Ex vivo Leberperfusion durch die Portalader in der Maus

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Resektion einer intakten Mausleber für Stoffwechselstudien durch Pfortaderperfusion.

Zusammenfassung

Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes, Prädiabetes, nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) und nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) werden immer häufiger. Ex-vivo-Leberperfusionen ermöglichen eine umfassende Analyse des Leberstoffwechsels unter Verwendung von Kernspinresonanz (NMR) unter Ernährungsbedingungen, die streng kontrolliert werden können. Da In-silico-Simulationen nach wie vor ein primär theoretisches Mittel zur Beurteilung von Hormonwirkungen und den Auswirkungen pharmazeutischer Interventionen sind, bleibt die durchblutete Leber eines der wertvollsten Testumgebungen für das Verständnis des Leberstoffwechsels. Da diese Studien grundlegende Einblicke in die Leberphysiologie geben, müssen die Ergebnisse genau und reproduzierbar sein. Der größte Faktor für die Reproduzierbarkeit der Ex-vivo-Leberperfusion ist die Qualität der Operation. Daher haben wir eine organisierte und optimierte Methode eingeführt, um Ex-vivo-Mausleberperfusionen im Rahmen von In-situ-NMR-Experimenten durchzuführen. Wir beschreiben auch eine einzigartige Anwendung und diskutieren häufige Probleme, die in diesen Studien aufgetreten sind. Der übergeordnete Zweck besteht darin, einen unkomplizierten Leitfaden für eine Technik zu geben, die wir über mehrere Jahre verfeinert haben und die wir als den goldenen Standard für die Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse bei Leberresektionen und Perfusionen im Rahmen von In-situ-NMR-Experimenten betrachten. Der Abstand zum Zentrum des Feldes für den Magneten sowie die Unzugänglichkeit des Gewebes für Eingriffe während des NMR-Experiments machen unsere Methoden neuartig.

Einleitung

Ex-vivo-Perfusionen sind entscheidend für die Untersuchung des Leberstoffwechsels, und die Perfusion durch die Pfortader ist der Standard für diese Studien. Um den Leberstoffwechsel isoliert zu untersuchen, muss die Leber aus dem Körper heraus reseziert werden, um Komplikationen zu vermeiden, die sich aus dem Stoffwechsel in anderen Organen (d.h. dem Ganzkörperstoffwechsel) ergeben, und um die Hormonverfügbarkeit (Insulin, Glucagon usw.) zu kontrollieren. Dieser Ansatz kann für das Verständnis der Auswirkungen von Krankheiten wie Diabetes, NAFLD und NASH auf den Leberstoffwechsel sowie für Mechanismen der Arzneimittelwirkung unerlässlich sein. Dieser Artikel dient als Leitfaden für die hepatische Resektion und Perfusion. Wir haben ein optimiertes Verfahren entwickelt, um diese metabolischen Leberstudien mit ausreichender Strenge und Reproduzierbarkeit durchzuführen. Wird die Operation nicht korrekt durchgeführt, kommt es zu einer ausgeprägten Variabilität der erhaltenen Stoffwechseldaten. Wir beschreiben eine organisierte Methode zur Durchführung von Portalvenenkatheterisierung und Leberresektion im Rahmen von Stoffwechselstudien in situ in einem Kernspinresonanzspektrometer (NMR), wie in der Literatur 1,2,3,4,5 beschrieben.

Derzeit gibt es keine Literatur, die eine ex vivo hepatische Perfusion unter Verwendung einer Glassäule innerhalb einer NMR beschreibt. Es gibt auch keine Video- oder Textpublikation, die ein klares Beispiel dafür liefert, wie das Verfahren mit der Mausleber durchgeführt wird, insbesondere um zu demonstrieren, wie man die Pfortader katheterisiert, eine Leber reseziert, überträgt und die Leber an eine Glassäule hängt. Da die gentechnisch veränderte Maus allgegenwärtig zur Untersuchung des Leberstoffwechsels eingesetzt wird, ist dies ein wesentliches Verfahren, das eine vollständige Beschreibung verdient. Leberperfusionsoperationen sind nicht neu, aber dieser Artikel ist eine Goldstandardmethode, begleitet von einem Video, das die in diesem Papier beschriebene technische Exzellenz demonstriert, um allen zu helfen, die an diesem Verfahren interessiert sind. Die hier vorgestellte Methode würde am besten auf den Echtzeitstoffwechsel angewendet werden, um die Funktion und den Umsatz von Metaboliten in Krankheitsmodellen nachzuweisen.

Diese Methode verwendet eine 100 cm große, wasserummantelte Glassäule, die es der Leber ermöglicht, am Boden der Kanüle zu hängen, die durch Perfusat in einem NMR-Röhrchen eingekapselt ist. Erhitztes Wasser im Glasmantel wird verwendet, um die perfusatierte Temperatur zu kontrollieren. Ein dünnschichtiger Oxygenator wird zur pH-Kontrolle mit 95%/5% O 2/CO₂ unter Druck gesetzt. Durch die Verwendung von drei separaten Pumpen wird die perfusate Säulenhöhe eingestellt, die der Leber einen konstanten Druck verleiht. Durchflussraten werden nicht über die Anwendung von konstantem Druck hinaus gesteuert (Abbildung 1). Um zu bestätigen, dass die Leber richtig funktioniert, werden Sauerstoffmessungen zusammen mit den Durchflussraten durchgeführt. In unseren Händen führt diese Reihe von Voraussetzungen zu hochgradig wiederholbaren NMR-Experimenten zur Beurteilung der Stoffwechselfunktion der Leber.

Protokoll

Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Florida (Protokollnummer # 201909320) durchgeführt. Der verwendete Mausstamm war C57BL/6J; Alle Mäuse waren männlich. Diese Methode ist im Allgemeinen auch für Studien mit anderen Standard-Mausstämmen anwendbar. Diese Operation wird optimal von zwei Personen durchgeführt, die zusammenarbeiten.

1. Ersteinrichtung

1. Perfuse-Lebern mit perfusathaltigen Krebs-Henseleit-Elektrolyten 6(25 mM_{NaHCO 3}, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, je 1,2 mM_MgSO4,_KH2PO4und 0,5 mM Natrium-EDTA, 1,25 mM CaCl₂), 6 mM Natriumlactat,^0,6 mM Natriumpyruvat, 0,2 mM [U-13 C]Natriumpropionat, ¹⁰% (v/v)_D2O, und 0,63 mM gemischte Fettsäuren (mit Palmitinsäure (22,1% der Gesamtmenge), Palmitoleinsäure (5,2%), Stearinsäure (2,7%), Ölsäure (27%), Linolsäure (37,7%), γ-Linolensäure (2,4%) und Decosahexansäure (2,8%)) zusammen mit 2% (w/v) Rinderserumalbumin. Stellen Sie den endgültigen pH-Wert von Perfusat mit HCl (und NaOH, falls erforderlich) auf 7,3 ein.

2. Vorbereitung vor der Operation

1. Bestücken Sie zwei 1-ml-Spritzen mit einer 23G-Nadel, die 19,05 mm lang sind. Füllen Sie eine Spritze mit 0,01 ml 1000 Einheiten/ml Heparin und 0,19 ml Kochsalzlösung (0,9% (w/v) NaCl in Wasser; Tabelle 1).
2. Füllen Sie die zweite Spritze mit 0,2 ml 2% Lidocain und 0,6 ml 0,9% Kochsalzlösung (Tabelle 1). In einer weiteren 1 ml Spritze mit einer 27 G 38,1 mm Nadel mit dem Perfusat füllen und bei 37 °C halten.

3. Perfusat-Säulenaufbau

1. Stellen Sie die Glasflasche mit 500 ml Perfusat in das Wasserbad (Abbildung 1B). Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf ~ 42 ° C. Die höhere Temperatur im Wasserbad ermöglicht die Aufrechterhaltung von 37 °C in der Perfusionssäule.
2. Sobald sich das Wasser auf 42 °C erwärmt hat, schalten Sie die beiden Pumpen ein, um das Perfusat aus der Flasche durch den Dünnschichtoxygenator und die wasserummantelte 100 cm lange Glassäule zu zirkulieren (Abbildung 1A-E).
3. Schalten Sie das sauerstoffhaltige Gas (95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid) ein, um den Oxygenator⁷ unter Druck zu setzen (Abbildung 1C). Stellen Sie die Höhe der perfusatierten Säule ein, um eine Durchflussrate von 8 ml/min mit angeschlossenem Katheter zu erreichen (siehe Schritt 9 zur Durchflussmessung)^5,8,9.
   HINWEIS: Die Durchflussrate bezieht sich auf die Geschwindigkeit, mit der Perfusat von der Leber ausgestoßen wird.

4. Betäubung der Maus

1. Don PSA, wie vom IACUC-Protokoll und anderen geeigneten Sicherheitsrichtlinien gefordert.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden für Mäuse optimiert, die 9 - 13 Wochen alt sind.
2. Legen Sie die Maus in die Isoflurankammer. Drehen Sie das Abgabegas auf 100% Sauerstoff, eine Durchflussrate von 1 l / min und das Isofluran auf 2% ¹⁰. Warten Sie, bis sich die Atmung verlangsamt und stabil ist.
   HINWEIS: Damit die Maus eine stabile chirurgische Ebene erreicht, wie eine langsame und gleichmäßige Atemfrequenz und das Fehlen eines Zehenkneifreflexes zeigen, kann die Sauerstoffflussrate auf ~ 1,5 l / min bis ~ 3 l / min und die Isoflurankonzentration von 1 - 3% eingestellt werden. Die Förderrate der Trägergas- und Isoflurankonzentration hängt vom Alter und Gewicht des Tieres und von Faktoren wie Lärm und Licht ab.
3. Desinfizieren Sie den Bauch mit 70% Alkohol. Verabreichen Sie Heparin durch eine tiefe subkutane Injektion in die Bauchfettschicht (Abbildung 2). Legen Sie die Maus für 10 Minuten zurück in die Anästhesiekammer.
   HINWEIS: Rasieren ist nicht erforderlich, da dieses Verfahren terminal.

5. Celiotomie

1. Übertragen Sie die Maus von der Anästhesiekammer auf die Operationsplattform und stellen Sie sie in Rückenlage (Abbildung 3).
2. Legen Sie die Nase der Maus in einen Nasenkegel und kleben Sie die Pfoten ab. Achten Sie darauf, den Hals nicht zu belasten, die zum Ersticken führen kann.
3. Lidocain durch eine subkutane Injektion bilateral in der vorderen Beckenkammregion¹¹ verabreichen (Abbildung 3). Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um das Fehlen aller Schmerzreflexe zu bestätigen.
4. Führen Sie eine Zöliotomie durch, um die inneren Organe freizulegen (Abbildung 4). Machen Sie einen 3 cm breiten Schnitt (die Breite des gesamten Bauches der Maus).
   HINWEIS: Die Breite ändert sich mit dem Alter und der Ernährung der Maus.
5. Erweitern Sie den Einschnitt, indem Sie einen Hämostat verwenden, der die Traktion durch Klemmen des Xiphoidprozesses zieht (Abbildung 4).

6. Kanülierung der Pfortader

1. Verwenden Sie einen Applikator mit Baumwollspitze, um den Dünn- und Dickdarm zu entfernen, der die Pfortader bedeckt. Positionieren Sie eine Seidennaht unter dem Bogen der Pfortader proximal zur Leber (Abbildung 4A).
2. Je nach anatomischer Struktur wird die zweite Seidennaht proximal oder distal der Vena mesenterica inferior distal von der Leber entfernt platziert (Abbildung 4A)^12,13. Verwenden Sie eine 2-0-Naht für beide Nähte.
3. Sobald die Nähte an Ort und Stelle sind, kanülieren Sie die Pfortader mit einem 22G-Katheter 14 (Abbildung 4B^). Halten Sie beim Einsetzen des Katheters die Abschrägung nach oben. Betreten Sie die Pfortader in einem Winkel von nicht mehr als 15°.
4. Binden Sie die erste Naht am Katheterzapfer vorbei. Nachdem die Pfortader kanüliert ist, verankern Sie den Katheter 2-3 mm distal vom Ast der Pfortader mit der Seidennaht (Abbildung 4B).
   HINWEIS: Der Assistent sollte Schultern und Handgelenke rollen, um ein Lösen des Katheters oder ein Reißen der Pfortader zu verhindern. Jede Naht benötigt zwei Knoten.
5. Als nächstes sichern Sie den unteren Teil des Katheters mit der zweiten Naht. Binden Sie mit Hilfe des chirurgischen Assistenten einen Knoten mit der Naht, um den Katheter am distalen Teil der Pfortader und dem umgebenden Gewebe zu befestigen.

7. Resektion der Venenkanülierung der Leberpfostenpforte

1. Nachdem der Katheter gesichert ist, führen Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 38,1 mm langen 27G-Nadel in den Katheter ein, um Blut- und Luftblasen zu spülen.
   HINWEIS: Es gibt normalerweise einen Rückfluss von Blut aus dem Katheter durch den Druck.
2. Verwenden Sie einen 1 mm großen I.D. x 5 mm großen O.D. Silikonschlauch mit einem festen Absperrhahn, um die Perfusionssäule (Abbildung 1A) an den Katheter zu koppeln, so dass der Puffer in die Leber fließt und den Beginn der Perfusion markiert. Starten Sie an dieser Stelle einen Timer, um den Beginn der Perfusion zu markieren.
3. Entlasten Sie den erhöhten Gefäßdruck, indem Sie mit einer Schere einen Schnitt in die untere Hohlvene machen.
4. Bestätigen Sie den Fluss von Perfusat durch die Leber, indem Sie die homogene Veränderung der Leberfarbe von Rosa / Rot zu einem blassgelben beobachten. Sobald der Fluss bestätigt ist, entfernen Sie den Magen, den Dünndarm, den Dickdarm und die rechte Niere aus dem umgebenden Gewebe.
5. Manövrieren Sie mit Hilfe des chirurgischen Assistenten die Leber um die Bauch- und Brusthöhle, während der Chirurg das parietale Peritoneum und das Thoraxgewebe durchschneidet, um die Leber zu resezieren
6. Zum Schluss heben Sie die Leber nach oben und schneiden Sie das verbleibende Bindegewebe, das die Leber an Ort und Stelle hält, mit einer Schere ab. Manipulieren Sie langsam die Leber, um die Sicht zu erleichtern. Entfernen Sie jedes Fell, das an der Leber haftet, indem Sie es mit Perfusat abspülen, bevor Sie es in den NMR-Schlauch einkapseln.
   HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird nur die Leber entfernt. Alle anderen Organe werden im Körper des Tieres belassen. Der Gallengang kann basierend auf dem Protokoll des Experiments entfernt werden. Obwohl es für dieses Experiment an Ort und Stelle gelassen wurde.

8. Die Leber an der Säule hängen

1. Sobald der Chirurg die Leber und den Schlauch an den Assistenten übergibt, trennt der Assistent den Schlauch vom Katheter und der Säule.
2. Füllen Sie den Katheter mit Perfusat, bis sich auf der Oberseite des Katheters ein Meniskus bildet. Befestigen Sie den Katheter an der Säule, damit die Leber hängen und durchbluten kann.
   HINWEIS: Die Perle aus Perfusat auf dem Katheter bietet genügend Volumen, damit die Leber funktionieren kann, bis sie angeschlossen ist. Der an der Leber befestigte Katheter wird an der Unterseite der Säule befestigt.
3. Schrauben Sie ein 20-mm-NMR-Rohr auf die 100 cm lange Glassäule, um die Leber einzukapseln (Abbildung 5). Um eine Torsion der Leber und der Pfortader zu vermeiden, schrauben Sie langsam den NMR-Schlauch auf. Wenn eine Torsion auftritt und der Fluss gestoppt wird, schrauben Sie den NMR-Schlauch ab und fixieren Sie ihn. Dies wird die Okklusion beheben und der Fluss wird zurückkehren.
4. Durchbluten Sie die Leber für 30-60 Minuten, basierend auf den Details der Studie.
   HINWEIS: Die Zeit basiert auf dem Perfusionsexperiment. Für dieses Experiment wurde der Stoffwechselumsatz innerhalb von 30 min gemessen. Die Leberdurchblutung kann bis zu 10 Minuten dauern, um einen stabilen Zustand zu erreichen. Die Zeit bis zum stationären Zustand beginnt, sobald die untere Hohlvene geschnitten wurde und der Leberfluss hergestellt ist.

9. Durchflussmessung

1. Legen Sie ein Wägeboot auf eine obere Ladewaage und nullen Sie die Waage. Legen Sie den Schlauch von der Rollenpumpe, der efferentes Perfusat aus dem NMR zieht, in das Wiegeboot und starten Sie den Timer.
2. Wiegen Sie die Masse der über 1 Minute angesammelten Flüssigkeit, die die Durchflussrate der Leber ergibt. Legen Sie das Rohr wieder in den Abfall-/Sammelbehälter.

10. Sauerstoffmessung

HINWEIS: Die Messungen der Sauerstoffmessgeräte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers¹⁵ eingerichtet.

1. Legen Sie die Elektrode, die 20 μL 50% KCl gesättigte Lösung enthält, auf die Platinkuppel und legen Sie fünf 10 μL Tropfen um den unteren Platinring der Elektrode.
2. Entfernen Sie den Klebstoff vom Zigarettenpapier. Legen Sie ein Stück Polytetrafluorethylenmembran über das Zigarettenpapier.
3. Legen Sie die beiden Teile auf die Elektrode. Bringen Sie einen kleinen O-Ring um die Oberseite der Elektrode an. Schneiden Sie das Papier so zu, dass es flach auf den unteren Platinring der Elektrode gelegt wird.
   HINWEIS: Ein gewisser Überhang ist akzeptabel. Es ist wichtig, das Silber der Elektrode zu bedecken.
4. Platzieren Sie den größeren O-Ring auf der Elektrode. Koppeln Sie die Elektrode mit der Wasserkammer und ziehen Sie die Basis fest, um die Elektrode an Ort und Stelle zu halten. Das Wasserbad einschalten und auf 37 °C erwärmen lassen.
5. Offene Sauerstoffzähler-Software. Klicken Sie auf > luftgesättigtes Wasser kalibrieren. Stellen Sie die Rührergeschwindigkeit auf 75 und die Temperatur auf 37 °C ein.
6. Füllen Sie eine 50 ml Durchstechflasche zur Hälfte mit Wasser und schütteln Sie sie kräftig für 2 min. Dies ist luftgesättigtes Wasser, verwenden Sie es als 100% Standard. Füllen Sie die Sauerstoffmesskammer mit ~ 2 ml Wasser und legen Sie den zweiteiligen Stopper darauf.
7. Klicken Sie auf dem Bildschirm auf OK und lassen Sie das Signal auf ein Plateau zu. Sobald das Signal ein Plateau erreicht hat, klicken Sie auf OK. Flüssigkeit in der Kammer entsorgen und mit Seidenpapier trocknen.
8. Wiederholen Sie die Schritte 10.6-10.7, jedoch mit 200 mM Natriumsulfit (0% Standard). Klicken Sie auf Kalibrierung speichern.
   HINWEIS: Für den 0%-Standard ist kein starkes Schütteln erforderlich.
9. Verwenden Sie während der Perfusion zwei 5-ml-Spritzen. Eine Spritze für zirkulierendes Perfusat (Sauerstoff rein) und die zweite für efferentes Perfusat aus dem NMR-Röhrchen (Sauerstoff raus).
10. Wenn Sie Perfusat für Ein- und Ausmessungen erstellen, ziehen Sie jedes Mal 3-4 ml.
    HINWEIS: Diese Säule hat Glasröhren, um den Zugang zum NMR-Röhrchen zu ermöglichen, um das Perfusat, das durch die Leber geflossen ist, abzuziehen.
11. Das zirkulierende Perfusat wird zunächst als Wasser in Schritt 10.6 gemessen und in Schritt 10.7 entsorgt. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für das efferente Perfusat.
12. Führen Sie alle 10 Minuten Sauerstoffmessungen durch.

Ergebnisse

Die Leberfunktion wird in erster Linie durch den Sauerstoffverbrauch und die Durchflussrate beurteilt. Ein Durchfluss von 4-8 ml/min und ein Sauerstoffverbrauch von 1 μmol/min.g sind typisch. Diese Maßnahmen variieren je nach spezifischen Versuchsbedingungen und biologischen Unterschieden.

Die genaue Menge des verwendeten Isoflurans hängt von der Art des verwendeten Anästhesiesystems sowie der Umgebung und dem Alter / Gewicht der Maus ab. Während der Operation ändern sich das Isofluran u...

Diskussion

Dieser chirurgische Eingriff ist eine Herausforderung und erfordert umfangreiche Übungen, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Isofluran und Trägergas sollten bei Bedarf angepasst werden, um die Lebensfähigkeit des Tieres während des chirurgischen Eingriffs so weit wie möglich zu erhalten. Umwelt, Tageszeit, Alter, Gewicht und einige andere Faktoren beeinflussen die Anästhesie. Gewicht, Ernährung, Stamm der Mäuse und Alter könnten die Operation beeinflussen, da der Fettaufbau die Visualisierung der Pfortad...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe	N/A	N/A	Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column	N/A	N/A	Custom Made
2-0 Silk Suture	Braintree Scientific	N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety	Terumo	SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26426
4x4 in. Surgical Platform	N/A	N/A	Custom Made
70% Alcohol Wipe	N/A	N/A	Non-specific Brand
Circulating Water Bath	MS Lauda	N/A	Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator	N/A	N/A	Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-0704-06
Lidocaine HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator	Radnoti	N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "	Roboz	RS-6013
Oxygen Meter System	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
Saline 0.9% Solution	N/A	N/A	Saline is made in lab
Scale	N/A	N/A	Non-specific Brand
Variable Speed Analog Console Pump Systems	Cole Palmer	N/A	Models are custom per application
Weigh boats	N/A	N/A	Non-specific Brand