السابقين فيفو التروية الكبدية من خلال الوريد البابي في الماوس

Summary

يصف البروتوكول طريقة مباشرة لاستئصال كبد الفأر السليم للدراسات الأيضية من خلال تروية الوريد البابي.

Abstract

أصبحت الأمراض الأيضية مثل مرض السكري ، وما قبل السكري ، ومرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والتهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) شائعة بشكل متزايد. تسمح عمليات تروية الكبد خارج الجسم الحي بإجراء تحليل شامل لعملية التمثيل الغذائي للكبد باستخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، في الظروف الغذائية التي يمكن التحكم فيها بدقة. كما هو الحال في محاكاة سيليكو لا تزال وسيلة نظرية في المقام الأول لتقييم الإجراءات الهرمونية وآثار التدخل الصيدلاني، والكبد perfed لا تزال واحدة من أسرة الاختبار الأكثر قيمة لفهم التمثيل الغذائي الكبدي. نظرا لأن هذه الدراسات توجه الأفكار الأساسية في فسيولوجيا الكبد ، يجب أن تكون النتائج دقيقة وقابلة للتكرار. أكبر عامل في تكرار التروية الكبدية خارج الجسم الحي هو جودة الجراحة. لذلك ، أدخلنا طريقة منظمة ومبسطة لإجراء عمليات تروية كبد الفئران خارج الجسم الحي في سياق تجارب الرنين المغناطيسي النووي في الموقع . كما نصف تطبيقا فريدا ونناقش المشكلات الشائعة التي تمت مواجهتها في هذه الدراسات. الغرض العام هو توفير دليل غير معقد لتقنية قمنا بتحسينها على مدى عدة سنوات والتي نعتبرها المعيار الذهبي للحصول على نتائج قابلة للتكرار في عمليات استئصال الكبد والتروية في سياق تجارب الرنين المغناطيسي النووي في الموقع . المسافة إلى مركز المجال للمغناطيس وكذلك عدم إمكانية وصول الأنسجة إلى التدخل أثناء تجربة الرنين المغناطيسي النووي تجعل أساليبنا جديدة.

Introduction

تعتبر التروية خارج الجسم الحي حاسمة في دراسة التمثيل الغذائي الكبدي ، والتروية من خلال الوريد البابي هو المعيار لهذه الدراسات. من أجل دراسة التمثيل الغذائي الكبدي بمعزل عن الآخرين ، يجب استئصال الكبد من الجسم لتجنب المضاعفات الناشئة عن التمثيل الغذائي في الأعضاء الأخرى (أي التمثيل الغذائي للجسم كله) وممارسة السيطرة على توافر الهرمونات (الأنسولين ، الجلوكاجون ، إلخ). يمكن أن يكون هذا النهج ضروريا لفهم آثار أمراض مثل السكري و NAFLD و NASH على التمثيل الغذائي الكبدي وكذلك آليات عمل الدواء. هذه المقالة بمثابة دليل لاستئصال الكبد والتروية. لقد طورنا إجراء مبسطا لإجراء دراسات الكبد الأيضية هذه بدقة كافية وقابلية للتكرار. إذا لم يتم إجراء الجراحة بشكل صحيح ، فهناك تباين واضح في البيانات الأيضية التي تم الحصول عليها. نحن نصف طريقة منظمة لإجراء قسطرة الوريد البابي واستئصال الكبد في سياق الدراسات الأيضية في الموقع في مطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، كما هو موضح في الأدبيات¹،²،^3،4،5.

حاليا ، لا توجد أدبيات تصف تروية كبدية خارج الجسم الحي باستخدام عمود زجاجي داخل الرنين المغناطيسي النووي. كما لا يوجد فيديو أو منشور نصي يقدم مثالا واضحا على كيفية تنفيذ الإجراء مع كبد الفأر ، على وجه التحديد ، يوضح كيفية قسطرة الوريد البابي ، واستئصال الكبد ، ونقله ، وتعليقه على عمود زجاجي. نظرا لأن الفأر المعدل وراثيا يستخدم في كل مكان لدراسة استقلاب الكبد ، فهذا إجراء أساسي يستحق وصفا كاملا. جراحات تروية الكبد ليست جديدة ، ولكن هذه المقالة هي طريقة قياسية ذهبية مصحوبة بمقطع فيديو يوضح التميز التقني الموصوف في هذه الورقة لمساعدة جميع المهتمين بهذا الإجراء. من الأفضل تطبيق الطريقة المعروضة هنا على التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي للكشف عن وظيفة ودوران المستقلبات في نماذج الأمراض.

تستخدم هذه الطريقة عمودا زجاجيا مغطى بالماء يبلغ طوله 100 سم ، مما يسمح للكبد بالتعليق في الجزء السفلي من القنية المغلفة بواسطة النفخ داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. يتم استخدام الماء الساخن في السترة الزجاجية للتحكم في درجة حرارة العطر. يتم ضغط الأوكسجين ذو الطبقة الرقيقة بنسبة 95٪ / 5٪ O 2 / CO₂ للتحكم في درجة الحموضة. باستخدام ثلاث مضخات منفصلة ، يتم ضبط ارتفاع عمود perfusate ، مما يوفر ضغطا ثابتا على الكبد. لا يتم التحكم في معدلات التدفق خارج نطاق تطبيق الضغط الثابت (الشكل 1). للتأكد من أن الكبد يعمل بشكل مناسب ، يتم أخذ قياسات الأكسجين جنبا إلى جنب مع معدلات التدفق. في أيدينا ، تؤدي هذه المجموعة من الشروط المسبقة إلى تجارب NMR قابلة للتكرار للغاية لتقييم وظيفة التمثيل الغذائي للكبد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم التعامل مع التجارب التي شملت الفئران وفقا للجنة جامعة فلوريدا المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (رقم البروتوكول #201909320). كانت سلالة الماوس المستخدمة هي C57BL/6J. جميع الفئران كانت من الذكور. تنطبق هذه الطريقة بشكل عام على الدراسات التي تستخدم سلالات الماوس القياسية الأخرى أيضا. يتم إجراء هذه الجراحة على النحو الأمثل من قبل شخصين يعملان معا.

1. الإعداد الأولي

1. تنصهر الأكباد مع الفوسات التي تحتوي على الإلكتروليتات كريبس-هينسليت 6 (25 ملليمتر NaHCO₃ ، 112 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، 4.7 ملم KCl ، 1.2 ملم لكل من MgSO 4 ، KH 2 PO₄ ، و 0.5 ملم الصوديوم-EDTA ، 1.25 ملم كاكل 2) ، 6 مللاكتات الصوديوم ،^0.6 ملليمتر بيروفات الصوديوم ، 0.2 ملم [U-13 C] بروبيونات الصوديوم ، ¹⁰٪ (v / v) D₂ O ، و 0.63 مللي متر من الأحماض الدهنية المختلطة (التي تحتوي على حمض البالمتيك (22.1٪ من المجموع) ، وحمض البالميتوليك (5.2٪) ، وحامض دهني (2.7٪) ، وحمض الأوليك (27٪) ، وحمض اللينوليك (37.7٪) ، وحمض γ اللينولينيك (2.4٪) ، وحمض ديكوساهيكسانويك (2.8٪)) إلى جانب 2٪ (ث / v) ألبومين مصل البقر. اضبط الرقم الهيدروجيني النهائي للعطر على 7.3 باستخدام HCl (و NaOH ، إذا لزم الأمر).

2. إعداد ما قبل الجراحة

1. قم بتجميع حقنتين سعة 1 مل بإبرة 23G يبلغ طولها 19.05 مم. املأ حقنة واحدة ب 0.01 مل من 1000 وحدة / مل من الهيبارين و 0.19 مل من محلول ملحي (0.9٪ (ث / v) كلوريد الصوديوم في الماء ؛ الجدول 1).
2. املأ المحقنة الثانية ب 0.2 مل من ليدوكائين 2٪ و 0.6 مل من محلول ملحي بنسبة 0.9٪ (الجدول 1). في حقنة أخرى سعة 1 مل مع إبرة 27 جم 38.1 مم ، املأ بالعطر وحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.

3. إعداد عمود العطر

1. ضع الزجاجة الزجاجية التي تحتوي على 500 مل من العطر في الحمام المائي (الشكل 1B). قم بتشغيل الحمام المائي واضبط درجة الحرارة على ~ 42 درجة مئوية. تتيح درجة الحرارة المرتفعة في الحمام المائي الحفاظ على 37 درجة مئوية في عمود التروية.
2. بمجرد أن يسخن الماء حتى 42 درجة مئوية ، قم بتشغيل المضختين لتدوير العطر من الزجاجة في جميع أنحاء جهاز الأكسجين الرقيق والعمود الزجاجي المغطى بالماء مقاس 100 سم (الشكل 1A-E).
3. قم بتشغيل غاز الأكسجين (95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون) للضغط على جهاز الأكسجين⁷ (الشكل 1C). اضبط ارتفاع عمود البيرفوسات لتحقيق معدل تدفق يبلغ 8 مل / دقيقة مع توصيل القسطرة (انظر الخطوة 9 لقياس معدل التدفق)⁵،^8،9.
   ملاحظة: يشير معدل التدفق إلى المعدل الذي يتم به طرد البيرفوسات بواسطة الكبد.

4. تخدير الفأر

1. دون معدات الوقاية الشخصية كما هو مطلوب من قبل بروتوكول IACUC وغيرها من إرشادات السلامة المناسبة.
   ملاحظة: تم تحسين الخطوات التالية للفئران التي يتراوح عمرها بين 9 و 13 أسبوعا.
2. ضع الماوس في غرفة الايزوفلوران. حول غاز التوصيل إلى أكسجين 100٪ ، بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة ، والأيزوفلوران إلى 2٪ ¹⁰. انتظر حتى يتباطأ التنفس ويكون ثابتا.
   ملاحظة: لكي يصل الماوس إلى مستوى جراحي مستقر ، كما يتضح من معدل التنفس البطيء والثابت وعدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم ، يمكن ضبط معدل تدفق الأكسجين إلى ~ 1.5 لتر / دقيقة إلى ~ 3 لتر / دقيقة وتركيز الأيزوفلوران من 1 - 3٪. يعتمد معدل توصيل الغاز الناقل وتركيز الأيزوفلوران على عمر الحيوان ووزنه وعوامل مثل الضوضاء والضوء.
3. تطهير البطن مع 70 ٪ من الكحول. إدارة الهيبارين من خلال حقن عميق تحت الجلد في طبقة الدهون في البطن (الشكل 2). ضع الماوس مرة أخرى في غرفة التخدير لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: الحلاقة غير مطلوبة لأن هذا الإجراء طرفي.

5. بضع القرنية

1. انقل الفأر من غرفة التخدير إلى منصة الجراحة وضعه في وضع ضعيف (الشكل 3).
2. ضع أنف الماوس في مخروط الأنف وقم بربط الكفوف لأسفل. احرص على عدم وضع أي ضغط على الرقبة قد يؤدي إلى الاختناق.
3. إعطاء يدوكائين من خلال حقن تحت الجلد ثنائيا في منطقة القمة الحرقفية الأمامية¹¹ (الشكل 3). قم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم للتأكد من عدم وجود جميع ردود الفعل المؤلمة.
4. إجراء بضع الاضطرابات الهضمية لفضح الأعضاء الداخلية (الشكل 4). قم بعمل شق بعرض 3 سم (عرض بطن الماوس بأكمله).
   ملاحظة: سيتغير العرض مع عمر الماوس ونظامه الغذائي.
5. قم بتوسيع الشق باستخدام مرقئ يسحب الجر عن طريق تثبيت عملية الخناق (الشكل 4).

6. تعليب الوريد البابي

1. استخدم قضيب ذو رأس قطني لتنظيف الأمعاء الدقيقة والغليظة التي تغطي الوريد البابي. ضع خياطة حريرية تحت قوس الوريد البابي القريب من الكبد (الشكل 4A).
2. اعتمادا على البنية التشريحية ، ضع خياطة الحرير الثانية القريبة أو البعيدة من الوريد المساريقي السفلي البعيد عن الكبد (الشكل 4A)^12,13. استخدم خياطة 2-0 لكلا الغرزتين.
3. بمجرد أن تكون الغرز في مكانها ، قم بتقليب الوريد البابي باستخدام قسطرة 22G¹⁴ (الشكل 4B). عند إدخال القسطرة، حافظ على الشطبة مدببة لأعلى. أدخل الوريد البابي بزاوية لا تزيد عن 15 درجة.
4. اربط الخيط الأول بعد نقرة القسطرة. بعد أن يتم تعليب الوريد البابي ، قم بتثبيت القسطرة 2-3 مم بعيدة عن فرع الوريد البابي باستخدام خياطة الحرير (الشكل 4B).
   ملاحظة: يجب على المساعد لف الكتفين والمعصمين لمنع إزاحة القسطرة أو تمزق الوريد البابي. كل خياطة تتطلب عقدتين.
5. بعد ذلك ، قم بتأمين الجزء السفلي من القسطرة باستخدام الخياطة الثانية. بمساعدة المساعد الجراحي ، اربط عقدة مع الخيط لتثبيت القسطرة على الجزء البعيد من الوريد البابي والأنسجة المحيطة.

7. استئصال الكبد بعد بوابة الوريد القنية

1. بعد تأمين القسطرة، أدخل حقنة سعة 1 مل بإبرة 27G يبلغ طولها 38.1 مم في القسطرة لتدفق فقاعات الدم والهواء.
   ملاحظة: عادة ما يكون هناك تدفق عكسي للدم من القسطرة من الضغط.
2. استخدم أنبوب سيليكون O.D. مقاس 1 مم × 5 مم مع سدادة ثابتة لإقران عمود التروية (الشكل 1A) بالقسطرة مما يسمح بتدفق المخزن المؤقت إلى الكبد بمناسبة بداية التروية. ابدأ تشغيل مؤقت في هذه المرحلة للاحتفال ببداية التروية.
3. تخفيف الضغط الوعائي المتزايد عن طريق إجراء شق ، باستخدام مقص ، في الوريد الأجوف السفلي.
4. تأكد من تدفق العطر عبر الكبد من خلال ملاحظة التغير المتجانس في لون الكبد من الوردي / الأحمر إلى الأصفر الشاحب. بمجرد تأكيد التدفق ، قم باستئصال المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة والكلى اليمنى من الأنسجة المحيطة.
5. بمساعدة المساعد الجراحي ، قم بمناورة الكبد حول تجويف البطن والصدر حيث يقوم الجراح بقطع الصفاق الجداري والأنسجة الصدرية لاستئصال الكبد
6. أخيرا ، ارفع الكبد لأعلى واقطع الأنسجة الضامة المتبقية التي تثبت الكبد في مكانه باستخدام المقص. تعامل ببطء مع الكبد لسهولة الرؤية. قم بإزالة أي فرو يلتصق بالكبد عن طريق الشطف بالعطر قبل تغليفه داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي.
   ملاحظة: في هذا الإجراء، تتم إزالة الكبد فقط. يتم ترك جميع الأعضاء الأخرى في جسم الحيوان. يمكن إزالة القناة الصفراوية بناء على بروتوكول التجربة. على الرغم من أنه بالنسبة لهذه التجربة ، فقد تم تركها في مكانها.

8. تعليق الكبد من العمود

1. بمجرد أن يسلم الجراح الكبد والأنابيب إلى المساعد ، يقوم المساعد بفصل الأنبوب عن القسطرة والعمود.
2. املأ القسطرة بالعطريات حتى يتم تشكيل الغضروف المفصلي في الجزء العلوي من القسطرة. قم بتوصيل القسطرة بالعمود حتى يعلق الكبد ويتلصص.
   ملاحظة: توفر حبة البيرفوسات الموجودة على القسطرة حجما كافيا للكبد ليعمل حتى يتم توصيله. يتم تركيب القسطرة المتصلة بالكبد في أسفل العمود.
3. قم بربط أنبوب NMR مقاس 20 مم على العمود الزجاجي مقاس 100 سم لتغليف الكبد (الشكل 5). لتجنب التواء الكبد والوريد البابي ، قم بالمسمار ببطء على أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. في حالة حدوث التواء وتوقف التدفق ، قم بفك أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وإعادة ضبطه. هذا سوف يعالج الانسداد وسيعود التدفق.
4. قم بفحص الكبد لمدة 30-60 دقيقة بناء على تفاصيل الدراسة.
   ملاحظة: يعتمد الوقت على تجربة التروية. بالنسبة لهذه التجربة ، تم قياس معدل دوران التمثيل الغذائي في غضون 30 دقيقة. يمكن أن يستغرق تروية الكبد ما يصل إلى 10 دقائق للوصول إلى حالة مستقرة. يبدأ وقت الحالة المستقرة بمجرد قطع الوريد الأجوف السفلي وإنشاء التدفق الكبدي.

9. قياس التدفق

1. ضع قارب وزن على ميزان تحميل علوي وصفر الرصيد. ضع الأنابيب من مضخة الأسطوانة التي تسحب العطر من الرنين المغناطيسي النووي إلى قارب الوزن وابدأ تشغيل المؤقت.
2. وزن كتلة السائل المتراكمة على مدى 1 دقيقة مما يؤدي إلى معدل تدفق الكبد. ضع الأنبوب مرة أخرى في حاوية النفايات / التجميع.

10. قياس الأكسجين

ملاحظة: تم إعداد قياسات مقياس الأكسجين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة^{رقم 15}.

1. ضع القطب الذي يحتوي على 20 ميكرولتر من محلول مشبع KCl بنسبة 50٪ على القبة البلاتينية وضع خمس قطرات 10 ميكرولتر حول الحلقة البلاتينية السفلية للقطب الكهربائي.
2. قم بإزالة المادة اللاصقة من ورق السجائر. ضع قطعة من غشاء البولي تترافلورو إيثيلين فوق ورق السجائر.
3. ضع القطعتين فوق القطب الكهربائي. تناسب حلقة O صغيرة حول الجزء العلوي من القطب الكهربائي. قم بقص الورق لوضعه بشكل مسطح على الحلقة البلاتينية السفلية على القطب الكهربائي.
   ملاحظة: بعض التراكم مقبول. من الضروري تغطية فضة القطب الكهربائي.
4. ضع الحلقة O الأكبر على القطب الكهربائي. قم بإقران القطب الكهربائي بغرفة الماء وشد القاعدة لتثبيت القطب الكهربائي في مكانه. قم بتشغيل الحمام المائي واتركه يسخن حتى 37 درجة مئوية.
5. افتح برنامج مقياس الأكسجين. انقر على معايرة > المياه المشبعة بالهواء. اضبط سرعة التحريك على 75 ودرجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
6. املأ قارورة سعة 50 مل في منتصف الطريق بالماء ورجها بقوة لمدة 2 دقيقة. هذا هو الماء المشبع بالهواء ، استخدمه كمعيار 100٪. املأ غرفة مقياس الأكسجين ب ~ 2 مل من الماء وضع السدادة المكونة من قطعتين.
7. انقر فوق موافق على الشاشة واسمح للإشارة بالاستقراء. بمجرد وصول الإشارة إلى هضبة، انقر فوق موافق. تخلص من السائل في الغرفة وجففه بالمناديل الورقية.
8. كرر الخطوات 10.6-10.7 ولكن مع 200 مللي متر كبريتيت الصوديوم (0٪ قياسي). انقر على حفظ المعايرة.
   ملاحظة: لا حاجة إلى اهتزاز قوي لمعيار 0٪.
9. أثناء التروية ، استخدم حقنتين سعة 5 مل. حقنة واحدة لتدوير البيرفوسات (الأكسجين في) والثانية للفوسات efferent من أنبوب الرنين المغناطيسي النووي (الأكسجين خارج).
10. عند إعداد البيرفوسات لكل من القياسات الداخلة والخارجة ، ارسم 3-4 مل في كل مرة.
    ملاحظة: يحتوي هذا العمود على أنابيب زجاجية للسماح بالوصول إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي لسحب العطر الذي تدفق عبر الكبد.
11. قم بقياس العطر المتداول ، أولا تماما مثل الماء في الخطوة 10.6 وتخلص منه في الخطوة 10.7. كرر نفس الخطوات للفوسات العطرية.
12. قم بإجراء قياسات الأكسجين كل 10 دقائق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم تقييم وظائف الكبد في المقام الأول من خلال استهلاك الأكسجين ومعدل التدفق. معدل التدفق من 4-8 مل / دقيقة واستهلاك الأكسجين من 1 ميكرومول / min.g نموذجي. وستختلف هذه التدابير تبعا لظروف تجريبية محددة واختلافات بيولوجية.

تعتمد الكمية الدقيقة من الأيزوفلوران المستخدمة على نوع نظ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هذا الإجراء الجراحي صعب ويتطلب ممارسة واسعة النطاق لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. يجب تعديل الإيسوفلوران والغاز الناقل حسب الحاجة للحفاظ على صلاحية الحيوان من خلال أكبر قدر ممكن من الإجراء الجراحي. البيئة والوقت من اليوم والعمر والوزن والعديد من العوامل الأخرى ستؤثر على التخدير. يمكن أن يؤ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe	N/A	N/A	Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column	N/A	N/A	Custom Made
2-0 Silk Suture	Braintree Scientific	N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety	Terumo	SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26426
4x4 in. Surgical Platform	N/A	N/A	Custom Made
70% Alcohol Wipe	N/A	N/A	Non-specific Brand
Circulating Water Bath	MS Lauda	N/A	Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator	N/A	N/A	Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-0704-06
Lidocaine HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator	Radnoti	N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "	Roboz	RS-6013
Oxygen Meter System	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
Saline 0.9% Solution	N/A	N/A	Saline is made in lab
Scale	N/A	N/A	Non-specific Brand
Variable Speed Analog Console Pump Systems	Cole Palmer	N/A	Models are custom per application
Weigh boats	N/A	N/A	Non-specific Brand