Ex Vivo 마우스의 포털 정맥을 통한 간 관류

요약

이 프로토콜은 포털 정맥 관류를 통한 대사 연구를 위해 손상되지 않은 마우스 간을 절제하는 간단한 방법을 설명합니다.

초록

당뇨병, 전당뇨병, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 및 비알콜성 지방간염(NASH)과 같은 대사성 질환이 점점 더 흔해지고 있습니다. 생체외 간 관류는 엄격하게 조절될 수 있는 영양 조건에서 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 간 대사를 종합적으로 분석할 수 있게 해줍니다. 실리코 시뮬레이션에서와 마찬가지로 호르몬 작용과 제약 개입의 효과를 평가하는 주로 이론적 인 수단으로 남아 있기 때문에 관류 된 간은 간 대사를 이해하기위한 가장 가치있는 테스트 베드 중 하나입니다. 이 연구들이 간 생리학에 대한 기본적인 통찰력을 안내하기 때문에 결과는 정확하고 재현 가능해야합니다. 생체외 간 관류의 재현성의 가장 큰 요인은 수술의 질이다. 따라서, 우리는 현장 NMR 실험의 맥락에서 생체외 마우스 간 관류를 수행하기 위해 조직적이고 간소화 된 방법을 도입했습니다. 우리는 또한 독특한 응용 프로그램을 설명하고 이러한 연구에서 직면 한 일반적인 문제에 대해 논의합니다. 전반적인 목적은 현장 NMR 실험의 맥락에서 간 절제술 및 관류에서 재현 가능한 결과를 얻기위한 황금 표준으로 간주되는 몇 년 동안 정제 한 기술에 대한 복잡하지 않은 가이드를 제공하는 것입니다. 자석에 대한 필드 중심까지의 거리뿐만 아니라 NMR 실험 중에 개입 할 수있는 조직의 접근성이 없기 때문에 우리의 방법은 새로운 방법입니다.

서문

생체 외 관류는 간 대사 연구에서 매우 중요하며, 포털 정맥을 통한 관류는 이러한 연구의 표준입니다. 간 대사를 개별적으로 연구하기 위해서는 다른 장기의 신진 대사 (즉, 전신 대사)로 인한 합병증을 피하고 호르몬 가용성 (인슐린, 글루카곤 등)을 조절하기 위해 간을 신체에서 절제해야합니다. 이 접근법은 당뇨병, NAFLD 및 NASH와 같은 질병이 간 대사에 미치는 영향뿐만 아니라 약물 작용 메커니즘을 이해하는 데 필수적 일 수 있습니다. 이 기사는 간 절제술과 관류에 대한 가이드 역할을합니다. 우리는 충분한 엄격함과 재현성으로 이러한 대사 간 연구를 수행하기위한 간소화 된 절차를 개발했습니다. 수술이 올바르게 수행되지 않으면 얻은 대사 데이터에 뚜렷한 변동성이 있습니다. 우리는 문헌 1,2,3,4,5에 기재된 바와 같이, 핵 자기 공명 (NMR) 분광계에서 계내에서 대사 연구의 맥락에서 문맥 정맥 카테터 삽입 및 간 절제술을 수행하는 조직화 된 방법을 기술한다.

현재, NMR 내의 유리 컬럼을 이용한 생체외 간 관류를 기술하는 문헌은 없다. 또한 마우스 간으로 절차를 수행하는 방법에 대한 명확한 예를 제공하는 비디오 또는 텍스트 간행물도 없으며, 특히 포털 정맥을 카테터화하고, 간을 절제하고, 간을 유리 기둥에 걸고, 매달아 놓는 방법을 보여줍니다. 유전자 변형 마우스는 간 대사를 연구하는 데 유비쿼터스로 사용되기 때문에 이것은 완전한 설명을받을 가치가있는 필수 절차입니다. 간 관류 수술은 새로운 것이 아니지만이 기사는이 절차에 관심이있는 모든 사람들을 돕기 위해이 논문에 설명 된 기술적 우수성을 보여주는 비디오와 함께 황금 표준 방법입니다. 여기에 제시된 방법은 질병 모델에서 대사 산물의 기능과 회전율을 감지하기 위해 실시간 신진 대사에 가장 잘 적용될 것입니다.

이 방법은 100cm 물 재킷 유리 컬럼을 사용하여 간이 NMR 튜브 내부의 향수에 의해 캡슐화 된 캐뉼라의 바닥에 매달릴 수있게합니다. 유리 재킷의 가열 된 물은 향수 온도를 제어하는 데 사용됩니다. 박층 산소 발생기는 pH 제어를 위해 95 % / 5 % O2 /_CO2로 가압됩니다. 세 개의 개별 펌프를 사용하여 향수 컬럼 높이를 설정하여 간에 일정한 압력을 제공합니다. 유량은 일정한 압력의 적용 이상으로 제어되지 않습니다(그림 1). 간이 적절하게 기능하고 있는지 확인하기 위해 산소 측정은 유속과 함께 수행됩니다. 우리의 손에,이 전제 조건의 세트는 간 대사 기능의 평가를위한 매우 반복 가능한 NMR 실험으로 이어집니다.

프로토콜

마우스와 관련된 실험은 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 #201909320)에 따라 처리되었습니다. 사용된 마우스 균주는 C57BL/6J; 모든 마우스는 수컷이었다. 이 방법은 일반적으로 다른 표준 마우스 균주를 사용한 연구에도 적용 가능하다. 이 수술은 함께 일하는 두 사람이 최적으로 수행합니다.

1. 초기 설정

1. Krebs-Henseleit 전해질 6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 각각 1.2 mM MgSO4, KH2PO4 및 0.5 mM 나트륨-EDTA, _1.25mM CaCl2_), ⁶ mM 젖산나트륨, 0.6 mM 피루베이트 나트륨, 0.2 mM [U-13 C]프로피오네이트_나트륨, ¹⁰%(v/v)_D2O, 및 0.63 mM 혼합 지방산 (팔미트산 (전체의 22.1 %), 팔미톨레산 (5.2 %), 스테아르 산 (2.7 %), 올레산 (27 %), 리놀레산 (37.7 %), γ-리놀렌산 (2.4 %), 데코사헥사노산 (2.8 %)과 소 혈청 알부민 2 % (w/v) 포함). HCl (및 필요한 경우 NaOH)을 사용하여 향수의 최종 pH를 7.3으로 설정하십시오.

2. 수술 전 설정

1. 길이가 19.05mm인 23G 바늘로 두 개의 1mL 주사기를 조립합니다. 1 개의 주사기를 0.01 mL의 1000 단위 / mL 헤파린 및 0.19 mL의 식염수 (0.9 % (w / v) NaCl)로 물에 채 웁니다. 표 1).
2. 제2 주사기를 0.2 mL의 2% 리도카인 및 0.6 mL의 0.9% 식염수로 채운다(표 1). 27 G 38.1 mm 바늘을 갖는 또 다른 1 mL 주사기에서, 방향제를 채우고 37°C에서 유지한다.

3. 향수 컬럼 설정

1. 향수 500mL가 들어있는 유리병을 수조에 넣습니다(그림 1B). 수조를 켜고 온도를 ~ 42 °C로 설정하십시오. 수조에서 더 높은 온도는 관류 컬럼에서 37°C를 유지할 수 있게 한다.
2. 물이 42°C까지 가열되면 두 개의 펌프를 켜서 병에서 나오는 향수를 박막 산소기 및 물 재킷이 있는 100cm 유리 컬럼 전체에 걸쳐 순환시킵니다(그림 1A-E).
3. 산소화 가스(산소 95% 및 이산화탄소 5%)를 켜서 산소발생기(⁷)를 가압합니다(그림 1C). 카테터가 부착된 상태에서 8mL/min의 유속을 달성하기 위해 퍼퓨세이트 컬럼 높이를 조정합니다(유량 측정은 9단계 참조)^5,8,9.
   참고 : 유속은 향수가 간에서 배출되는 속도를 나타냅니다.

4. 마우스의 마취

1. IACUC 프로토콜 및 기타 적절한 안전 지침에 따라 Don PPE를 사용합니다.
   참고: 다음 단계는 9 - 13 주 된 마우스에 최적화되었습니다.
2. 마우스를 이소플루란 챔버에 놓는다. 전달 가스를 100% 산소, 1L/min의 유량, 이소플루란을 2%¹⁰으로 전환합니다. 호흡이 느려지고 안정 될 때까지 기다리십시오.
   참고 : 느리고 꾸준한 호흡률과 발가락 꼬집음 반사 부족으로 입증 된 바와 같이 마우스가 안정적인 수술 평면에 도달하려면 산소 유량을 ~ 1.5 L / min에서 ~ 3 L / min으로, 이소플루란 농도를 1 - 3 %로 조정할 수 있습니다. 캐리어 가스 및 이소플루란 농도의 전달 속도는 동물의 나이와 무게 및 소음 및 빛과 같은 요인에 따라 다릅니다.
3. 복부를 70 % 알코올로 소독하십시오. 복부 지방층에 깊은 피하 주사를 통해 헤파린을 투여하십시오 (그림 2). 마우스를 다시 10분 동안 마취실에 넣는다.
   참고: 이 절차는 터미널이므로 면도할 필요가 없습니다.

5. 감방 절제술

1. 마우스를 마취실에서 수술 플랫폼으로 옮기고 수핀 위치에 놓습니다 (그림 3).
2. 마우스의 코를 코 콘에 넣고 발을 아래로 테이프로 붙입니다. 질식으로 이어질 수있는 목에 어떤 부담도주지 않도록주의하십시오.
3. 전방 장골 크레스트 영역(¹¹ )에서 양측으로 피하 주사를 통해 리도카인을 투여한다(도 3). 발가락 꼬집음 검사를 수행하여 모든 통증 반사 신경이 없는지 확인하십시오.
4. 내부 장기를 노출시키기 위해 감방 절제술을 시행하십시오 (그림 4). 3cm 너비의 절개 (마우스의 전체 복부 너비)를 만듭니다.
   참고 : 너비는 마우스의 나이와 식단에 따라 변경됩니다.
5. xiphoid 공정에 클램핑하여 견인력을 당기는 지혈제를 사용하여 절개를 확장합니다 (그림 4).

6. 포털 정맥의 캐뉼레이션

1. 면봉이 달린 어플리케이터를 사용하여 포털 정맥을 덮고있는 작고 큰 내장을 제거하십시오. 실크 봉합사를 간장에 가까운 포털 정맥의 아치 아래에 놓습니다 (그림 4A).
2. 해부학 적 구조에 따라 간에서 열등한 장간막 정맥 원위 (그림 4A)^12,13의 근위 또는 원위 두 번째 실크 봉합사를 놓습니다. 두 봉합사에 2-0 봉합사를 사용하십시오.
3. 봉합사가 제자리에 놓이면 22G 카테터(¹⁴ )로 포털 정맥을 캐뉼레이트한다(그림 4B). 카테터를 삽입 할 때 경사를 위로 향하게하십시오. 포털 정맥을 15° 각도로 입력하지 마십시오.
4. 첫 번째 봉합사를 카테터 테이퍼를 지나 묶습니다. 포털 정맥이 캐뉼레이션 된 후, 실크 봉합사로 포털 정맥의 가지에서 2-3mm 원위 카테터를 고정시킵니다 (그림 4B).
   참고 : 조수는 카테터가 빠지거나 포털 정맥이 찢어지지 않도록 어깨와 손목을 굴려야합니다. 각 봉합사에는 두 개의 매듭이 필요합니다.
5. 다음으로, 두 번째 봉합사로 카테터의 하부를 고정하십시오. 외과 보조원의 도움으로 봉합사와 매듭을 묶어 카테터를 문맥 정맥과 주변 조직의 원위 부분에 고정시킵니다.

7. 간 후 포털 정맥 통조림의 절제술

1. 카테터가 고정된 후 38.1mm 길이의 27G 바늘이 있는 1mL 주사기를 카테터에 삽입하여 혈액과 기포를 내뿜습니다.
   참고 : 일반적으로 압력에서 카테터에서 혈액의 역류가 있습니다.
2. 고정된 스톱콕이 있는 1mm I.D. x 5mm O.D. 실리콘 튜브를 사용하여 관류 컬럼(그림 1A)을 카테터에 결합시켜 완충액이 간 내로 흐르도록 하여 관류의 시작을 표시한다. 이 시점에서 타이머를 시작하여 관류의 시작을 표시하십시오.
3. 가위를 사용하여 절개를 하여 혈관 압력 상승을 완화하여 열등한 정맥 카바에 넣습니다.
4. 간 색이 분홍색/빨간색에서 옅은 노란색으로 균질하게 변하는 것을 관찰하여 간을 통한 향수의 흐름을 확인합니다. 흐름이 확인되면 위, 소장, 대장 및 오른쪽 신장을 주변 조직에서 소비하십시오.
5. 외과 조수의 도움으로 외과 의사가 정수리 복막과 흉부 조직을 통해 간을 절단하여 간을 절제하기 위해 복강 및 흉강 주위의 간을 조종하십시오.
6. 마지막으로, 간을 위로 들어 올리고 가위로 간을 고정시키는 나머지 결합 조직을 자릅니다. 쉽게 볼 수 있도록 간을 천천히 조작하십시오. NMR 튜브 내에 캡슐화하기 전에 향수로 헹구어 간장에 달라 붙는 모피를 제거하십시오.
   참고: 이 절차에서는 간만 제거됩니다. 다른 모든 기관은 동물의 몸에 남아 있습니다. 담관은 실험의 프로토콜에 기초하여 제거될 수 있다. 이 실험을 위해, 그것은 제자리에 남겨졌다.

8. 기둥에서 간을 매달아 놓기

1. 외과 의사가 간과 튜브를 조수에게 건네면 조수는 튜브를 카테터와 기둥에서 분리합니다.
2. 카테터 상단에 반월 연골이 형성 될 때까지 카테터를 향수로 채 웁니다. 카테터를 기둥에 부착하여 간이 매달려 관류하도록하십시오.
   참고: 카테터의 향수 비드는 간이 연결될 때까지 기능하기에 충분한 부피를 제공합니다. 간장에 부착 된 카테터는 기둥의 바닥에 장착 된 프레스입니다.
3. 20mm NMR 튜브를 100cm 유리 컬럼에 조여서 간을 캡슐화합니다(그림 5). 간과 문맥 정맥의 비틀림을 피하려면 NMR 튜브를 천천히 조이십시오. 비틀림이 발생하고 흐름이 중지되면 NMR 튜브의 나사를 풀고 다시 끼워 넣습니다. 이것은 폐색을 치료하고 흐름이 돌아올 것입니다.
4. 연구의 세부 사항에 따라 30-60 분 동안 간을 관류하십시오.
   참고 : 시간은 관류 실험을 기반으로합니다. 이 실험을 위해, 대사 회전율은 30분 이내에 측정되었다. 간 관류는 정상 상태에 도달하는 데 최대 10 분이 걸릴 수 있습니다. 정상 상태까지의 시간은 열등한 정맥 카바가 절단되고 간 흐름이 확립되면 시작됩니다.

9. 유량 측정

1. 계량 보트를 상단 적재 저울에 놓고 저울을 제로로 만듭니다. 롤러 펌프에서 NMR의 원심성 향수를 계량 보트로 당기는 튜브를 놓고 타이머를 시작하십시오.
2. 간 유속을 산출하는 1 분 동안 축적 된 액체의 질량을 계량하십시오. 튜브를 폐기물/수거 용기에 다시 넣습니다.

10. 산소 측정

참고: 산소 측정기 측정은 제조업체의 지침¹⁵에 따라 설정되었습니다.

1. 20 μL의 50% KCl 포화 용액을 함유하는 전극을 백금 돔 위에 놓고 전극의 하부 백금 고리 주위에 5개의 10 μL 방울을 놓는다.
2. 담배 종이에서 접착제를 제거하십시오. 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인 조각을 궐련지 위에 올려 놓는다.
3. 두 조각을 전극 위에 놓습니다. 전극 상단에 작은 O 링을 끼워 넣으십시오. 용지를 다듬어 전극의 아래쪽 백금 링에 평평하게 놓습니다.
   참고: 일부 오버행은 허용됩니다. 전극의 은을 덮는 것이 필수적입니다.
4. 더 큰 O 링을 전극 위에 놓습니다. 전극을 물 챔버에 결합하고 베이스를 조여서 전극을 제자리에 고정시킵니다. 수조를 켜고 37 °C까지 가열하십시오.
5. 개방형 산소 측정기 소프트웨어. 공기 포화 물 보정> 클릭하십시오. 교반기 속도를 75로 설정하고 온도를 37°C로 설정합니다.
6. 50 mL 바이알을 반쯤 물로 채우고 2 분 동안 격렬하게 흔들어주십시오. 이것은 공기 포화 된 물이므로 100 % 표준으로 사용하십시오. 산소 측정기 챔버를 ~ 2mL의 물로 채우고 2 피스 마개를 켭니다.
7. 화면에서 확인을 클릭하고 신호가 고원이 되도록 허용합니다. 신호가 고원에 도달하면 확인을 클릭합니다. 챔버에 액체를 처분하고 티슈 페이퍼로 건조하십시오.
8. 10.6-10.7단계를 반복하되 200mM 아황산나트륨(0% 표준)을 사용합니다. 교정 저장을 클릭합니다.
   참고: 0% 표준에는 격렬한 흔들림이 필요하지 않습니다.
9. 관류 중에는 두 개의 5 mL 주사기를 사용하십시오. 하나는 방향제(산소 내)를 순환시키기 위한 주사기이고 두 번째는 NMR 튜브로부터의 원심성 퍼퓨세이트(산소 배출)를 위한 주사기이다.
10. 인/아웃 측정을 위해 향수를 그릴 때는 매번 3-4mL를 그립니다.
    참고: 이 컬럼에는 NMR 튜브에 접근하여 간을 통해 유입된 향수를 인출할 수 있는 유리 튜브가 있습니다.
11. 순환 방향제를 먼저 단계 10.6에서 물과 마찬가지로 측정하고 단계 10.7에서 폐기한다. 원심성 향수에 대해 동일한 단계를 반복하십시오.
12. 10분마다 산소 측정을 수행합니다.

결과

간 기능은 주로 산소 소비와 유속으로 평가됩니다. 4-8 mL/min의 유속과 1 μmol/min.g의 산소 소비가 전형적이다. 이러한 측정은 특정 실험 조건 및 생물학적 차이에 따라 달라질 수 있습니다.

사용되는 이소플루란의 정확한 양은 사용되는 마취 시스템의 유형뿐만 아니라 마우스의 환경 및 연령 / 체중에 따라 다릅니다. 수술 동안, 이소플루란 및 전달 가스는 변하지 않지만, 수술 영...

토론

이 수술 절차는 도전적이며 재현 가능한 결과를 얻기 위해 광범위한 연습이 필요합니다. 이소플루란과 캐리어 가스는 가능한 한 많은 수술 절차를 통해 동물의 생존력을 유지하기 위해 필요에 따라 조정되어야합니다. 환경, 시간, 나이, 체중 및 기타 여러 요인이 마취에 영향을 미칩니다. 체중,식이 요법, 생쥐의 긴장 및 나이는 지방 축적이 포털 정맥을 시각화하는 것을 방해 할 수 있으므로 수술?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe	N/A	N/A	Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column	N/A	N/A	Custom Made
2-0 Silk Suture	Braintree Scientific	N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety	Terumo	SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles	Exel International	26426
4x4 in. Surgical Platform	N/A	N/A	Custom Made
70% Alcohol Wipe	N/A	N/A	Non-specific Brand
Circulating Water Bath	MS Lauda	N/A	Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator	N/A	N/A	Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 "	Roboz	RS-6702
Dumont #5/45 Forceps	Fine Scientific Tools	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	Fine Scientific Tools	11274-20
Hemostats	Fine Scientific Tools	13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL	RX Generics	71288-0402-02
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-0704-06
Lidocaine HCl 2%	VEDCO Inc.	50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator	Radnoti	N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 "	Roboz	RS-6013
Oxygen Meter System	Hanstech Instruments Ltd.	N/A
Saline 0.9% Solution	N/A	N/A	Saline is made in lab
Scale	N/A	N/A	Non-specific Brand
Variable Speed Analog Console Pump Systems	Cole Palmer	N/A	Models are custom per application
Weigh boats	N/A	N/A	Non-specific Brand