleri kullanıma kadar LN2'nin buhar fazında saklayın.

2. Reaktifler ve boncuk hazırlama

  1. Homojenizasyon stok çözeltisini hazırlayın: 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, %1 NP-40 ve 1 mg/mL heparin ekleyin. Çözeltiyi kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın (1 aya kadar).
  2. Homojenizasyon çalışma tamponunu kullanımdan önce stok çözeltisinden (adım 2.1) taze olarak hazırlayın: Homojenizasyon çalışma tamponunun gerekli miktarını yapmak için homojenizasyon stok çözeltisine DTT (son konsantrasyon: 1 mM), sikloheksimid (son konsantrasyon: 100 μg / mL), rekombinant ribonükleaz (son konsantrasyon: 200 ünite / mL) ve proteaz inhibitörü kokteyli (son konsantrasyon: 1x) ekleyin. Taze hazırlanmış çalışma tamponunu kullanana kadar buz üzerinde saklayın.
  3. Düşük tuzlu ve yüksek tuzlu yıkama tamponlarını hazırlayın:
    1. Düşük tuzlu yıkama tamponu hazırlamak için 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl ve% 1 NP-40 karışımı. Kullanmadan önce DTT (son konsantrasyon: 1 mM) ve sikloheksimid (son konsantrasyon: 100 μg / mL) ekleyin.
    2. Yüksek tuzlu yıkama tamponu karışımı hazırlamak için 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl,% 1 NP-40. Kullanmadan önce DTT (son konsantrasyon: 2 mM) ve Sikloheksimid (son konsantrasyon: 100 μg / mL) ekleyin.
  4. Protein G boncukları hazırlayın (Malzeme Tablosu):
    1. Her numunenin 50 μL protein G boncuğuna ihtiyacı olacaktır. Gerekli miktarda boncuğu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpe yerleştirin ve tüpü rafta 30-60 s bırakarak manyetik bir raf kullanarak boncukları çözeltiden ayırın.
    2. Süpernatantı pipetle ile çıkarın. Boncukları her seferinde 1 mL buz gibi soğuk düşük tuzlu yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.

3. Doku lizisi ve homojenizasyon

  1. Bir cam doku öğütücü setine 2 mL buz gibi soğuk homojenizasyon çalışma tamponu (adım 2.2'den itibaren taze hazırlanmış) ekleyin. Dondurulmuş numuneyi hızlı bir şekilde öğütücüye yerleştirin ve gevşek bir havane kullanarak dokuyu buz üzerinde 30 vuruşla homojenleştirin.
  2. Homojenatı 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir boruya aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
  3. Süpernatantı yeni bir 2 mL tüpe aktarın. "Giriş" olarak 1,5 mL'lik bir tüpe 100 μL kaydedin.
  4. 2 mL tüpteki süpernatantı 4 °C'de anti-GFP antikoru (5 μg / mL; 1:400) ile gece boyunca uçtan uca bir rotatörde (24 rpm) inkübe edin.

4. İmmünsüpresipitasyon

  1. Homojenat/antikor karışımını, adım 2.4'ten itibaren yıkanmış protein G boncuklarını içeren yeni bir 2 mL yuvarlak tabanlı tüpe aktarın. 4 °C'de uçtan uca bir rotatörde (24 rpm) 2 saat boyunca inkübe edin.
  2. Manyetik boncukları bir mıknatıs rafı kullanarak süpernatanttan ayırın. Süpernatantı "negatif fraksiyon" olarak kaydedin. Negatif fraksiyon (1) EGFP-negatif hücrelerdeki RNA'ları ve (2) ribozomlara bağlı olmayan EGFP-pozitif hücrelerdeki RNA'ları içerir.
  3. Boncuklara 1 mL yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve boncukları yıkamak için tüpü kısaca vorteksleyin. Tüpü bir mıknatıs rafına yerleştirin.
  4. Yıkama tamponunu çıkarın. Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Boncuklar şimdi EGFP-pozitif hücrelerden boncuk-ribozom-RNA kompleksini içeriyor.

5. RNA ekstraksiyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar RNA izolasyon kitinden uyarlanmıştır (Malzeme Tablosu). Her fraksiyonu (yani girdi, pozitif ve negatif) bağımsız bir örnek olarak ele alın ve RNA'ları bağımsız olarak izole edin.

  1. RNA'ları boncuklardan serbest bırakmak için 4.4. adımdaki boncukları bir termomikserde (42 ° C, 500 rpm) 50 μL Ekstraksiyon Tamponu (RNA izolasyon kitinden) ile 30 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Boncukları bir mıknatıs rafı ile ayırın, boncuk-ribozom-RNA kompleksini içeren süpernatantı 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  3. Tüpü 2 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj edin, ardından süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe pipetleyin. Bu tüp TRAP adımının "pozitif fraksiyonunu" içerir.
    NOT: Giriş ve negatif fraksiyonlar için, 1 mL Ekstraksiyon Tamponu kullanarak 25 μL numuneden RNA ekstrakte edin. Bir termomikserde (42 °C, 500 rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin.
  4. RNA saflaştırma kolonunun ön koşulu: Saflaştırma kolonuna 250 μL Koşullandırma Tamponu pipeti. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın. Kolonu 1 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın.
  5. Pipet, adım 5.3'ten itibaren süpernatanta eşit hacimde% 70 EtOH (pozitif fraksiyon için% 70 EtOH'nin yaklaşık 50 μL'si ve giriş ve negatif fraksiyonlar için% 70 EtOH'nin 1 mL'si). Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.
  6. Karışımı adım 5.4'ten itibaren sütuna pipetleyin.
  7. RNA'nın kolondaki zara bağlanmasına izin vermek için kolonu 2 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın, ardından hemen 30 s boyunca 16.000 x g'de santrifüje devam edin. Akış akışını atın.
    NOT: Giriş ve negatif fraksiyonlar için, her seferinde kolona 250 μL karışım ekleyin. Tüm karışımlar kullanılıncaya kadar 5.6 ve 5.7 numaralı adımları tekrarlayın.
  8. Pipet 100 μL Yıkama Tamponu 1 (W1) kolona ve 1 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.
  9. 75 μL DNaz çözeltisi pipeti doğrudan arıtma kolon membranına karışır. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  10. Pipet, kolona 40 μL W1 ve 30 s için 8.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.
  11. Pipet kolona 100 μL Yıkama Tamponu 2 (W2) ve 1 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.
  12. Pipet kolona 100 μL W2 ve 2 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın. Elüsyon adımından önce tüm yıkama tamponu izlerini gidermek için aynı sütunu 16.000 x g'da 1 dakika boyunca yeniden santrifüj edin.
  13. Kolonu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  14. Pipet, 12 μL RNaz içermeyen suyu doğrudan arıtma kolonunun membranına yerleştirin. Pipet ucu membrana temas etmemelidir. RT'de 1 dakika boyunca inkübe edin ve 1 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj yapın. Daha sonra RNA'yı etkisiz hale getirmek için 1 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjlemeye devam edin.

6. RNA konsantrasyonu ve kalitesi

  1. Ekstrakte edilen RNA10'un kalitesini ve miktarını değerlendirmek için bir biyoanalizör kullanın.

7. Depolama ve daha fazla analiz

  1. RNA'yı daha fazla analize kadar -80 ° C'de (1 yıla kadar) saklayın (örneğin, mikrodizi, kantitatif PCR (qPCR) ve RNA-sek, vb.).
    NOT: cDNA sentezi de dahil olmak üzere qPCR analizinin ayrıntıları için Lyu ve ark.11'e bakınız. qPCR için astarlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

Sonuçlar

Gli1-CreERT2 fare (Jackson Lab Stok Numarası: 007913) ilk olarak çift mutant fareler üretmek için NuTRAP muhabir faresi (Jackson Lab Stok Numarası: 029899) ile çaprazlandı. Her iki genetiği değiştirilmiş gen alellerini (yani, Gli1-CreERT2 ve NuTRAP) taşıyan farelere, üç enjeksiyon için günde bir kez, her gün tamoksifen enjekte edildi. Doku örnekleri, enjeksiyonun 1. gününden sonraki 7. günde toplandı. İmmünofloresan analizi, E...

Tartışmalar

Tüm doku transkriptom analizinin yararlılığı, özellikle karmaşık heterojen dokuları incelerken azaltılabilir. Hücre tipine özgü RNA'ların nasıl elde edileceği, güçlü RNA-seq tekniğini ortaya çıkarmak için acil bir ihtiyaç haline gelir. Hücre tipine özgü RNA'ların izolasyonu genellikle mikromanipülasyon, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) kullanılarak belirli bir hücre tipinin toplanmasına dayanır18. Diğe...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen NIH R00HD082686 tarafından desteklenmiştir. Endokrin Derneği Yaz Araştırma Bursu'na H.S.Z.'ye teşekkür ederiz. Ayrıca fare kolonisini yetiştirdiği ve koruduğu için Dr. Yuan Kang'a teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ActbeurofinsqPCR primersATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer)
BioanalyzerAgilent2100 Bioanalyzer Instrument
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMillipore11836170001
cycloheximideMillipore239764-100MG
Cyp11a1eurofinsqPCR primersCTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)
dNTPThermo Fisher ScientificR0191
DTT, DithiothreitolThermo Fisher ScientificP2325
DynaMag-2 magnetThermo Fisher Scientific12321D
Falcon tubes 15 mLVWR89039-666
GFP antibodyAbcamab290
Glass grinder setDWK Life Sciences357542
heparinBEANTOWN CHEMICAL139975-250MG
Hsd3beurofinsqPCR primersGACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer)
KClBiosciencesR005
MgCl2BiosciencesR004
Microcentrifuge tubes 2 mLThermo Fisher Scientific02-707-354
Mouse Clariom S Assay microarraysThermo Fisher ScientificMicroarray service
NP-40Millipore492018-50 Ml
oligo (dT)20Invitrogen18418020
PicoPure RNA Isolation KitThermo Fisher ScientificKIT0204
Protein G DynabeadThermo Fisher Scientific10003D
RNase-free watergrowcellsNUPW-0500
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease InhibitorThermo Fisher Scientific10777019
Sox9eurofinsqPCR primersTGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer
Superscript IV reverse transcriptaseInvitrogen18090050
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4309155
Sycp3eurofinsqPCR primersGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer)
TrisAlfa AesarJ62848

Referanslar

  1. Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
  2. Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
  3. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  4. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  5. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
  6. Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
  7. Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
  8. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  9. Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
  10. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
  11. Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  14. Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
  15. Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
  16. Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
  17. Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
  18. Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  19. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  20. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
  21. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
  22. Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
  23. Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 178h cre tipine zg RNAribozom afinite safla t rmas n n evrilmesitestismikrodiziEGFPGli1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır