JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بناء طفرات فارغة من Aeromonas في جليكوزيل ترانسفيراز محددة أو مناطق تحتوي على جليكوزيل ترانسفيراز ، ومقايسات الحركة ، وتنقية السوط التي أجريت لتحديد مشاركة ووظيفة إنزيماتها المشفرة في التخليق الحيوي للجليكان ، وكذلك دور هذا الجلايكان في التسبب البكتيري.

Abstract

دراسة الجليكوزيل في بدائيات النوى هي منطقة سريعة النمو. تؤوي البكتيريا هياكل جليكوزيلية مختلفة على سطحها تشكل جليكان رمزا شريطيا خاصا بالسلالة. تظهر الجليكان المرتبطة بها تنوعا أعلى في تكوين السكر وبنيته مقارنة بحقيقيات النوى وهي مهمة في عمليات التعرف على المضيف البكتيري والتفاعل مع البيئة. في البكتيريا المسببة للأمراض ، شاركت البروتينات السكرية في مراحل مختلفة من العملية المعدية ، ويمكن أن تتداخل تعديلات الجليكان مع وظائف محددة للبروتينات السكرية. ومع ذلك ، على الرغم من التقدم المحرز في فهم تكوين الجليكان والبنية ومسارات التخليق الحيوي ، فإن فهم دور البروتينات السكرية في الإمراض أو التفاعل مع البيئة لا يزال محدودا للغاية. علاوة على ذلك ، في بعض البكتيريا ، يتم مشاركة الإنزيمات اللازمة لغليكوزيل البروتين مع مسارات التخليق الحيوي الأخرى متعددة السكاريد ، مثل عديد السكاريد الدهني ومسارات التخليق الحيوي للكبسولة. تم توضيح الأهمية الوظيفية للغليكوزيل في العديد من البكتيريا من خلال طفرة جينات محددة يعتقد أنها تشارك في عملية الجليكوزيل ودراسة تأثيرها على التعبير عن البروتين السكري المستهدف وتعديل الجليكوسين. تحتوي Aeromonas الميزوفيليك على سوط قطبي واحد و O-glycosylated. يظهر السوط غليكان تنوعا في تكوين الكربوهيدرات وطول السلسلة بين سلالات Aeromonas . ومع ذلك ، فإن جميع السلالات التي تم تحليلها حتى الآن تظهر مشتقا من حمض pseudaminic كسكر مرتبط يعدل بقايا السيرين أو الثريونين. مشتق حمض pseudaminic مطلوب لتجميع السوط القطبي ، وفقدانه له تأثير على الالتصاق ، وتشكيل الأغشية الحيوية ، والاستعمار. يصف البروتوكول المفصل في هذه المقالة كيف يمكن استخدام بناء الطفرات الخالية لفهم تورط الجينات أو مناطق الجينوم التي تحتوي على جليكوزيل ترانسفيراز المفترضة في التخليق الحيوي للجليكان السوط. وهذا يشمل القدرة على فهم وظيفة الجليكوسيل ترانسفيراز المعنية ودور الجلايكان. وسيتم تحقيق ذلك من خلال مقارنة المتحور الناقص في الغليكان بالسلالة البرية.

Introduction

تم وصف غليكوزيل البروتين في كل من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام ويتكون من الارتباط التساهمي للجليكان بسلسلة جانبية من الأحماض الأمينية 1,2. في بدائيات النوى ، تحدث هذه العملية عادة عبر آليتين إنزيميتين رئيسيتين: O- و N-glycosylation 3. في O-glycosylation ، يتم ربط الغليكان بمجموعة الهيدروكسيل من بقايا سيرين (Ser) أو ثريونين (Thr). في N-glycosylation ، يتم ربط الجليكان بسلسلة نيتروجين أميد الجانبية لبقايا الأسباراجين (Asn) داخل تسلسلات الببتيد الثلاثي Asn-X-Ser / Thr ، حيث يمكن أن يكون X أي حمض أميني باستثناء البرولين.

يمكن أن يعتمد الجليكان هياكل خطية أو متفرعة ويتكون من السكريات الأحادية أو السكريات المتعددة المرتبطة تساهميا بروابط غليكوزيدية. في بدائيات النوى ، عادة ما يظهر الجليكان تنوعا في تكوين السكر وبنيته مقارنة بالجليكان حقيقيات النواة4. علاوة على ذلك ، تم وصف مسارين مختلفين للغليكوزيل البكتيري يختلفان في كيفية تجميع الجليكان ونقله إلى البروتين المستقبل: الغليكوزيل المتسلسل و en bloc 5,6. بالنسبة للغليكوزيل المتسلسل ، يتم بناء الجليكان المعقد مباشرة على البروتين عن طريق الإضافة المتتالية للسكريات الأحادية. في الغليكوزيل في الكتلة ، يتم نقل جليكان تم تجميعه مسبقا إلى البروتين من أوليغوساكاريد مرتبط بالدهون بواسطة أوليغوساكاريل ترانسفيراز متخصص (OTase). وقد ثبت أن كلا المسارين متورطان في عمليات N- و O-glycosylation 7.

غليكوزيل البروتين له دور في تعديل الخصائص الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية للبروتينات. يمكن أن يؤثر وجود الجليكان على كيفية تفاعل البروتين مع رباطه ، مما يؤثر على النشاط البيولوجي للبروتين ، ولكن يمكن أن يؤثر أيضا على استقرار البروتين ، والذوبان ، والقابلية للتحلل البروتيني ، والمناعة ، والتفاعلات بين الميكروبات والمضيف 8,9. ومع ذلك ، فإن العديد من معلمات الجليكوزيل ، مثل عدد الجليكان ، وتكوين الجليكان ، والموضع ، وآلية التعلق ، يمكن أن تؤثر أيضا على وظيفة البروتين وبنيته.

Glycosyltransferases (GTs) هي الإنزيمات الرئيسية في التخليق الحيوي للجليكان المعقدة و glycoconjugates. تحفز هذه الإنزيمات تكوين الرابطة الغليكوسيدية بين مويتي السكر من جزيء متبرع نشط ومتقبل ركيزة معين. يمكن أن تستخدم GTs كلا من النيوكليوتيدات وغير النيوكليوتيدات كجزيئات مانحة وتستهدف مستقبلات الركيزة المختلفة ، مثل البروتينات والسكريات والأحماض النووية والدهون10. لذلك ، فإن فهم GTs على المستوى الجزيئي مهم لتحديد آليات عملها وخصوصيتها ، كما يمكن من فهم كيفية ارتباط تكوين السكر في الجليكان الذي يعدل الجزيئات ذات الصلة بالإمراض. تصنف قاعدة بيانات إنزيم الكربوهيدرات النشطة (CAZy)11 GTs وفقا لتماثل تسلسلها ، مما يوفر أداة تنبؤية نظرا لأن الطية الهيكلية وآليات العمل ثابتة في معظم عائلات GT. ومع ذلك ، هناك أربعة أسباب تجعل من الصعب التنبؤ بخصوصية الركيزة للعديد من GTs: 1) لم يتم تحديد أي شكل تسلسل واضح يحدد خصوصية الركيزة في بدائيات النوى12 ، 2) تظهر العديد من GTs و OTases اختلاط الركيزة 13,14 ، 3) يصعب إنتاج GTs الوظيفية في غلة عالية في شكل مؤتلف و 4) تحديد كل من الركائز المانحة والمتقبلة أمر معقد. وعلى الرغم من ذلك، مكنت دراسات الطفرات الحديثة من الحصول على تقدم كبير في فهم الآليات التحفيزية وطرح ربط GTs.

في البكتيريا ، يبدو أن O-glycosylation أكثر انتشارا من N-glycosylation. لا تظهر مواقع O-glycosylation تسلسلا إجماعا ، والعديد من بروتينات O-glycosylated تفرز أو بروتينات سطح الخلية ، مثل السوط أو pili أو autotransporters 1. يظهر السوط غليكوزيل التباين في عدد المواقع المتقبلة ، وتكوين الجليكان ، والهيكل. على سبيل المثال ، لدى أساطيل Burkholderia spp موقع متقبل واحد فقط ، بينما في Campylobacter jejuni ، لدى الأسواط ما يصل إلى 19 موقعا متقبلا15,16. علاوة على ذلك ، بالنسبة لبعض البكتيريا ، فإن الغليكان عبارة عن سكاريد أحادي واحد ، في حين أن البكتيريا الأخرى تمتلك جليكان غير متجانس مخترق من السكريات الأحادية المختلفة لتشكيل السكريات القليلة. يحدث هذا التباين حتى بين سلالات من نفس النوع. يتم تعديل سوط هيليكوباكتر فقط بواسطة حمض البسيودامينيك (PseAc)17 ، ويمكن تعديل سوط العطيفة بواسطة PseAc ، وهو شكل الأسيتاميدينو من حمض pseudaminic (PseAm) أو حمض legionaminic (LegAm) ، والجليكان المشتق من هذه السكريات مع الأسيتيل أو N-acetylglucosamine أو بدائل البروبيونيك18,19. في Aeromonas ، يتم تعديل السوط بواسطة الجليكان الذي يتراوح تكوينه من مشتق حمض PseAc واحد إلى عديد السكاريد غير المتجانس20 ، ويكون ارتباط الجليكان بمونومرات السوط دائما عبر مشتق PseAc.

بشكل عام ، يعد غليكوزيل السوط ضروريا لتجميع خيوط السوط ، والحركة ، والضراوة ، وخصوصية المضيف. ومع ذلك ، في حين أن السوط من C. jejuni16 ، H. pylori17 ، و Aeromonas sp. 21 لا يمكن أن تتجمع في خيوط ما لم تكن مونومرات البروتين هي غليكوزيليتد ، Pseudomonas spp. و Burkholderia spp. 15 لا تتطلب غليكوزيل لتجميع السوط. علاوة على ذلك ، في بعض سلالات C. jejuni ، تؤثر التغيرات في تكوين السكر في السوط غليكان على التفاعل بين البكتيريا والمضيف وقد تلعب دورا في التهرب من بعض الاستجابات المناعية16. التراص الذاتي هو سمة مظهرية أخرى تتأثر بالتعديلات في تكوين الجليكان المرتبطة بالسوط. يؤدي انخفاض التراص الذاتي إلى انخفاض القدرة على تكوين المستعمرات الدقيقة والأغشية الحيوية22. في بعض البكتيريا ، تم ربط قدرة السوط على تحفيز استجابة مؤيدة للالتهابات بغليكوزيل السوط. وهكذا ، في P. aeruginosa ، يحفز السوط الغليكوزيلاتي استجابة أعلى مؤيدة للالتهابات من unglycosylated23.

Aeromonas هي بكتيريا سالبة الجرام منتشرة في كل مكان في البيئة ، مما يسمح لها بأن تكون في واجهة جميع مكونات One Health 24. تحتوي Aeromonas الميزوفيليك على سوط قطبي واحد ، يتم إنتاجه بشكل تأسيسي. أكثر من نصف العزلات السريرية تعبر أيضا عن السوط الجانبي ، الذي يمكن تحريضه في وسائط أو ألواح عالية اللزوجة. وقد ربطت دراسات مختلفة كلا النوعين من الأسواط بالمراحل المبكرة من التسبب في البكتيريا25. في حين أن السوط القطبي المبلغ عنه حتى الآن هو O-glycosylated في 5-8 Ser أو Thr بقايا مجالاته المناعية المركزية ، فإن السوط الجانبي ليس جليكوزيلا O-glycosylated في جميع السلالات. على الرغم من أن جليكان السوط القطبي من سلالات مختلفة يظهر تنوعا في تركيبته الكربوهيدراتية وطول السلسلة20 ، فقد ثبت أن السكر الرابط هو مشتق حمض البسيودامينيك.

الهدف من هذه المخطوطة هو وصف طريقة للحصول على طفرات فارغة في GTs محددة أو مناطق كروموسومية تحتوي على GTs لتحليل مشاركتها في التخليق الحيوي لالسكريات ذات الصلة وفي الإمراض البكتيرية ، وكذلك دور الجليكان نفسه. على سبيل المثال ، نقوم بتحديد وحذف منطقة كروموسومية تحتوي على GTs من Aeromonas لإثبات مشاركتها في غليكوزيل السوط القطبي وتحليل دور جليكان السوط. نوضح كيفية حذف GT معين لتحديد وظيفته في التخليق الحيوي لهذا الجليكان ودور الجليكان المعدل. على الرغم من استخدام Aeromonas كمثال ، يمكن استخدام المبدأ لتحديد ودراسة جزر غليكوزيل السوط من البكتيريا الأخرى سالبة الجرام وتحليل وظيفة GTs المشاركة في التخليق الحيوي للجليكان الأخرى مثل عديد السكاريد الدهني O-antigen.

Protocol

يظهر التمثيل التخطيطي للإجراء في الشكل 1.

1. تحديد المعلوماتية الحيوية لجزيرة السوط غليكوزيل (FGIs) في Aeromonas

  1. لتحديد مجموعات التخليق الحيوي PseAc في جينومات Aeromonas ، استخدم أداة tblastn من قاعدة بيانات NCBI26. أولا ، استرجع البروتينات التقويمية إلى PseC و PseI من A. piscicola AH-3 (رموز التعريف هي OCA61126.1 و OCA61113.1) من قواعد بيانات سلالات Aeromonas المتسلسلة ، ثم استخدم أداة tblastn للبحث في تسلسلات النيوكليوتيدات المترجمة.
    ملاحظة: تحيط جينات pse ب Aeromonas FGIs ، حيث يقع pseB و pseC في أحد طرفي المجموعة و pseI في الطرف الآخر. يمكن أن يختلف موقع بقية جينات pse من مجموعة FGI إلى أخرى.
  2. بالنظر إلى أن جينات السوط القطبي هذه للعديد من السلالات مجاورة ل FGIs ، استخدم tblastn من قاعدة بيانات NCBI للعثور على البروتينات التقويمية للسوط القطبي FlaA و FlaB من A. piscicola AH-3 (رموز التعريف هي OCA61104.1 و OCA61105.1) والجينات التي تشفرها.
  3. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي Aeromonas FGIs المشاركة في التخليق الحيوي للجليكان غير المتجانس متعدد السكريات (المجموعة الثانية)27 على العديد من الجينات التي تشفر الإنزيمات المشاركة في تخليق الأحماض الدهنية ، مثل luxC و luxE. استخدم tblastn من قاعدة بيانات NCBI للعثور على البروتينات التقويمية إلى LuxC of A. piscicola AH-3 (رمز التعريف هو OCA61121.1) والجين الذي يشفره.

2. توليد الطفرات الخالية في جينات جزيرة غليكوزيل السوط

ملاحظة: تعتمد طريقة الطفرات هذه على التبادل الأليلي لمنتجات الحذف داخل الإطار باستخدام ناقل الانتحار pDM428 (GenBank: KC795686.1). يعتمد تكرار ناقل pDM4 على لامدا بير ، ويتم إكراه التبادل الأليلي الكامل باستخدام جين sacB الموجود على المتجه.

  1. بناء منتجات حذف PCR داخل الإطار.
    1. تصميم زوجين من الاشعال التي تضخم مناطق الحمض النووي في المنبع (A و B الاشعال ) والمصب (C و D الاشعال ) من الجين أو المنطقة المختارة المراد حذفها (الشكل 2B).
    2. تأكد من أن التمهيدي A و D لديهما أكثر من 600 نقطة أساس في المنبع من البداية والمصب من محطة ، على التوالي ، للجين أو الجينات المراد حذفها. يجب أن يتضمن هذان التمهيديان في نهاية 5 'موقع تقييد ل endonuclease الذي يسمح بالاستنساخ في pDM4.
      ملاحظة: يجب ألا يكون موقع التقييد المضمن في نهاية 5 أقدام من التمهيدي A وD هو نفسه المواقع الموجودة داخل مضخمات AB أو CD.
    3. تأكد من أن الاشعال B و C داخل الجين المراد حذفه أو داخل الجين الأول والأخير ، على التوالي ، من المنطقة المراد حذفها. تأكد من أن كلا من الاشعال (B و C) في الإطار وتقع بين 5-6 كودونات داخل الجين. علاوة على ذلك ، تأكد من أن كلا التمهيديين يشملان في نهاية 5 'تسلسل تكميلي 21 نقطة أساس (الجدول 1) يسمح بالانضمام إلى أمبليونات الحمض النووي AB و CD.
    4. تنمو سلالة Aeromonas المختارة في 5 مل من مرق الصويا التربتيك (TSB) بين عشية وضحاها (O / N) عند 30 درجة مئوية. استخدم مجموعة أدوات متاحة تجاريا لتنقية الحمض النووي الجينومي واتبع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). حدد كميا 2 ميكرولتر من الحمض النووي النقي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: استخدم الماء المقطر المزدوج كفراغ، مع ضبط الجهاز لتسجيل الامتصاص عند 260 نانومتر. سجل الامتصاص مع 2 ميكرولتر من الحمض النووي النقي 3-5 مرات وحساب متوسط قراءة الامتصاص. استخدم قانون بير لامبرت لحساب تركيز الحمض النووي، حيث A = Ɛ.c.l. حيث "A" هو الامتصاص، "Ɛ" هو معامل الانقراض المتوسط المولي للحمض النووي، "c" هو تركيز الحمض النووي، و "l" هو طول المسار (راجع تعليمات الشركة المصنعة لطول مسار كل أداة).
    5. استخدم 100 نانوغرام من الحمض النووي الكروموسومي النقي كقالب في مجموعتين من PCR غير المتماثلة مع الاشعال A-B و C-D (جدول المواد). استخدم نسبة مولية 10:1 من أزواج التمهيدي A:B و D:C (مادة تكميلية).
      ملاحظة: تسمح PCRs غير المتماثلة بالتضخيم التفضيلي لفرع واحد من القالب أكثر من الآخر.
    6. تحليل منتجات PCR عن طريق الرحلان الكهربائي في هلام الأغاروز 1٪. استخدم TAE (40 mM Tris-acetate ، 1 mM EDTA) كمخزن مؤقت لتشغيل الجل وإعداد طاقة يبلغ 8 فولت / سم. لتصور الحمض النووي، أضف بروميد الإيثيديوم (0.5 ميكروغرام/مل) إلى الجل وتصور منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام محطة تصوير حيوي (جدول المواد).
    7. قم باستئصال الأمبليونات من الجل باستخدام مشرط ، وتنقيتها باتباع بروتوكول الشركة المصنعة (جدول المواد) وتحديدها كميا.
    8. انضم إلى أمبليونات AB و CD من خلال تسلسلاتها المتداخلة 21 نقطة أساس في نهاية 3 'من منتجات PCR (الشكل 3). امزج 100 نانوغرام من كل أمبليكون (AB و CD) في أنبوب PCR مع كواشف PCR (PCR قبل AD) ، ولكن بدون الاشعال ، وقم بالتمديد باستخدام برنامج التدوير الحراري (المواد التكميلية). ثم أضف 100 ميكرومتر من الاشعال A و D إلى التفاعل (AD PCR) وتضخيم كجزء واحد (مادة تكميلية).
    9. قم بتحليل منتج PCR (AD amplicon) بواسطة الرحلان الكهربائي في هلام الأغاروز بنسبة 1٪ باستخدام الشروط الموضحة في الخطوة 2.1.6 ، وقم باستئصال الأمبليكون من الجل ، وقم بتنقيته باتباع بروتوكول الشركة المصنعة وتحديد كمية الأمبليكون (جدول المواد).
  2. بناء البلازميد المؤتلف pDM4 مع الحذف داخل الإطار.
    1. تنمو ثقافة O / N من الإشريكية القولونية cc18λ pir التي تحتوي على pDM4 في مرق لوريا بيرتاني (LB) ميلر (10 مل) مع الكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل) عند 30 درجة مئوية.
    2. قم بتدوير المستنبتة عند 5000 × جم عند 4 درجات مئوية الكريات في 600 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم. إجراء استخراج وتنقية البلازميد pDM4 باستخدام مجموعة تنقية البلازميد المتاحة تجاريا ، باتباع تعليمات المزود (جدول المواد).
    3. هضم 1 ميكروغرام من pDM4 و 400 نانوغرام من أمبليكون AD لمدة 2 ساعة مع endonuclease قادر على هضم طرفي أمبليكون AD وموقع استنساخ pDM4 (الشكل 3). اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للإنزيم لظروف التفاعل (جدول المواد).
    4. قم بتنظيف البلازميد المهضوم والأمبليكون باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي وتحديدها كميا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
    5. لمنع ربط pDM4 الخطي ، قم بإزالة مجموعة الفوسفات من كلا الطرفين 5 أقدام باستخدام إنزيم الفوسفاتيز القلوي باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد). ثم قم بتنظيف البلازميد المعالج وتحديده كميا باستخدام مقياس الطيف الضوئي كما هو موضح في الخطوة 2.1.4 (جدول المواد).
    6. الجمع بين 150 نانوغرام من pDM4 القلوية المهضومة والفوسفاتيز المعالجة مع 95-100 نانوغرام من أمبليكون AD المهضوم عند متجه مولي: نسبة إدراج 1: 4. قم بإعداد تفاعل الربط بحجم 15 ميكرولتر ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
    7. احتضان O / N عند 20 درجة مئوية أو خلال عطلة نهاية الأسبوع عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بتعطيل الليغاز T4 عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    8. استخدم الربط لإدخال البلازميد في سلالة الإشريكية القولونية MC1061λpir عن طريق الكهربية. استخدم البكتيريا الكهربية و cuvettes الكهربائي 2 مم الفجوة.
  3. تحضير الإشريكية القولونية الكهربية والكهربية للبلازميد المؤتلف pDM4
    1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من سلالة E. coli MC1061λpir في مرق Luria-Bertani (LB) Miller وتنمو O / N عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة.
    2. تمييع 2 مل من الثقافة البكتيرية في 18 مل من مرق LB واحتضان عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز (200 دورة في الدقيقة) حتى يتم تحقيق كثافة بصرية (OD600) بين 0.4-0.6.
    3. حبيبات الثقافة البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 5000 × غرام و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلص من السوبرناتانت الكريات في 40 مل من H2O المقطر المبرد.
    4. كرر خطوة التنظيف هذه مرتين أخريين لإزالة جميع أملاح الثقافة. أخيرا ، قم بتعليق الكريات في 4 مل من H2O المقطر المبرد ونقل 1 مل من التعليق إلى كل من أربعة أنابيب ميكروفوجي مخروطية 1.5 مل.
    5. بيليه الثقافة البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 14000 × غرام و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة supernatant دون إزعاج الكريات وتعليق كل حبيبة في 100 ميكرولتر من H2O المقطر المبرد.
    6. أضف 3-3.5 ميكرولتر من خليط الربط إلى كل أنبوب واحتضنه على الثلج لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، انقل محتويات كل أنبوب إلى كوفيت كهربائي مبرد بفجوة 2 مم وطبق 2 كيلو فولت ، 129 Ω ، وثابت الوقت حوالي 5 مللي ثانية.
      ملاحظة: قم بتبريد الكوفيت الكهربائي مسبقا على الثلج. الحفاظ على البكتيريا على الجليد خلال الإجراء بأكمله.
    7. بعد المعالجة الكهربائية ، أضف 250 ميكرولتر من وسط SOC إلى كل من الكوفيت الأربعة لاستعادة محتوياتها ، ونقلها إلى أنبوب استزراع (حوالي 1 مل) ، واحتضنها لمدة 1 ساعة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
    8. قم بصفيحة الخلايا المحولة على ألواح أجار لوريا بيرتاني (LB) المكملة بالكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل) لضمان أن جميع المستعمرات التي تنمو في الصفيحة تحتوي على العمود الفقري للبلازميد.
    9. اختر بعض المستعمرات من ألواح LB agar مع الكلورامفينيكول واحتضن O / N عند 30 درجة مئوية. عندما تنمو المستعمرات ، تحقق من إدراج بنية الحذف في pDM4 بواسطة PCR باستخدام الاشعال التي تحيط بجانب استنساخ pDM4: pDM4for و pDM4rev (الجدول 1) ، والمستعمرات المحللة كقالب (مادة تكميلية).
    10. اختر مستعمرة واحدة مع مسواك معقم وغمسها في أنبوب 1.5 مل يحتوي على 15 ميكرولتر من 1٪ Triton X-100 ، 20 mM Tris-HCl pH 8.0 ، 2 mM EDTA pH 8.0. احتضن الأنابيب عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم 1 دقيقة على الجليد.
    11. قم بتدوير الأنابيب في ميكروفوج بسرعة 12000 × جم لمدة 10 دقائق لتكسير البكتيريا والحطام. استخدم 1 ميكرولتر من supernatant كقالب في تفاعل PCR (جدول المواد). درجة حرارة التلدين للزوج التمهيدي هي 50 درجة مئوية ، ويتطلب تفاعل PCR 10٪ DMSO (مادة تكميلية).
    12. قم بتلقيح المستعمرات التي ضخمت المنتج ذي الأهمية في 10 مل من مرق LB مع الكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل) وتنمو O / N عند 30 درجة مئوية. استخراج البلازميد من الثقافات كما هو موضح في الخطوات 2.2.1-2.2.2. تسلسل باستخدام الاشعال pDM4 باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
  4. نقل الحذف داخل الإطار إلى Aeromonas وتر
    ملاحظة: يجب إدخال البلازميد المؤتلف pDM4 في المحدد Aeromonas سلالة عن طريق التزاوج ثلاثي الوالدين (الشكل 4). Aeromonas يجب أن تكون السلالة مقاومة للريفامبيسين ليتم اختيارها بعد التزاوج الثلاثي. ولذلك، تنمو السلالات O/N المختارة على مكتب تقييس الاتصالات عند 30 درجة مئوية، وأجهزة الطرد المركزي 2 مل، و4 مل، و6 مل من الثقافات عند 5000 × g لمدة 15 دقيقة، كل حبيبة في 100 ميكرولتر من مكتب تقييس الاتصالات، ولوحة في TSA مع ريفامبيسين (100 ميكروغرام/مل).
    1. تحضير مزارع O/N من الإشريكية القولونية MC1061λpir باستخدام البلازميد المؤتلف pDM4 على أجار LB مع 25 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول (سلالة مانحة)، وسلالة ريفامبيسين المقاومة للريفامبيسين على TSA مع ريفامبيسين 100 ميكروغرام/مل ريفامبيسين (سلالة متلقية)، وE. coli HB101 مع بلازميد pRK2073 على أجار LB مع 80 ميكروغرام/مل سبيكتينوميسين (سلالة مساعدة) عند 30 درجة مئوية.
    2. عندما تنمو المستعمرات ، قم بتعليق نفس العدد من المستعمرات (10-15 مستعمرة) من المتبرع والمتلقي والمساعد يجهد بلطف باستخدام مسواك معقم في ثلاثة أنابيب LB مع 150 ميكرولتر من LB.
    3. ثم ، على صفيحة أجار LB ، بدون مضادات حيوية ، امزج المعلقات البكتيرية الثلاثة في قطرتين عند المتلقي: المساعد: نسبة المتبرع 5: 1: 1 (50 ميكرولتر من المتلقي ، و 10 ميكرولتر من المتبرع ، و 10 ميكرولتر من المساعد). احتضن اللوحة التي تواجه O / N عند 30 درجة مئوية. إجراء السيطرة السلبية على الاقتران باستخدام سلالة المتبرع دون البلازميد المؤتلف.
      ملاحظة: تحمل سلالة المساعد البلازميد المقترن pRK2073 وتساعد على نقل pDM4 إلى Aeromonas. لا تستخدم الدوامة لتعليق سلالات المتبرع والمتلقي والمساعد لتجنب كسر البيلي.
    4. حصاد البكتيريا من لوحة أجار LB عن طريق إضافة 1 مل من مرق LB ونشرها مع موزع زجاجي معقم للحصول على تعليق بكتيري. استخدم ماصة لنقل التعليق البكتيري إلى أنبوب ميكروفوجي مخروطي 1.5 مل ودوامة بقوة.
    5. لاختيار المستعمرات المتلقية التي تحتوي على البلازميد المؤتلف pDM4 ، لوحة 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري المحصود على ألواح أجار LB مع ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) وكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل).
    6. قم بتدوير 200 ميكرولتر و 600 ميكرولتر من العينات في ميكروفوج عند 5000 × جم لمدة 15 دقيقة ، الكريات في 100 ميكرولتر من مرق LB والصفيحة على أجار LB مع ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل). احتضان جميع اللوحات لمدة 24-48 ساعة عند 30 درجة مئوية.
    7. التقط المستعمرات المزروعة ، وانقلها إلى ألواح LB مع ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل) ، واحتضنها O / N عند 30 درجة مئوية. ثم تأكد من أن المستعمرات هي Aeromonas بواسطة اختبار oxidase29 وأن البلازميد المؤتلف pDM4 تم إدخاله (إعادة التركيب الأولى) في منطقة الكروموسومات المحددة بواسطة PCR باستخدام الاشعال E و F (المواد التكميلية) ، والتي ترتبط خارج المنطقة المضخمة مع الاشعال A و D (جدول المواد). كما هو موضح في الخطوة 2.3.11، استخدم 1 ميكرولتر من المستعمرات المحللة كقالب.
    8. لإكمال التبادل الأليلي للحذف داخل الإطار ، أجبر المستعمرات باستخدام البلازميد الانتحاري المتكامل على إعادة تركيب ثانية. تنمو المستعمرات المؤتلفة في 2 مل من LB مع 10 ٪ من السكروز وبدون مضادات حيوية ، O / N عند 30 درجة مئوية.
    9. لوحة 100 ميكرولتر من الثقافات البكتيرية من الخطوة 2.4.8 على لوحة أجار LB مع السكروز (10 ٪). أيضا ، لوحة 100 ميكرولتر من تخفيفات الثقافة المختلفة (10-2-10-4) واحتضان O / N عند 30 درجة مئوية.
    10. لتأكيد فقدان pDM4 ، التقط المستعمرات ، وانقلها إلى ألواح LB مع وبدون الكلورامفينيكول (25 ميكروغرام / مل) ، واحتضنها O / N عند 30 درجة مئوية ، ثم حدد مستعمرات الكلورامفينيكول الحساسة.
    11. قم بتحليل المستعمرات الحساسة بواسطة PCR باستخدام زوج التمهيدي E-F و 1 ميكرولتر من المستعمرات المحللة كقالب (جدول المواد والمواد التكميلية). حدد المستعمرات التي يرتبط منتج PCR الخاص بها بحجم البنية المحذوفة.

3. مقايسات الحركة

ملاحظة: في بعض الأنواع البكتيرية ذات السوط الغليكوزيلاتي ، تؤثر التعديلات في مستويات الغليكوزيل أو تكوين الجليكان على تجميع السوطين ، والذي ينعكس عادة على أنه تقليل حركية أو غياب الحركة. لذلك ، تم إجراء فحصين حركيين مع الطفرات الفارغة.

  1. فحص الحركة في الوسائط السائلة
    1. يجهد الاستزراع Aeromonas O/N في 1 مل من مكتب تقييس الاتصالات عند 25-30 درجة مئوية. للالتصاق بشريحة غطاء المجهر إلى شريحة محفورة ، التقط كمية صغيرة من السيليكون بطرف عود أسنان وضع قطرة صغيرة على الزوايا الأربع لشريحة الغطاء. ثم ، قم بإيداع 1 ميكرولتر من ثقافة Aeromonas في منتصف شريحة الغلاف واخلطها في قطرة من وسائط TSB الطازجة (2 ميكرولتر).
    2. ضع شريحة محفورة على شريحة الغطاء. قم بمطابقة الحفر مع السقوط المودع ، واضغط بلطف ، واقلب الشريحة رأسا على عقب.
    3. تحليل حركية السباحة بواسطة المجهر الضوئي باستخدام المجهر البصري (جدول المواد) بهدف 100x باستخدام زيت الغمر.
      ملاحظة: يجب استخدام سلالة Aeromonas من النوع البري كعنصر تحكم إيجابي. كعنصر تحكم سلبي ، استخدم بكتيريا غير سوط مثل Klebsiella.
  2. فحص الحركة في الوسائط شبه الصلبة
    1. سلالات Aeromonas الاستزراعية O/N في مكتب تقييس الاتصالات (1 مل) عند 25-30 درجة مئوية. ثم ، انقل 3 ميكرولتر من الثقافة إلى وسط صفيحة أجار ناعمة (1٪ تريبتون ، 0.5٪ كلوريد الصوديوم ، 0.25٪ باكتو أجار) واحتضن اللوحة وجها لوجه O / N عند 25-30 درجة مئوية.
    2. باستخدام مسطرة، قم بقياس الهجرة البكتيرية عبر الأجار من مركز الصفيحة نحو المحيط.

4. تنقية السوط

  1. عزل السوط المثبتة على سطح البكتيريا
    1. سلالات Aeromonas الاستزراعية O / N في مكتب تقييس الاتصالات (10 مل) عند 25-30 درجة مئوية. ثم قم بتوسيع الثقافة إلى قارورة مع مكتب تقييس الاتصالات (900 مل) واتركها تنمو O/N عند 25-30 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
    2. جهاز طرد مركزي عند 5000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بتعليق الكريات في 20 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl 100 mM (الرقم الهيدروجيني 7.8).
    3. لإزالة السوط المثبت، قم بقص التعليق في دوامة بقضيب زجاجي (قطره 2-3 مم) لمدة 3-4 دقائق، ثم مرر بشكل متكرر (ست مرات على الأقل) من خلال حقنة 21-G.
    4. بكتيريا الكريات بواسطة جهازين متتاليين للطرد المركزي عند 4 درجات مئوية: أولا ، عند 8000 × g لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة جهاز الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 18000 × جم لمدة 20 دقيقة. جمع supernatant ، الذي يحتوي على سوط مجاني.
    5. جهاز الطرد المركزي الفائق عند 100000 × g لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية وتعليق الكريات في 150 ميكرولتر من 100 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.8) بالإضافة إلى 2 mM EDTA العازل. تحتوي الكريات على خيوط السوط.
    6. تحليل 5-10 ميكرولتر من الكريات المعاد تعليقها من الخطوة 4.1.5 عن طريق الرحلان الكهربائي في هلام SDS-Polyacrylamide بنسبة 12٪ وتصور البروتينات باستخدام تلطيخ Coomassie الأزرق.
      ملاحظة: اتبع تعليمات الشركة المصنعة للرحلان الكهربائي للبروتين وتلطيخ الهلام. كتحكم إيجابي في السوط الغليكوزيلاتي ، استخدم السوط النقي للسلالة البرية. تنقية الجزء المخصب من السوط في تدرج كلوريد السيزيوم (ClCs).
  2. تدرج كلوريد السيزيوم لتنقية السوط.
    1. امزج 12.1 جم من CsCl مع 27 مل من H2O المقطر.
    2. انقل الجزء المخصب من السوط (150 ميكرولتر) إلى أنبوب فائق الوضوح رفيع الجدران (14 مم × 89 مم) (جدول المواد) واملأه ب 12 مل من محلول CsCl.
    3. جهاز طرد مركزي فائق الأنبوب عند 60000 × g لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية في دوار دلو متأرجح (جدول المواد).
    4. اجمع شريط السوط في تدرج CsCl باستخدام حقنة وقم بدياليز ضد 100 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.8) بالإضافة إلى 2 mM EDTA. بعد ذلك ، قم بتحليل السوط المنزوع عن طريق الرحلان الكهربائي في هلام SDS-Polyacrylamide بنسبة 12٪ وتلطيخ Coomassie الأزرق (الخطوة 4.1.6) أو عن طريق قياس الطيف الكتلي.

النتائج

توفر هذه المنهجية نظاما فعالا لتوليد طفرات فارغة في الجينات أو المناطق الكروموسومية في Aeromonas التي يمكن أن تؤثر على غليكوزيل السوط ودور خيوط السوط (الشكل 1).

يبدأ البروتوكول بتحديد المعلوماتية الحيوية ل FGIs المفترضة والجينات التي تقوم بتشفير GTs في هذه الم?...

Discussion

الخطوة المبكرة الحاسمة لهذه الطريقة هي تحديد المناطق المشاركة في غليكوزيل السوط و GTs المفترضة لأن هذه الإنزيمات تظهر تماثلا عاليا وتشارك في العديد من العمليات. يظهر التحليل المعلوماتي الحيوي لجينومات Aeromonas في قواعد البيانات العامة أن هذه المنطقة مجاورة لمنطقة السوط القطبي 2 ، والتي ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المجلس الوطني للبحوث في كندا، من أجل الخطة الوطنية للاقتصاد والمنافسة، إسبانيا، ومن أجل مركز المرجعيات في التكنولوجيا الحيوية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction KitApplied Biosystems4337455Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelityInvitrogen12346-086Used for amplification of AB, CD and AD fragments
AgaroseConda-Pronadise8008Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)PromegaM1821Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agarBecton Dickinson214010Use for motility analysis
BamHIPromegaR6021Used for endonuclease restriction
BglIIPromegaR6081Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin SystemUVPBio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymeraseBiolineBIO-21040Used for colony screening
Cesium chlorideApplichemA1126,0100Used for flagella purification
ChloramphenicolApplichemA1806,0025Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification KitCytivia28-9034-71Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTAApplichem131026.1211Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gapVWR732-1133Used for transformation
Ethidium bromideApplichemA1152,0025Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb markerBiolineBIO-33053DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification KitInvitrogen10750204Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agarCondalab996Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller brothCondalab1551Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000NanoDrop Techonologies IncSpectrophotometer used for DNA quantification
RifampicinApplichemA2220,0005Used for triparental mating
SOC MediumInvitrogen15544034Used for electroporation recovery
SpectinomycinApplichemA3834,0005Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman331362Used for flagella purification
T4 DNA ligaseInvitrogen15224017Used for ligation reaction
Trypticasein soy agarCondalab1068Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy brothCondalab1224Used for Aeromonas grown
TryptoneCondalab1612Use for motility analysis
TrisApplichemA2264,0500Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100ApplichemA4975,0100Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)Beckman344059Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal CyclerApplied BiosystemsUsed for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II KitZymmo researchD4020Used for isolation of plasmid DNA

References

  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
  3. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
  4. Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
  5. Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
  6. Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
  7. Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
  8. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  9. Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
  10. Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
  11. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).
  12. Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
  13. Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
  14. Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
  15. Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
  16. Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
  17. Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
  18. McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
  19. Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
  20. Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
  21. Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).
  22. Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
  23. Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
  24. Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
  25. Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
  26. Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  27. Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
  28. Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
  29. Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
  30. Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
  31. Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
  32. Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
  33. Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181 O glycosylation glycosyltransferases heteroglycan CsCl

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved