离体 小鼠通过门静脉进行肝灌注

摘要

该协议描述了一种通过门静脉灌注切除完整小鼠肝脏以进行代谢研究的简单方法。

摘要

糖尿病、糖尿病前期、非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD） 和非酒精性脂肪性肝炎 （NASH） 等代谢性疾病正变得越来越普遍。离体肝灌注允许在可以严格控制的营养条件下使用核磁共振（NMR）对肝脏代谢进行全面分析。由于计算机模拟仍然是评估激素作用和药物干预效果的主要理论手段，因此灌注肝脏仍然是了解肝脏代谢的最有价值的测试台之一。由于这些研究指导了对肝脏生理学的基本见解，因此结果必须准确且可重复。离体肝灌注再现性的最大因素是手术质量。因此，我们引入了一种有组织和简化的方法，用于在原位NMR实验的背景下进行离体小鼠肝脏灌注。我们还描述了一种独特的应用，并讨论了在这些研究中遇到的常见问题。总体目的是为我们多年来改进的技术提供一个简单的指导，我们认为这是在原位NMR实验中获得肝切除和灌注可重复结果的黄金标准。磁体到磁场中心的距离以及组织在NMR实验期间无法进行干预使我们的方法新颖。

引言

离体灌注在肝脏代谢研究中至关重要，通过门静脉灌注是这些研究的标准。为了单独研究肝脏代谢，必须从体内切除肝脏，以避免其他器官代谢引起的并发症（即全身代谢），并控制激素的可用性（胰岛素，胰高血糖素等）。这种方法对于了解糖尿病，NAFLD和NASH等疾病对肝脏代谢的影响以及药物作用机制至关重要。本文可作为肝切除和灌注的指南。我们开发了一种简化的程序，以足够的严谨性和可重复性进行这些代谢肝脏研究。如果手术不正确，则获得的代谢数据存在显着的变异性。我们描述了一种在核磁共振（NMR）光谱仪中原位代谢研究的背景下进行门静脉导管插入术和肝切除的有组织方法，如文献^1，2，^3，4，5中所述。

目前，没有文献描述在 NMR 内使用玻璃柱进行 离体 肝灌注。也没有视频或文本出版物提供如何使用小鼠肝脏进行手术的清晰示例，特别是演示如何插入门静脉，切除肝脏，转移和将肝脏悬挂在玻璃柱上。由于转基因小鼠无处不在地用于研究肝脏代谢，这是一个值得完整描述的基本程序。肝灌注手术并不新鲜，但本文是一种黄金标准方法，并附有一段视频，演示本文中描述的技术卓越性，以帮助所有对此程序感兴趣的人。这里介绍的方法最好应用于实时代谢，以检测疾病模型中代谢物的功能和周转。

该方法使用100厘米的水套玻璃柱，允许肝脏悬挂在由灌注液封装在NMR管内的套管底部。玻璃夹套中的热水用于控制灌注液温度。薄层氧合器用95%/5%O₂/CO₂ 加压以控制pH值。通过使用三个单独的泵，可以设置灌注液柱高度，从而为肝脏提供恒定的压力。在施加恒定压力之外，流量不受控制（图1）。为了确认肝脏功能正常，氧气测量与流速一起进行。在我们手中，这组先决条件导致高度可重复的NMR实验，用于评估肝脏代谢功能。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

涉及小鼠的实验按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（协议编号#201909320）进行处理。使用的小鼠菌株为C57BL / 6J;所有小鼠都是雄性。这种方法通常也适用于使用其他标准小鼠品系的研究。该手术由两个人一起工作进行。

1. 初始设置

1. 用含有克雷布斯 - 亨赛莱特电解质⁶（25 mM NaHCO₃，112 mM NaCl，4.7 mM KCl，MgSO 4_{，KH 2PO 4}和0.5 mM钠EDTA，1.25 mM CaCl₂），6 mM乳酸钠，0.6 mM丙酮酸钠，0.2 mM [U-13 C]丙酸钠，10%（v / v）D₂O， 和0.63mM混合脂肪酸（含棕榈酸（占总量的22.1%），棕榈油酸（5.2%），硬脂酸（2.7%），油酸（27%），亚油酸（37.7%），γ亚麻酸（2.4%）和癸己二酸（2.8%））以及2%（w / v）牛血清白蛋白。使用HCl（和NaOH，如有必要）将灌注物的最终pH值设置为7.3。

2. 术前设置

1. 用 23G 针头组装两个 1 mL 注射器，针头长 19.05 mm。在一个注射器中加入0.01 mL 1000单位/ mL肝素和0.19 mL盐水（0.9%（w / v）NaCl在水中; 表 1）。
2. 在第二个注射器中填充0.2mL的2%利多卡因和0.6mL的0.9%盐水（表1）。在另一个1 mL注射器中，用27 G 38.1 mm针头，填充灌注液并保持在37°C。

3. 灌注柱设置

1. 将含有500mL灌注液的玻璃瓶放入水浴中（图1B）。打开水浴，将温度设置为~42°C。 水浴中的较高温度使灌注塔保持37°C。
2. 一旦水加热到42°C，打开两个泵，将瓶子中的灌注液循环到整个薄膜氧化器和水套100厘米玻璃柱（图1A-E）。
3. 打开含氧气体（95%氧气和5%二氧化碳）对氧合器⁷ 加压（图1C）。调整灌注液柱高度，以在连接导管的情况下达到8 mL / min的流速（参见步骤9进行流量测量）^5，8，9。
   注意:流速是指灌注物被肝脏排出的速率。

4. 麻醉鼠标

1. 根据IACUC协议和其他适当的安全指南的要求，不要穿戴PPE。
   注意:以下步骤已针对9-13周龄的小鼠进行了优化。
2. 将小鼠置于异氟醚室中。将输送气体转至100%氧气，流速为1 L / min，异氟醚至2%¹⁰。等到呼吸减慢并稳定。
   注意:为了使小鼠达到稳定的手术平面，如缓慢而稳定的呼吸频率和缺乏脚趾夹反射所证明的那样，氧气流速可以调节至〜1.5 L / min至〜3 L / min，异氟醚浓度为1 - 3%。载气和异氟醚浓度的输送速率取决于动物的年龄和体重以及噪音和光线等因素。
3. 用70%的酒精消毒腹部。通过在腹部脂肪层中深部皮下注射肝素（图2）。将鼠标放回麻醉室10分钟。
   注意:不需要剃须，因为此过程是终端。

5. 切腹术

1. 将小鼠从麻醉室转移到手术平台，并将其置于仰卧位（图3）。
2. 将鼠标的鼻子放入鼻锥中，并用爪子粘住。注意不要在颈部施加任何可能导致窒息的压力。
3. 通过皮下注射双侧在髂前嵴区域¹¹ 给予利多卡因（图3）。进行脚趾捏合测试以确认不存在所有疼痛反射。
4. 进行腹腔切开术以暴露内部器官（图4）。做一个3厘米宽的切口（鼠标整个腹部的宽度）。
   注意:宽度会随着老鼠的年龄和饮食而变化。
5. 通过使用止血剂扩大切口，止血剂通过夹紧xiphoid过程来拉动牵引力（图4）。

6. 门静脉插管

1. 使用棉尖涂药器清除覆盖门静脉的小肠和大肠。将丝状缝合线放置在肝近端门静脉弓下（图4A）。
2. 根据解剖学结构，将第二丝缝线放置在肝脏远端肠系膜下静脉的近端或远端（图4A）^12，13。两种缝合线均使用2-0缝合线。
3. 缝合线就位后，用22G导管¹⁴ 对门静脉进行插管（图4B）。插入导管时，保持斜面朝上。以不超过 15° 角进入门静脉。
4. 将第一根缝线绑过导管穿刺器。门静脉插管后，用丝缝线将导管固定在门静脉分支远端2-3mm处（图4B）。
   注意:助理应滚动肩膀和手腕，以防止导管移位或门静脉撕裂。每个缝合线需要两个结。
5. 接下来，用第二根缝合线固定导管的下部。在手术助理的帮助下，用缝合线打结，将导管固定在门静脉的远端部分和周围组织。

7.门静脉插管术后肝切除术

1. 固定导管后，将1 mL注射器与38.1 mm长的27G针头插入导管中以冲洗血液和气泡。
   注意:通常有血液从压力中从导管中回流出来。
2. 使用内径为1 mm x 外径5 mm的硅胶管和固定旋塞阀将灌注柱（图1A）耦合到导管上，使缓冲液流入肝脏，标志着灌注的开始。此时启动计时器以标记灌注的开始。
3. 通过使用剪刀在下腔静脉切开一个切口来缓解增加的血管压力。
4. 通过观察肝脏颜色从粉红色/红色到淡黄色的均匀变化，确认灌注物在肝脏中的流动。一旦确认血流，切除胃、小肠、大肠和周围组织的右肾。
5. 在手术助理的帮助下，当外科医生穿过顶叶腹膜和胸部组织切除肝脏时，在腹部和胸腔周围移动肝脏
6. 最后，向上抬起肝脏，并用剪刀切开剩余的结缔组织，将肝脏固定到位。慢慢操纵肝脏，以便于观察。在将灌注物封装在NMR管内之前，先用灌注液冲洗掉任何粘在肝脏上的毛皮。
   注意:在这个过程中，只有肝脏被切除。所有其他器官都留在动物体内。胆管可以根据实验方案进行移除。虽然对于这个实验，它被留在原地。

8.将肝脏挂在柱子上

1. 一旦外科医生将肝脏和导管交给助理，助理就会将导管与导管和导管柱断开连接。
2. 用灌注液填充导管，直到导管顶部形成半月板。将导管连接到柱子上，以便肝脏悬挂和灌注。
   注意:导管上的灌注液珠为肝脏提供足够的体积，直到其连接为止。连接到肝脏的导管被压在柱的底部。
3. 将20 mm NMR管拧到100 cm玻璃柱上以封装肝脏（图5）。为避免肝脏和门静脉扭转，请缓慢拧紧 NMR 管。如果发生扭转并且流量停止，请拧下并重新拧紧NMR管。这将补救遮挡，流量将返回。
4. 根据研究的细节，灌注肝脏30-60分钟。
   注意:时间基于灌注实验。对于该实验，在30分钟内测量代谢周转率。肝脏灌注可能需要长达10分钟才能达到稳定状态。一旦下腔静脉被切断并建立肝流，稳定状态的时间就开始了。

9. 流量测量

1. 将称重船放在顶部装载天平上，并将天平归零。将滚筒泵的管道从 NMR 中抽出的渗出物放入称重船中，然后启动计时器。
2. 称量1分钟内积聚的液体质量，产生肝脏的流速。将管子放回废物/收集容器中。

10. 氧气测量

注:氧气计测量是根据制造商的说明¹⁵设置的。

1. 将含有20μL50%KCl饱和溶液的电极放在铂圆顶上，并在电极的下铂环周围放置五个10μL液滴。
2. 从香烟纸上取下粘合剂。在香烟纸上铺上一块聚四氟乙烯膜。
3. 将两个部分放在电极的顶部。在电极顶部周围安装一个小O形圈。修剪纸张以平放在电极上的下铂环上。
   注意:某些悬垂是可以接受的。必须覆盖电极的银。
4. 将较大的O形圈放在电极上。将电极耦合到水室并拧紧底座以将电极固定到位。打开水浴，加热至37°C。
5. 开放式氧气计软件。单击 "校准>空气饱和水"。将搅拌器速度设置为75，将温度设置为37°C。
6. 将50 mL小瓶倒入水中，用力摇晃2分钟。这是空气饱和的水，将其用作100%标准。在氧气计腔室中装满约2 mL水，然后将两片式塞子放在上面。
7. 在屏幕上单击 "确定 "，并允许信号稳定。信号达到平台后，单击" 确定"。在腔室中处理液体并用薄纸擦干。
8. 重复步骤10.6-10.7，但使用200 mM亚硫酸钠（0%标准品）。单击 保存校准。
   注意:0%标准不需要剧烈摇晃。
9. 在灌注过程中，使用两个5 mL注射器。一个用于循环灌注液（氧气进入）的注射器，第二个用于从NMR管传出的灌注液（氧气输出）。
10. 在为进出测量绘制灌注液时，每次抽取3-4 mL。
    注意:该色谱柱具有玻璃管，允许进入NMR管以排出流经肝脏的灌注物。
11. 测量循环灌注液，首先在步骤10.6中如水，并在步骤10.7中处理。对传出灌注重复相同的步骤。
12. 每10分钟进行一次氧气测量。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

肝功能主要通过耗氧量和流速来评估。典型流速为 4-8 mL/min，耗氧量为 1 μmol/min.g。这些措施将根据特定的实验条件和生物学差异而有所不同。

使用异氟醚的确切量将取决于所使用的麻醉系统的类型以及小鼠的环境和年龄/体重。在手术过程中，异氟醚和输送气体不会改变，尽管根据手术区域的具体情况（例如，背景噪音）可能需要一些变化¹⁰。当肝素深部皮?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

这种外科手术具有挑战性，需要大量的实践才能获得可重复的结果。应根据需要调整异氟醚和载气，以通过尽可能多的外科手术来维持动物的生存能力。环境，一天中的时间，年龄，体重和其他几个因素都会影响麻醉。体重，饮食，小鼠品系和年龄可能会影响手术，因为脂肪堆积会干扰门静脉的可视化。当用胶带将爪子贴下来时，必须注意不要对颈部施加任何可能导致窒息的压力。此外，小鼠越?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe	N/A	N/A	Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column	N/A	N/A	Custom Made
2-0 Silk Suture	Braintree Scientific	N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety	Terumo	SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26426
4x4 in. Surgical Platform	N/A	N/A	Custom Made
70% Alcohol Wipe	N/A	N/A	Non-specific Brand
Circulating Water Bath	MS Lauda	N/A	Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator	N/A	N/A	Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-0704-06
Lidocaine HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator	Radnoti	N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "	Roboz	RS-6013
Oxygen Meter System	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
Saline 0.9% Solution	N/A	N/A	Saline is made in lab
Scale	N/A	N/A	Non-specific Brand
Variable Speed Analog Console Pump Systems	Cole Palmer	N/A	Models are custom per application
Weigh boats	N/A	N/A	Non-specific Brand