エクスビボ マウスの門脈を通る肝臓灌流

要約

このプロトコルは、門脈灌流による代謝研究のために無傷のマウス肝臓を切除する簡単な方法を記載している。

要約

糖尿病、前糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)などの代謝性疾患は、ますます一般的になりつつある。エクスビボ肝臓灌流は、厳密に制御できる栄養条件下で、核磁気共鳴(NMR)を使用して肝臓代謝の包括的な分析を可能にします。インシリコシミュレーションは、ホルモン作用および薬物介入の効果を評価するための主に理論的手段であり続けているように、灌流肝臓は、肝代謝を理解するための最も貴重な試験床の1つであり続けている。これらの研究は肝生理学への基本的な洞察を導くので、結果は正確で再現性がなければなりません。生体外肝灌流の再現性における最大の要因は、手術の質である。そこで、我々は、in situNMR実験の文脈でエクスビボマウス肝臓灌流を行うための組織的かつ合理化された方法を導入した。また、ユニークなアプリケーションについて説明し、これらの研究で遭遇する一般的な問題についても説明します。全体的な目的は、in situNMR実験の文脈で肝切除および灌流において再現性のある結果を得るためのゴールデンスタンダードと見なす、数年間にわたって洗練されてきた技術への単純なガイドを提供することです。磁石の磁場の中心までの距離と、NMR実験中の介入に対する組織のアクセス不能は、私たちの方法を新規なものにします。

概要

生体外灌流は肝代謝の研究において極めて重要であり、門脈を介した灌流はこれらの研究の標準である。単独で肝代謝を研究するためには、肝臓を体内から切除して、他の器官における代謝から生じる合併症(すなわち、全身代謝)を回避し、ホルモンの利用可能性(インスリン、グルカゴンなど)を制御する必要があります。このアプローチは、糖尿病、NAFLD、NASHなどの疾患が肝代謝に及ぼす影響や薬物作用のメカニズムを理解するために不可欠です。この記事は、肝切除と灌流のガイドとして機能します。我々は、これらの代謝肝研究を十分な厳密さと再現性で実施するための合理化された手順を開発しました。手術が正しく行われない場合、得られる代謝データに顕著な変動性がある。我々は、文献¹、²、³、⁴、⁵に記載されているように^、核磁気共鳴(NMR)分光計におけるその場での代謝研究の文脈で門脈カテーテル法および肝臓切除を行うための組織化された方法を説明する。

現在、NMR内のガラスカラムを用いた ex vivo 肝灌流を記載した文献はない。また、マウス肝臓で手順を実行する方法の明確な例を提供するビデオやテキストの出版物、具体的には、門脈をカテーテル法し、肝臓を切除し、肝臓を移し、ガラス柱に吊るす方法を示すものもありません。遺伝子組み換えマウスは肝臓代謝の研究に遍在的に使用されているため、これは完全な説明に値する不可欠な手順です。肝臓灌流手術は新しいものではありませんが、この記事はゴールドスタンダードな方法であり、この手順に関心のあるすべての人を支援するために、このペーパーに記載されている技術的卓越性を示すビデオが添付されています。ここで提示された方法は、疾患モデルにおける代謝産物の機能および代謝回転を検出するために、リアルタイム代謝に最もよく適用されるであろう。

この方法は、NMRチューブ内の灌流液によって封入されたカニューレの底に肝臓を吊るすことを可能にする100cmのウォータージャケット付きガラスカラムを使用する。ガラスジャケット内の加熱された水は、灌流液温度を制御するために使用されます。薄層酸素化器は、pH制御のために95%/5%O2/_CO2で加圧される。3つの別々のポンプを使用することにより、灌流液カラムの高さが設定され、肝臓に一定の圧力が供給される。流量は、一定の圧力の印加を超えて制御されません(図1)。肝臓が適切に機能していることを確認するために、酸素測定が流量とともに行われます。私たちの手では、この一連の前提条件は、肝臓代謝機能の評価のための再現性の高いNMR実験につながります。

プロトコル

マウスを含む実験は、フロリダ大学施設動物ケアおよび使用委員会(プロトコル番号#201909320)に準拠して処理した。使用したマウス株はC57BL/6Jであった。全てのマウスは雄であった。この方法は、一般に、他の標準的なマウス系統を用いた研究にも適用可能である。この手術は、一緒に働く2人の個人によって最適に行われます。

1. 初期設定

1. クレブス・ヘンゼライト電解質⁶(25 mM NaHCO₃、112 mM NaCl、4.7 mM KCl、MgSO4、KH 2 PO4、および0.5 mM ナトリウム-EDTA、1.25 mM CaCl₂)、6 mM乳酸ナトリウム、0.6 mM ピルビン酸ナトリウム、0.2 mM [U-13 C]プロピオン酸ナトリウム、¹⁰% (v/v)_D2O、 0.63mM混合脂肪酸(パルミチン酸(全体の22.1%)、パルミトレイン酸(5.2%)、ステアリン酸(2.7%)、オレイン酸(27%)、リノール酸(37.7%)、γ-リノレン酸(2.4%)、デコサヘキサン酸(2.8%)、および2%(w / v)ウシ血清アルブミンを含む。HCl(および必要に応じてNaOH)を使用して、灌流液の最終pHを7.3に設定します。

2. 手術前のセットアップ

1. 長さ19.05 mmの23G針で2つの1 mLシリンジを組み立てます。1つのシリンジに0.01mLの1000単位/mLヘパリンおよび0.19mLの生理食塩水(水中の0.9%(w / v)NaCl)を充填する。 表1)。
2. 2番目のシリンジに0.2mLの2%リドカインおよび0.6mLの0.9%生理食塩水を入れます(表1)。27 G 38.1 mm針を備えた別の1 mLシリンジに、灌流液を充填し、37°Cに維持する。

3. 灌流カラムのセットアップ

1. 500mLの灌流液を入れたガラス瓶を水浴にセットする(図1B)。ウォーターバスをオンにし、温度を〜42°Cに設定します。 水浴内のより高い温度は、灌流カラム内で37°Cを維持することを可能にする。
2. 水が42°Cまで加熱されたら、2つのポンプをオンにして、ボトルからの灌流液を薄膜酸素供給器とウォータージャケット付きの100cmガラスカラム全体に循環させます(図1A-E)。
3. 酸素化ガス(酸素95%、二酸化炭素5%)をオンにして、酸素化器⁷を加圧する(図1C)。カテーテルを取り付けた状態で8mL/minの流量を達成するために灌流液カラムの高さを調整します(流量測定についてはステップ9を参照)^5,8,9。
   注:流量は、灌流液が肝臓によって排出される速度を指す。

4.マウスの麻酔

1. IACUCプロトコルおよびその他の適切な安全ガイドラインで要求されるPPEを着用してください。
   注: 次の手順は、生後 9 ~ 13 週間のマウス用に最適化されています。
2. マウスをイソフルランチャンバーに入れる。送達ガスを100%酸素、1 L/minの流量、およびイソフルランを2%¹⁰に変えます。呼吸が遅くなり、安定するまで待ちます。
   注:ゆっくりと安定した呼吸数とつま先のピンチ反射の欠如によって証明されるように、マウスが安定した手術面に到達するためには、酸素流量を〜1.5 L /分〜〜3 L /分、イソフルラン濃度を1〜3%に調整することができます。キャリアガスおよびイソフルラン濃度の送達速度は、動物の年齢および体重ならびに騒音および光などの要因に依存する。
3. 腹部を70%のアルコールで消毒する。腹部脂肪層に皮下深部注射でヘパリンを投与する(図2)。マウスを麻酔室に10分間戻します。
   メモ:この手順は端末であるため、シェービングは必要ありません。

5. セリオトミー

1. マウスを麻酔室から手術台に移し、仰臥位に置きます(図3)。
2. マウスの機首をノーズコーンに入れ、足をテープで留めます。窒息につながる可能性のある首に負担をかけないように注意してください。
3. 皮下注射を介して前腸骨頂部領域¹¹ に両側にリドカインを投与する(図3)。つま先のピンチテストを実行して、すべての痛み反射がないことを確認します。
4. 内臓を露出させるためにセリオトミーを行う(図4)。幅3cmの切開(マウスの腹部全体の幅)を行う。
   注:幅はマウスの年齢と食事によって変わります。
5. 剣状突起をクランプして牽引力を引き出す止血剤を使用して切開部を拡大します(図4)。

6. 門脈の梗塞

1. 綿の先端のアプリケーターを使用して、門脈を覆っている小腸と大腸をきれいにします。肝臓近位の門脈のアーチの下に絹縫合糸を配置する(図4A)。
2. 解剖学的構造に応じて、第2の絹縫合糸を下腸間膜静脈の近位または遠位に肝臓から遠位に配置する(図4A)^12,13。両方の縫合糸に2-0の縫合糸を使用してください。
3. 縫合糸が所定の位置に収まったら、22Gカテーテル¹⁴ で門脈をカニューレする(図4B)。カテーテルを挿入するときは、ベベルを上に向けたままにしてください。門脈を15°以下の角度で入力します。
4. 最初の縫合糸をカテーテルタッパーの後ろに結びます。門脈をカニューレした後、門脈の枝から遠位2〜3mmのカテーテルをシルク縫合糸で固定する(図4B)。
   注:アシスタントは、カテーテルから外れたり、門脈が裂けたりしないように、肩と手首を転がす必要があります。各縫合糸には2つの結び目が必要です。
5. 次に、カテーテルの下部を第2の縫合糸で固定する。外科助手の助けを借りて、縫合糸で結び目を結び、カテーテルを門脈の遠位部および周囲の組織に固定する。

7.肝臓門脈後静脈カニューレの切除

1. カテーテルを固定した後、長さ38.1mmの27G針を備えた1mLシリンジをカテーテルに挿入して、血液および気泡を洗い流す。
   注:通常、圧力からカテーテルから血液が逆流します。
2. 固定活栓付きの内径1 mm x 外径5 mmのシリコーンチューブを使用して、灌流カラム(図1A)をカテーテルに結合させ、灌流の開始をマークする肝臓へのバッファーの流れを可能にします。この時点でタイマーを開始して、灌流の開始をマークします。
3. はさみを使用して下大静脈に切開することにより、増加した血管圧を緩和する。
4. 肝臓を流れる灌流液の流れを、ピンク/赤から淡黄色への肝臓色の均質な変化を観察して確認します。流れが確認されたら、周囲の組織から胃、小腸、大腸、右腎臓を切除します。
5. 外科助手の助けを借りて、外科医が頭頂腹膜および胸部組織を切断して肝臓を切除するように、腹腔および胸腔の周りに肝臓を操縦する
6. 最後に、肝臓を上方に持ち上げ、肝臓を所定の位置に保持している残りの結合組織をはさみで切断する。見やすくするために肝臓をゆっくりと操作します。NMRチューブ内に封入する前に、灌流液で洗い流して肝臓に付着した毛皮を取り除きます。
   注:この手順では、肝臓のみが除去されます。他のすべての器官は動物の体内に残っています。胆管は、実験のプロトコールに基づいて除去することができる。この実験のためには、それは所定の位置に残された。

8.カラムから肝臓を吊るす

1. 外科医が肝臓とチューブをアシスタントに渡すと、アシスタントはチューブをカテーテルとカラムから切断します。
2. カテーテルの上部に半月板が形成されるまで、カテーテルを灌流液で満たします。カテーテルをカラムに取り付けて、肝臓を吊り下げて灌流させます。
   注:カテーテル上の灌流液のビーズは、肝臓が接続されるまで機能するのに十分な体積を提供する。肝臓に取り付けられたカテーテルは、カラムの底部にプレス嵌合される。
3. 20 mm NMRチューブを100 cmガラスカラムにねじ込み、肝臓を封入します(図5)。肝臓と門脈のねじれを避けるために、NMRチューブをゆっくりとねじ込みます。ねじれが発生して流れが止まった場合は、NMRチューブのネジを外して再スクリューします。これにより、オクルージョンが修復され、フローが戻ります。
4. 研究の詳細に基づいて肝臓を30〜60分間灌流する。
   注:時間は灌流実験に基づいています。この実験のために、代謝代謝回転は30分以内に測定された。肝臓の灌流は、定常状態に達するまでに最大10分かかることがあります。定常状態への時間は、下大静脈が切断され、肝の流れが確立されると始まります。

9. 流量測定

1. 重量ボートを上部のローディングバランスに置き、天秤をゼロにします。NMRから遠心性灌流液を引っ張ってローラーポンプからチューブを計量ボートに入れ、タイマーを開始します。
2. 肝臓の流量をもたらす1分間にわたって蓄積された液体の質量を秤量する。チューブを廃棄物/回収容器に戻します。

10. 酸素測定

注:酸素メーターの測定は、製造元の指示に従って設定されました¹⁵。

1. 50%KCl飽和溶液20 μLを含む電極を白金ドーム上に置き、電極の下部白金環の周りに5つの10 μL滴を置く。
2. タバコの紙から接着剤を取り除きます。タバコの紙の上にポリテトラフルオロエチレン膜を敷く。
3. 2つのピースを電極の上に置きます。電極の上部に小さなOリングをはめ込みます。紙をトリミングして、電極の下の白金リングに平らに置きます。
   注: 多少のオーバーハングは許容されます。電極の銀を覆うことが不可欠です。
4. 大きなOリングを電極上に置きます。電極を水チャンバーに結合し、ベースを締めて電極を所定の位置に保持します。ウォーターバスをオンにし、37°Cまで加熱します。
5. 酸素メーターソフトウェアを開きます。 [空気飽和水>校正]をクリックします。攪拌機の速度を75に設定し、温度を37°Cに設定します。
6. 50mLのバイアルを半分に水で満たし、2分間激しく振る。これは空気飽和水で、100%標準として使用してください。酸素計チャンバーを約2mLの水で満たし、2ピースストッパーを置きます。
7. 画面上の [OK ]をクリックし、信号がプラトーになるのを許します。信号がプラトーに達したら、[ OK] をクリックします。チャンバー内の液体を処分し、ティッシュペーパーで乾燥させる。
8. 手順10.6~10.7を200mM亜硫酸ナトリウム(0%標準)で繰り返します。[ キャリブレーションの保存]をクリックします。
   注:0%規格では激しい揺れは必要ありません。
9. 灌流中は、5mLシリンジを2本使用してください。1つのシリンジは灌流液(酸素中)を循環させるため、2つはNMRチューブからの遠心性灌流液(酸素排出)用である。
10. インとアウトの両方の測定のために灌流液を採取するときは、毎回3〜4mLを描画します。
    注:このカラムには、NMRチューブにアクセスして肝臓を流れた灌流液を回収するためのガラスチューブがあります。
11. 循環する灌流液を測定し、まずステップ10.6で水と同じようにし、ステップ10.7で処分する。遠心性灌流液についても同じ手順を繰り返します。
12. 酸素測定は10分ごとに行います。

結果

肝機能は、主に酸素消費量と流量によって評価されます。4 ~ 8 mL/分の流量と 1 μmol/min.g の酸素消費量が典型的です。これらの尺度は、特定の実験条件および生物学的差異によって異なるであろう。

使用されるイソフルランの正確な量は、使用されている麻酔システムの種類、ならびにマウスの環境および年齢/体重に依存する。手術中、イソフルランおよび送達ガスは変?...

ディスカッション

この外科的処置は困難であり、再現性のある結果を達成するために広範な練習を必要とする。イソフルランおよびキャリアガスは、できるだけ多くの外科的処置を通して動物の生存率を維持するために、必要に応じて調整されるべきである。環境、時刻、年齢、体重、およびその他のいくつかの要因が麻酔に影響を与えます。体重、食事、マウスの系統、年齢は、脂肪の蓄積が門脈の視覚化?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe	N/A	N/A	Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column	N/A	N/A	Custom Made
2-0 Silk Suture	Braintree Scientific	N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety	Terumo	SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26426
4x4 in. Surgical Platform	N/A	N/A	Custom Made
70% Alcohol Wipe	N/A	N/A	Non-specific Brand
Circulating Water Bath	MS Lauda	N/A	Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator	N/A	N/A	Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-0704-06
Lidocaine HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator	Radnoti	N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "	Roboz	RS-6013
Oxygen Meter System	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
Saline 0.9% Solution	N/A	N/A	Saline is made in lab
Scale	N/A	N/A	Non-specific Brand
Variable Speed Analog Console Pump Systems	Cole Palmer	N/A	Models are custom per application
Weigh boats	N/A	N/A	Non-specific Brand