אקס ויוו זלוף כבד דרך וריד הפורטל בעכבר

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה פשוטה לכריתת כבד עכבר שלם למחקרים מטבוליים באמצעות זלוף ורידים פורטלי.

Abstract

מחלות מטבוליות כגון סוכרת, טרום סוכרת, מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית (NAFLD) וסטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH) הופכות נפוצות יותר ויותר. פרפוזיות כבד Ex vivo מאפשרות ניתוח מקיף של חילוף החומרים בכבד באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR), בתנאים תזונתיים שניתן לשלוט בהם בקפדנות. מכיוון שבסימולציות סיליקו נותרות אמצעי תיאורטי בעיקר להערכת פעולות הורמונים וההשפעות של התערבות תרופתית, הכבד החדור נותר אחת ממיטות הבדיקה החשובות ביותר להבנת חילוף החומרים בכבד. מכיוון שמחקרים אלה מנחים תובנות בסיסיות על פיזיולוגיה של הכבד, התוצאות חייבות להיות מדויקות וניתנות לשחזור. הגורם הגדול ביותר בשכפול של זלוף כבד ex vivo הוא איכות הניתוח. לכן, הצגנו שיטה מאורגנת ויעילה לביצוע זלופיות כבד של עכברי ex vivo בהקשר של ניסויי NMR באתרם . כמו כן, אנו מתארים יישום ייחודי ודנים בסוגיות נפוצות בהן נתקלנו במחקרים אלה. המטרה הכוללת היא לספק מדריך לא מסובך לטכניקה ששכללנו במשך מספר שנים שאנו רואים בה את תקן הזהב להשגת תוצאות הניתנות לשחזור בניתוחים בכבד ובעיבויים בהקשר של ניסויי NMR באתרם . המרחק למרכז השדה של המגנט, כמו גם חוסר הנגישות של הרקמה להתערבות במהלך ניסוי NMR, הופכים את השיטות שלנו לרדומות.

Introduction

זלוף Ex vivo הוא חיוני בחקר חילוף החומרים בכבד, וזלוף דרך וריד הפורטל הוא הסטנדרט למחקרים אלה. על מנת לחקור את חילוף החומרים בכבד בבידוד, יש לכרות את הכבד מהגוף כדי למנוע סיבוכים הנובעים מחילוף חומרים באיברים אחרים (כלומר, חילוף חומרים בכל הגוף) ולהפעיל שליטה על זמינות ההורמונים (אינסולין, גלוקגון וכו '). גישה זו יכולה להיות חיונית להבנת ההשפעות של מחלות כגון סוכרת, NAFLD ו- NASH על חילוף החומרים בכבד, כמו גם מנגנונים של פעולה תרופתית. מאמר זה משמש כמדריך לכריתה וזליעה של הכבד. פיתחנו הליך יעיל לביצוע מחקרי כבד מטבוליים אלה בקפדנות ובשכפול מספיקים. אם הניתוח אינו מבוצע כראוי, יש שונות בולטת בנתונים המטבוליים המתקבלים. אנו מתארים שיטה מאורגנת לביצוע צנתור ורידים פורטליים וכריתת כבד בהקשר של מחקרים מטבוליים באתרם בספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כמתואר בספרות ^1,2,3,4,5.

נכון לעכשיו, אין ספרות המתארת פרפוזיה של כבד ex vivo באמצעות עמוד זכוכית בתוך NMR. כמו כן, אין סרטון או פרסום טקסט המספק דוגמה ברורה כיצד לבצע את ההליך עם כבד העכבר, במיוחד, המדגים כיצד לצנתר את וריד הפורטל, לכרות כבד, להעביר ולתלות את הכבד על עמוד זכוכית. מכיוון שהעכבר המהונדס גנטית משמש בכל מקום לחקר חילוף החומרים בכבד, זהו הליך חיוני הראוי לתיאור מלא. ניתוחי זלוף בכבד אינם חדשים, אך מאמר זה הוא שיטת תקן זהב המלווה בסרטון המדגים את המצוינות הטכנית המתוארת במאמר זה כדי לסייע לכל מי שמעוניין בהליך זה. השיטה המוצגת כאן תיושם בצורה הטובה ביותר על חילוף חומרים בזמן אמת כדי לזהות את התפקוד והמחזור של מטבוליטים במודלים של מחלות.

שיטה זו משתמשת בעמוד זכוכית מצופה מים בקוטר 100 ס"מ, המאפשר לכבד להיתלות בתחתית הצינורית עטופה על ידי תפרחת בתוך צינור NMR. מים מחוממים במעיל הזכוכית משמשים לשליטה בטמפרטורה המחלחלת. מחמצן שכבה דקה בלחץ עם 95%/5% O₂/CO₂ לשליטה ב-pH. על ידי שימוש בשלוש משאבות נפרדות, נקבע גובה העמוד המחורץ, המספק לחץ מתמיד לכבד. קצבי הזרימה אינם נשלטים מעבר ליישום של לחץ קבוע (איור 1). כדי לוודא שהכבד מתפקד כראוי, מדידות חמצן נלקחות יחד עם קצבי זרימה. בידינו, קבוצה זו של תנאים מוקדמים מובילה לניסויי NMR הניתנים לחזרה חוזרת על עצמה להערכת התפקוד המטבולי של הכבד.

Protocol

ניסויים בהם היו מעורבים עכברים טופלו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פלורידה (פרוטוקול מספר #201909320). זן העכבר שבו נעשה שימוש היה C57BL/6J; כל העכברים היו זכרים. שיטה זו ישימה בדרך כלל גם למחקרים המשתמשים בזני עכבר סטנדרטיים אחרים. ניתוח זה מבוצע בצורה אופטימלית על ידי שני אנשים העובדים יחד.

1. הגדרה ראשונית

1. פרפוזה כבדים עם פרפוזט המכיל קרבס-הנסלייט אלקטרוליטים⁶(25 mM NaHCO₃, 112 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM כל אחד של MgSO₄, KH₂PO₄, ו-0.5 mM נתרן-EDTA, 1.25 mM CaCl₂), 6 mM נתרן לקטט, 0.6 mM נתרן פירובט, 0.2 mM [^U-13C] נתרן פרופיונאט, 10% (v/v) D₂O, ו-0.63 מ"מ חומצות שומן מעורבות (המכילות חומצה פלמיטית (22.1% מכלל החומצה), חומצה פלמיטולאית (5.2%), חומצה סטארית (2.7%), חומצה אולאית (27%), חומצה לינולאית (37.7%), חומצה γ-לינולנית (2.4%) וחומצה דקוסהקסנואית (2.8%)) יחד עם 2% (w/v) אלבומין בסרום בקר. הגדר את ה-pH הסופי של perfusate ל-7.3 באמצעות HCl (ו-NaOH, במידת הצורך).

2. הקמה לפני ניתוח

1. הרכיבו שני מזרקים בגודל 1 מ"ל עם מחט 23G באורך 19.05 מ"מ. מלאו מזרק אחד ב-0.01 מ"ל של 1000 יחידות/מ"ל הפרין ו-0.19 מ"ל של מלח (0.9% (w/v) NaCl במים; טבלה 1).
2. מלאו את המזרק השני ב-0.2 מ"ל של 2% לידוקאין ו-0.6 מ"ל של 0.9% מלוחים (טבלה 1). במזרק נוסף של 1 מ"ל עם מחט 27 G 38.1 מ"מ, למלא עם perfusate ולשמור על 37 °C (66 °F).

3. הגדרת עמודה מפורטת

1. הכניסו את בקבוק הזכוכית המכיל 500 מ"ל של פרפוזה לתוך אמבט המים (איור 1B). הפעילו את אמבט המים והגדירו את הטמפרטורה ל-42 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה הגבוהה יותר באמבט המים מאפשרת שמירה על 37 מעלות צלזיוס בעמודת הזלוף.
2. לאחר שהמים מתחממים עד 42 מעלות צלזיוס, הפעילו את שתי המשאבות כדי להזרים את השקע מהבקבוק לאורך כל מחמצן הסרט הדק ואת עמוד הזכוכית בקוטר 100 ס"מ (איור 1A-E).
3. הפעילו את הגז המחמצן (95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני) כדי ללחוץ על המחמצן⁷ (איור 1C). התאם את גובה העמודה כדי להשיג קצב זרימה של 8 מ"ל/דקה עם הצנתר המצורף (ראה שלב 9 למדידת קצב זרימה)^5,8,9.
   הערה: קצב הזרימה מתייחס לקצב שבו פרפוסאט מגורש על ידי הכבד.

4. הרדמה של העכבר

1. דון PPE כנדרש על פי פרוטוקול IACUC והנחיות בטיחות מתאימות אחרות.
   הערה: השלבים הבאים הותאמו לעכברים בני 9 - 13 שבועות.
2. מניחים את העכבר בתא האיזופלורן. הופכים את גז האספקה ל-100% חמצן, קצב זרימה של 1 ליטר לדקה, ואת האיזופלורן ל-2%¹⁰. המתן עד שהאשימה תאט ותהיה יציבה.
   הערה: כדי שהעכבר יגיע למישור כירורגי יציב, כפי שמעידים קצב נשימה איטי ויציב והיעדר רפלקס צביטה בבוהן, ניתן לכוונן את קצב זרימת החמצן ל~1.5 ליטר לדקה ל~3 ליטר לדקה ואת ריכוז האיזופלורן מ-1- 3%. קצב האספקה של גז נשא וריכוז איזופלורן תלוי בגיל ובמשקל של החיה ובגורמים כגון רעש ואור.
3. יש לחטא את הבטן ב-70% אלכוהול. מתן הפרין באמצעות הזרקה תת עורית עמוקה בשכבת השומן הבטני (איור 2). מניחים את העכבר בחזרה לתא ההרדמה למשך 10 דקות.
   הערה: הגילוח אינו נדרש מכיוון שהליך זה הוא סופני.

5. סליטומיה

1. העבירו את העכבר מתא ההרדמה אל פלטפורמת הניתוח והניחו אותו בתנוחת השכיבה (איור 3).
2. מניחים את אפו של העכבר לתוך חרוט אף ומדביקים את כפות הרגליים כלפי מטה. הקפידו לא להפעיל עומס על הצוואר שעלול להוביל לחנק.
3. מתן לידוקאין באמצעות הזרקה תת-עורית באופן דו-צדדי באזור הפסגה האיליאק^{הקדמית 11} (איור 3). בצע בדיקת צביטה בבוהן כדי לאשר את היעדרם של כל רפלקסי הכאב.
4. בצע קליוטומיה כדי לחשוף את האיברים הפנימיים (איור 4). בצע חתך ברוחב 3 ס"מ (רוחב כל הבטן של העכבר).
   הערה: הרוחב ישתנה עם הגיל והתזונה של העכבר.
5. הרחב את החתך על-ידי שימוש בהמוסטאט המושך אחיזה על-ידי הידוק התהליך ה-xiphoid (איור 4).

6. תותח של וריד הפורטל

1. השתמשו באפליקטור עם קצה כותנה כדי לנקות את המעי הדק והמעיים הגסים המכסים את וריד הפורטל. מקמו תפר משי מתחת לקשת של וריד הפורטל הפרוקסימלי לכבד (איור 4A).
2. בהתאם למבנה האנטומי, הניחו את תפר המשי השני פרוקסימלי או דיסטלי של הדיסטלי של הווריד המזנטרי הנחות מהכבד (איור 4A)^12,13. השתמש בתפר 2-0 עבור שני התפרים.
3. לאחר שהתפרים נמצאים במקומם, ניתן להשתמש בווריד הפורטל באמצעות צנתר 22G¹⁴ (איור 4B). בעת החדרת הקטטר, שמור על השיפוע מכוון כלפי מעלה. הזן את וריד הפורטל בזווית של לא יותר מ- 15°.
4. קשרו את התפר הראשון על פני טאפר הצנתר. לאחר שווריד הפורטל משומר, עגנו את הצנתר בקוטר 2-3 מ"מ דיסטלי מענף וריד הפורטל עם תפר המשי (איור 4B).
   הערה: על העוזר לגלגל כתפיים ופרקי ידיים כדי למנוע פריקה של הצנתר או קריעת וריד הפורטל. כל תפר דורש שני קשרים.
5. לאחר מכן, אבטח את החלק התחתון של הצנתר עם התפר השני. בעזרת העוזר הכירורגי, קשרו קשר עם התפר כדי לאבטח את הצנתר לחלק הדיסטלי של וריד הפורטל והרקמה שמסביב.

7. כריתה של שימורי ורידים בפורטל פוסט כבד

1. לאחר אבטחת הצנתר, יש להחדיר מזרק 1 מ"ל עם מחט 27G שאורכו 38.1 מ"מ לתוך הצנתר כדי לשטוף בועות דם ואוויר.
   הערה: בדרך כלל יש זרימה אחורית של דם מתוך הצנתר מהלחץ.
2. השתמשו בצינור סיליקון בגודל 1 מ"מ I.D. x 5 מ"מ עם סטופקוק קבוע כדי להצמיד את עמודת הזלוף (איור 1A) לצנתר המאפשרת זרימה של החיץ לתוך הכבד המסמנת את תחילת הזלוף. הפעל טיימר בנקודה זו כדי לסמן את תחילת הזלוף.
3. להקל על לחץ כלי הדם מוגבר על ידי ביצוע חתך, באמצעות מספריים, לתוך הווריד קאווה נחות.
4. אשרו את זרימת ההדבקה דרך הכבד על ידי התבוננות בשינוי הומוגני בצבע הכבד מוורוד/אדום לצהוב חיוור. לאחר אישור הזרימה, יש לבלות את הקיבה, המעי הדק, המעי הגס והכליה הימנית מהרקמה הסובבת.
5. בעזרת העוזר הכירורגי, תמרן את הכבד סביב חלל הבטן ובית החזה כאשר המנתח חותך דרך הצפק הקודקודי ורקמת בית החזה כדי לכרות את הכבד
6. לבסוף, הרימו את הכבד כלפי מעלה וחתכו את רקמות החיבור הנותרות המחזיקות את הכבד במקומו עם מספריים. לאט לאט לתמרן את הכבד כדי להקל על הראייה. יש להסיר כל פרווה שנדבקת לכבד על ידי שטיפה עם פרפוזט לפני שתעטוף אותה בתוך צינור ה-NMR.
   הערה: בהליך זה, רק הכבד מוסר. כל האיברים האחרים נשארים בגוף החיה. ניתן להסיר את צינור המרה על סמך פרוטוקול הניסוי. אמנם לניסוי זה, הוא הושאר במקומו.

8. תליית הכבד מהטור

1. לאחר שהמנתח מוסר את הכבד והצינורות לעוזר, העוזר מנתק את הצינורות מהקטטר והעמוד.
2. ממלאים את הצנתר בטפטוף עד שנוצר מניסקוס על החלק העליון של הצנתר. חברו את הצנתר לעמוד כדי שהכבד יתלה וינקב.
   הערה: החרוז של perfusate על הצנתר מספק נפח מספיק עבור הכבד לתפקד עד לחיבורו. הצנתר המחובר לכבד מותאם לתחתית העמוד.
3. הברגו צינור NMR בקוטר 20 מ"מ לעמוד הזכוכית בקוטר 100 ס"מ כדי לתמצת את הכבד (איור 5). כדי למנוע פיתול של הכבד ואת וריד הפורטל, לאט לאט לדפוק על צינור NMR. אם מתרחש פיתול והזרימה נעצרת, פתח את הצווח ויצור מחדש את צינור ה- NMR. זה יתקן את החסימה והזרימה תחזור.
4. מכניסים את הכבד למשך 30-60 דקות על סמך פרטי המחקר.
   הערה: הזמן מבוסס על ניסוי הזלוף. עבור ניסוי זה נמדד המחזור המטבולי תוך 30 דקות. זלוף הכבד יכול לקחת עד 10 דקות כדי להגיע למצב יציב. הזמן למצב יציב מתחיל ברגע שהווריד הנבוב התחתון נחתך וזרימת הכבד נקבעת.

9. מדידת זרימה

1. הניחו סירת שקילה על איזון העמסה עליון ואפסו את האיזון. מניחים את הצינורות ממשאבת הרולר ומושכת את הצינורות מה-NMR לתוך סירת השקילה ומפעילים את הטיימר.
2. שקלו את מסת הנוזל שהצטברה במשך דקה אחת, מה שמניב את קצב הזרימה של הכבד. מניחים את הצינור בחזרה למיכל הפסולת/איסוף.

10. מדידת חמצן

הערה: מדידות מד חמצן הוגדרו על פי הוראות היצרן¹⁵.

1. הניחו את האלקטרודה המכילה 20 μL של תמיסה רוויית KCl של 50% על כיפת הפלטינה והניחו חמש טיפות של 10 μL סביב טבעת הפלטינה התחתונה של האלקטרודה.
2. מסירים את הדבק מנייר הסיגריות. הניחו פיסת קרום של פוליאטטרפלואורואתילן מעל נייר הסיגריה.
3. מניחים את שני החלקים על גבי האלקטרודה. התאם טבעת O קטנה סביב החלק העליון של האלקטרודה. חתכו את הנייר כדי להניח שטוח על טבעת הפלטינה התחתונה על האלקטרודה.
   הערה: חלק מההתעלות מקובלת. חיוני לכסות את הכסף של האלקטרודה.
4. הניחו את טבעת ה-O הגדולה יותר על האלקטרודה. הצמידו את האלקטרודה לתא המים והידקו את הבסיס כדי להחזיק את האלקטרודה במקומה. הפעילו את אמבט המים ואפשרו לחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
5. תוכנת מד חמצן פתוחה. לחץ על כיול > מים רוויי אוויר. הגדר את מהירות המערבל ל -75 ואת הטמפרטורה ל -37 °C (84 °F).
6. ממלאים בקבוקון 50 מ"ל באמצע הדרך במים ורועדים במרץ במשך 2 דקות. מדובר במים רוויי אוויר, השתמשו בהם כסטנדרט של 100%. מלאו את תא מד החמצן בכ-2 מ"ל מים והניחו את הפקק בעל שני החלקים.
7. לחץ על אוקיי על המסך ואפשר לאות לעלות. לאחר שהאות הגיע למישור, לחץ על אוקיי. להשליך את הנוזל בתא ולייבש עם נייר טישו.
8. חזור על שלבים 10.6-10.7 אך עם 200 mM נתרן סולפיט (0% סטנדרטי). לחץ על שמור כיול.
   הערה: אין צורך ברעידות נמרצות עבור תקן 0%.
9. במהלך זלוף, השתמש בשני מזרקים 5 מ"ל. מזרק אחד למחזור פרפוזט (חמצן פנימה) והשני עבור פרפוזט מצינור NMR (חמצן החוצה).
10. בעת ציור perfusate עבור מדידות פנימה והחוצה, לצייר 3-4 מ"ל בכל פעם.
    הערה: עמודה זו כוללת צינורות זכוכית כדי לאפשר גישה לצינור NMR כדי למשוך את הפרפוסאט שזרם דרך הכבד.
11. מודדים את התפשטות הדם, תחילה בדיוק כמו מים בשלב 10.6 ומסלקים בשלב 10.7. חזור על אותם שלבים עבור ההזנחה המזיקה.
12. בצע מדידות חמצן כל 10 דקות.

תוצאות

תפקודי הכבד מוערכים בעיקר על ידי צריכת חמצן וקצב זרימה. קצב זרימה של 4-8 מ"ל לדקה וצריכת חמצן של 1 מיקרומול/min.g הוא אופייני. מדדים אלה ישתנו בהתאם לתנאי הניסוי הספציפיים ולהבדלים הביולוגיים.

הכמות המדויקת של איזופלורן בשימוש תהיה תלויה בסוג מערכת ההרדמה בה נעשה שימוש, כמו גם בס...

Discussion

הליך כירורגי זה הוא מאתגר ודורש תרגול נרחב כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. יש להתאים את איזופלורן וגז המוביל לפי הצורך כדי לשמור על הכדאיות של החיה במהלך כמה שיותר מההליך הכירורגי. סביבה, שעה ביום, גיל, משקל ומספר גורמים נוספים ישפיעו על ההרדמה. משקל, תזונה, זן של עכברים וגיל עשויים להשפיע ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe	N/A	N/A	Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column	N/A	N/A	Custom Made
2-0 Silk Suture	Braintree Scientific	N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety	Terumo	SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26426
4x4 in. Surgical Platform	N/A	N/A	Custom Made
70% Alcohol Wipe	N/A	N/A	Non-specific Brand
Circulating Water Bath	MS Lauda	N/A	Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator	N/A	N/A	Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-0704-06
Lidocaine HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator	Radnoti	N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "	Roboz	RS-6013
Oxygen Meter System	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
Saline 0.9% Solution	N/A	N/A	Saline is made in lab
Scale	N/A	N/A	Non-specific Brand
Variable Speed Analog Console Pump Systems	Cole Palmer	N/A	Models are custom per application
Weigh boats	N/A	N/A	Non-specific Brand