Ex Vivo Перфузия печени через воротную вену у мыши

Резюме

Протокол описывает простой метод резекции интактной печени мыши для метаболических исследований посредством перфузии воротных вен.

Аннотация

Метаболические заболевания, такие как диабет, преддиабет, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) и неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), становятся все более распространенными. Перфузии печени ex vivo позволяют проводить комплексный анализ метаболизма печени с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в условиях питания, которые можно строго контролировать. Поскольку в silico моделирование остается в первую очередь теоретическим средством оценки гормональных действий и эффектов фармацевтического вмешательства, перфузированная печень остается одним из самых ценных испытательных стендов для понимания печеночного метаболизма. Поскольку эти исследования направляют базовое понимание физиологии печени, результаты должны быть точными и воспроизводимыми. Наибольшим фактором воспроизводимости печеночной перфузии ex vivo является качество хирургического вмешательства. Поэтому мы ввели организованный и оптимизированный метод выполнения перфузий печени мышей ex vivo в контексте экспериментов с ЯМР in situ . Мы также описываем уникальное приложение и обсуждаем общие проблемы, возникающие в этих исследованиях. Общая цель состоит в том, чтобы предоставить несложное руководство по технике, которую мы усовершенствовали в течение нескольких лет, которую мы считаем золотым стандартом для получения воспроизводимых результатов в печеночных резекциях и перфузиях в контексте экспериментов in situ ЯМР. Расстояние до центра поля для магнита, а также недоступность ткани для вмешательства во время эксперимента ЯМР делает наши методы новыми.

Введение

Перфузии ex vivo имеют решающее значение в изучении печеночного метаболизма, и перфузия через воротную вену является стандартом для этих исследований. Чтобы изучать печеночный обмен в изоляции, печень должна быть резецирована из организма, чтобы избежать осложнений, возникающих в результате метаболизма в других органах (т. Е. Метаболизм всего тела) и осуществлять контроль над доступностью гормонов (инсулин, глюкагон и т. Д.). Этот подход может иметь важное значение для понимания влияния таких заболеваний, как диабет, НАЖБП и НАСГ, на печеночный метаболизм, а также механизмов действия лекарств. Эта статья служит руководством по печеночной резекции и перфузии. Мы разработали упрощенную процедуру для выполнения этих метаболических исследований печени с достаточной строгостью и воспроизводимостью. Если операция выполнена неправильно, наблюдается выраженная вариабельность полученных метаболических данных. Описан организованный метод выполнения портальной катетеризации вен и резекции печени в контексте метаболических исследований in situ в спектрометре ядерного магнитного резонанса (ЯМР), описанный в ^{литературе} 1,2,3,4,5.

В настоящее время нет литературы, описывающей перфузию печени ex vivo с использованием стеклянной колонки в ЯМР. Также нет видео или текстовой публикации, предоставляющей четкий пример того, как выполнять процедуру с печенью мыши, в частности, демонстрирующей, как катетеризировать воротную вену, резецировать печень, переносить и вешать печень на стеклянную колонку. Поскольку генетически модифицированная мышь повсеместно используется для изучения метаболизма печени, это важная процедура, которая заслуживает полного описания. Операции по перфузии печени не новы, но эта статья является методом золотого стандарта, сопровождаемым видео, демонстрирующим техническое совершенство, описанное в этой статье, чтобы помочь всем, кто заинтересован в этой процедуре. Метод, представленный здесь, лучше всего применять к метаболизму в режиме реального времени для обнаружения функции и оборота метаболитов в моделях заболеваний.

Этот метод использует стеклянную колонку с водяной рубашкой длиной 100 см, которая позволяет печени висеть на дне канюли, инкапсулированной перфусатом внутри ЯМР-трубки. Нагретая вода в стеклянной рубашке используется для контроля температуры перфусата. Тонкослойный оксигенатор находится под давлением с 95%/5% O₂/CO₂ для контроля pH. С помощью трех отдельных насосов устанавливается высота колонны перфусата, которая обеспечивает постоянное давление на печень. Расход не контролируется сверх приложения постоянного давления (рисунок 1). Чтобы подтвердить, что печень функционирует надлежащим образом, измерения кислорода проводятся вместе со скоростью потока. В наших руках этот набор предварительных условий приводит к высоковоспроизводимым экспериментам ЯМР для оценки метаболической функции печени.

протокол

Эксперименты с участием мышей проводились в соответствии с Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Флориды (протокол No 201909320). Используемый штамм мыши был C57BL/6J; все мыши были самцами. Этот метод обычно применим и для исследований с использованием других стандартных штаммов мышей. Эта операция оптимально выполняется двумя людьми, работающими вместе.

1. Первоначальная настройка

1. Перфузировать печень перфусатом, содержащим электролиты Krebs-Henseleit⁶ (25 мМ NaHCO₃, 112 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ каждый из MgSO₄, KH₂PO₄ и 0,5 мМ натрия-ЭДТА, 1,25 мМ CaCl₂), 6 мМ лактата натрия, 0,6 мМ пирувата натрия, 0,2 мМ [^U-13C] пропионата натрия, 10% (v/v) D₂O, и 0,63 мМ смешанных жирных кислот (содержащих пальмитиновую кислоту (22,1% от общего числа), пальмитолеиновую кислоту (5,2%), стеариновую кислоту (2,7%), олеиновую кислоту (27%), линолевую кислоту (37,7%), γ-линоленовую кислоту (2,4%) и декозагексановую кислоту (2,8%)) вместе с 2% (мас./об.) бычьим сывороточным альбумином. Установите конечный рН перфусата на 7,3 с использованием HCl (и NaOH, если это необходимо).

2. Предоперационная настройка

1. Соберите два шприца по 1 мл с иглой 23G длиной 19,05 мм. Наполните один шприц 0,01 мл 1000 ед/мл гепарина и 0,19 мл физиологического раствора (0,9% (мас./об.) NaCl в воде; Таблица 1).
2. Наполните второй шприц 0,2 мл 2% лидокаина и 0,6 мл 0,9% физиологического раствора (таблица 1). Еще в 1 мл шприц с иглой 27 г 38,1 мм заполняют перфусатом и выдерживают при 37 °C.

3. Установка перфузатной колонны

1. Поместите стеклянную бутылку, содержащую 500 мл перфусата, на водяную баню (рисунок 1B). Включите водяную баню и установите температуру ~42 °C. Более высокая температура на водяной бане позволяет поддерживать 37 °C в перфузионной колонне.
2. Как только вода нагреется до 42 °C, включите два насоса, чтобы циркулировать перфусат из бутылки по всему тонкопленочному оксигенатору и стеклянной колонне с водяной рубашкой 100 см (рисунок 1A-E).
3. Включите оксигенирующий газ (95% кислорода и 5% углекислого газа) для создания давления в оксигенаторе⁷ (рисунок 1С). Отрегулируйте высоту перфузатной колонны для достижения скорости потока 8 мл/мин с прикрепленным катетером (см. шаг 9 для измерения расхода)^5,8,9.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока относится к скорости, с которой перфусат выводится печенью.

4. Обезболивание мыши

1. Надевайте СИЗ в соответствии с требованиями протокола IACUC и других соответствующих руководящих принципов безопасности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были оптимизированы для мышей в возрасте от 9 до 13 недель.
2. Поместите мышь в изофлурановую камеру. Превратите подаваемый газ в 100% кислород, скорость потока 1 л/мин, а изофлуран до 2%¹⁰. Подождите, пока дыхание не замедлится и не станет устойчивым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы мышь достигла стабильной хирургической плоскости, о чем свидетельствует медленная и устойчивая частота дыхания и отсутствие рефлекса защемления пальцев ног, скорость потока кислорода может быть скорректирована до ~1,5 л/мин до ~3 л/мин, а концентрация изофлунана от 1 до 3%. Скорость подачи газа-носителя и концентрации изофлурана зависит от возраста и веса животного, а также от таких факторов, как шум и свет.
3. Продезинфицируйте живот 70% спиртом. Вводят гепарин через глубокую подкожную инъекцию в брюшной жировой слой (рисунок 2). Поместите мышь обратно в анестезиологическую камеру на 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бритье не требуется, так как эта процедура является терминальной.

5. Целиотомия

1. Перенесите мышь из анестезиологической камеры на хирургическую платформу и поместите ее в положение лежа на спине (рисунок 3).
2. Поместите нос мыши в носовой конус и засуньте лапы вниз. Позаботьтесь о том, чтобы не оказывать никакого напряжения на шею, которое может привести к удушью.
3. Вводят лидокаин через подкожную инъекцию двусторонне в область¹¹ переднего подвздошного гребня (фиг.3). Выполните тест на защемление пальца ноги, чтобы подтвердить отсутствие всех болевых рефлексов.
4. Выполняют целиотомию для обнажения внутренних органов (рисунок 4). Сделайте разрез шириной 3 см (ширина всего брюшка мыши).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина будет меняться в зависимости от возраста и рациона мыши.
5. Расширьте разрез с помощью гемостата, который тянет тягу путем зажима на мечевидном отростке (рисунок 4).

6. Каннуляция воротной вены

1. Используйте аппликатор с хлопковым наконечником, чтобы очистить тонкий и толстый кишечник, покрывающий воротную вену. Расположите шелковый шов под дугой воротной вены проксимально к печени (рисунок 4А).
2. В зависимости от анатомического строения накладывают второй шелковый шов проксимальным или дистальным отделом нижней брыжеечной вены дистально от печени (Рисунок 4А)^12,13. Используйте шов 2-0 для обоих швов.
3. Как только швы будут на месте, каннулируйте воротную вену катетером 22G¹⁴ (рисунок 4B). При введении катетера держите скос направленным вверх. Введите в воротную вену под углом не более 15°.
4. Завяжите первый шов мимо крана катетера. После канюляции воротной вены закрепите катетер на 2-3 мм дистально от ветви воротной вены шелковым швом (рисунок 4В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Помощник должен свернуть плечи и запястья, чтобы предотвратить смещение катетера или разрыв воротной вены. Для каждого шва требуется два узла.
5. Далее закрепите нижнюю часть катетера вторым швом. С помощью ассистента хирурга завяжите узел шовом, чтобы закрепить катетер на дистальной части воротной вены и окружающих тканях.

7. Резекция печени после портальной канюляции вен

1. После того, как катетер закреплен, вставьте шприц 1 мл с иглой 27G длиной 38,1 мм в катетер для промывки пузырьков крови и воздуха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно наблюдается обратный поток крови из катетера от давления.
2. Используйте силиконовую трубку 1 мм I.D. x 5 мм O.D. с фиксированным запорным краном, чтобы соединить перфузионную колонну (рисунок 1A) с катетером, позволяющим потоку буфера в печень отмечать начало перфузии. Запустите таймер на этом этапе, чтобы отметить начало перфузии.
3. Снять повышенное сосудистое давление, сделав разрез, используя ножницы, в нижнюю полую вену.
4. Подтверждают поступление перфусата через печень, наблюдая однородное изменение цвета печени от розового/красного до бледно-желтого. Как только поток подтвердится, иссекните желудок, тонкую кишку, толстую кишку и правую почку из окружающих тканей.
5. С помощью ассистента хирурга маневрируйте печенью вокруг брюшной и грудной полости, поскольку хирург разрезает теменную брюшину и грудную ткань, чтобы резецировать печень
6. Наконец, поднимите печень вверх и отрежьте оставшиеся соединительные ткани, удерживающие печень на месте, ножницами. Медленно манипулируйте печенью для удобства зрения. Удалите любую шерсть, которая прилипает к печени, смыв перфусатом, прежде чем инкапсулировать его в трубку ЯМР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой процедуре удаляется только печень. Все остальные органы остаются в теле животного. Желчный проток может быть удален на основании протокола эксперимента. Хотя для этого эксперимента его оставили на месте.

8. Подвешивание печени к колонке

1. Как только хирург передает печень и трубку помощнику, помощник отсоединяет трубку от катетера и колонки.
2. Заполните катетер перфусатом до тех пор, пока на верхней части катетера не образуется мениск. Прикрепите катетер к колонке, чтобы печень зависла и перфузировала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шарик перфузата на катетере обеспечивает достаточный объем для функционирования печени до момента ее соединения. Катетер, прикрепленный к печени, прижимается к нижней части колонки.
3. Прикрутите 20-миллиметровую ЯМР-трубку к стеклянной колонне диаметром 100 см, чтобы инкапсулировать печень (рисунок 5). Чтобы избежать перекрута печени и воротной вены, медленно вкрутите трубку ЯМР. Если кручение все-таки происходит и поток прекращается, открутите и открутите ЯМР-трубку. Это устранит окклюзию, и поток вернется.
4. Перфузируйте печень в течение 30-60 мин на основе деталей исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время основано на эксперименте с перфузией. Для этого эксперимента метаболический оборот измеряли в течение 30 мин. Перфузия печени может занять до 10 минут, чтобы достичь устойчивого состояния. Время до устойчивого состояния начинается после того, как нижняя полая вена была разрезана и печеночный поток установлен.

9. Измерение расхода

1. Поместите весовую лодку на верхние весы и обнулите весы. Поместите трубку из роликового насоса, вытягивающего эфферентный перфусат из ЯМР, в весовую лодку и запустите таймер.
2. Взвесьте массу жидкости, накопленной за 1 мин, что дает скорость потока печени. Поместите трубку обратно в контейнер для сбора/сбора отходов.

10. Измерение кислорода

ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения кислородного измерителя были установлены в соответствии с инструкциями завода-изготовителя¹⁵.

1. Поместите электрод, содержащий 20 мкл 50% насыщенного раствора KCl, на платиновый купол и поместите пять капель по 10 мкл вокруг нижнего платинового кольца электрода.
2. Снимите клей с сигаретной бумаги. Положите кусочек политетрафторэтиленовой мембраны поверх сигаретной бумаги.
3. Поместите две части поверх электрода. Установите небольшое уплотнительное кольцо вокруг верхней части электрода. Обрежьте бумагу, чтобы положить ее на нижнее платиновое кольцо на электроде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторый навес приемлем. Важно покрыть серебро электрода.
4. Поместите уплотнительное кольцо большего размера на электрод. Подключите электрод к водяной камере и затяните основание, чтобы удерживать электрод на месте. Включите водяную баню и дайте нагреться до 37 °C.
5. Открытое программное обеспечение кислородного измерителя. Нажмите « Откалибровать > насыщенной воздухом воды. Установите скорость мешалки на 75, а температуру на 37 °C.
6. Наполните флакон объемом 50 мл наполовину водой и энергично встряхните в течение 2 минут. Это насыщенная воздухом вода, используйте ее как 100% стандартную. Заполните камеру кислородного измерителя ~2 мл воды и поместите двухсекционную пробку.
7. Нажмите Ok на экране и позвольте сигналу выйти на плато. Как только сигнал достигнет плато, нажмите Ok. Утилизируйте жидкость в камере и высушите папиросной бумагой.
8. Повторите шаги 10,6-10,7, но с 200 мМ сульфита натрия (0% стандартно). Нажмите Сохранить калибровку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для стандарта 0% не требуется сильного встряхивания.
9. Во время перфузии используйте два шприца по 5 мл. Один шприц для циркулирующего перфузата (кислород внутри) и второй для эфферентного перфузата из ЯМР-трубки (кислород наружу).
10. При составлении перфузата как для входного, так и для наружного измерения каждый раз вытягивайте по 3-4 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта колонна имеет стеклянную трубку, чтобы обеспечить доступ в ЯМР-трубку для извлечения перфузата, который протекал через печень.
11. Измерьте циркулирующий перфусат, сначала так же, как воду на этапе 10.6, и утилизируйте на этапе 10.7. Повторите те же шаги для эфферентного перфусата.
12. Выполняйте измерения кислорода каждые 10 минут.

Результаты

Функция печени в первую очередь оценивается по потреблению кислорода и скорости потока. Типичны скорость потока 4-8 мл/мин и потребление кислорода 1 мкмоль/мин.г. Эти меры будут варьироваться в зависимости от конкретных экспериментальных условий и биологических различий.

Обсуждение

Эта хирургическая процедура является сложной и требует обширной практики для достижения воспроизводимых результатов. Изофлуран и газ-носитель должны быть отрегулированы по мере необходимости, чтобы поддерживать жизнеспособность животного на протяжении большей части хирургической ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe	N/A	N/A	Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column	N/A	N/A	Custom Made
2-0 Silk Suture	Braintree Scientific	N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety	Terumo	SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26426
4x4 in. Surgical Platform	N/A	N/A	Custom Made
70% Alcohol Wipe	N/A	N/A	Non-specific Brand
Circulating Water Bath	MS Lauda	N/A	Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator	N/A	N/A	Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-0704-06
Lidocaine HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator	Radnoti	N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "	Roboz	RS-6013
Oxygen Meter System	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
Saline 0.9% Solution	N/A	N/A	Saline is made in lab
Scale	N/A	N/A	Non-specific Brand
Variable Speed Analog Console Pump Systems	Cole Palmer	N/A	Models are custom per application
Weigh boats	N/A	N/A	Non-specific Brand