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Résumé

Ici, nous décrivons la construction de mutants nuls d’Aeromonas dans des glycosyltransférases spécifiques ou des régions contenant des glycosyltransférases, les tests de motilité et la purification des flagelles effectués pour établir l’implication et la fonction de leurs enzymes codées dans la biosynthèse d’un glycane, ainsi que le rôle de ce glycane dans la pathogenèse bactérienne.

Résumé

L’étude de la glycosylation chez les procaryotes est un domaine en croissance rapide. Les bactéries abritent différentes structures glycosylées à leur surface dont les glycanes constituent un code-barres spécifique à la souche. Les glycanes associés présentent une plus grande diversité dans la composition et la structure du sucre que ceux des eucaryotes et sont importants dans les processus de reconnaissance bactérie-hôte et l’interaction avec l’environnement. Chez les bactéries pathogènes, les glycoprotéines ont été impliquées à différentes étapes du processus infectieux, et les modifications du glycane peuvent interférer avec des fonctions spécifiques des glycoprotéines. Cependant, malgré les progrès réalisés dans la compréhension de la composition, de la structure et des voies de biosynthèse des glycanes, la compréhension du rôle des glycoprotéines dans la pathogénicité ou l’interaction avec l’environnement reste très limitée. En outre, chez certaines bactéries, les enzymes nécessaires à la glycosylation des protéines sont partagées avec d’autres voies biosynthétiques polysaccharidiques, telles que les voies biosynthétiques des lipopolysaccharides et des capsules. L’importance fonctionnelle de la glycosylation a été élucidée chez plusieurs bactéries par mutation de gènes spécifiques que l’on pense être impliqués dans le processus de glycosylation et l’étude de son impact sur l’expression de la glycoprotéine cible et du glycane modificateur. Les Aeromonas mésophiles ont un flagelle polaire unique et O-glycosylé. Les glycanes flagellaires présentent une diversité dans la composition glucidique et la longueur de la chaîne entre les souches d’Aeromonas . Cependant, toutes les souches analysées à ce jour montrent un dérivé de l’acide pseudaminique comme sucre de liaison qui modifie les résidus de sérine ou de thréonine. Le dérivé de l’acide pseudaminique est nécessaire pour l’assemblage des flagelles polaires, et sa perte a un impact sur l’adhésion, la formation de biofilm et la colonisation. Le protocole détaillé dans cet article décrit comment la construction de mutants nuls peut être utilisée pour comprendre l’implication de gènes ou de régions du génome contenant des glycosyltransférases putatives dans la biosynthèse d’un glycane flagellaire. Cela inclut le potentiel de comprendre la fonction des glycosyltransférases impliquées et le rôle du glycane. Ceci sera réalisé en comparant le mutant déficient en glycane à la souche de type sauvage.

Introduction

La glycosylation des protéines a été décrite chez les bactéries Gram positif et Gram négatif et consiste en la fixation covalente d’un glycane à une chaîne latérale d’acide aminé 1,2. Chez les procaryotes, ce processus se produit généralement via deux mécanismes enzymatiques majeurs: O- et N-glycosylation 3. Dans l’O-glycosylation, le glycane est attaché au groupe hydroxyle d’un résidu de sérine (Ser) ou de thréonine (Thr). Dans la N-glycosylation, le glycane est attaché à l’azote amide de la chaîne latérale d’un résidu d’asparagine (Asn) dans les séquences tripeptides Asn-X-Ser/Thr, où X pourrait être n’importe quel acide aminé à l’exception de la proline.

Les glycanes peuvent adopter des structures linéaires ou ramifiées et sont composés de monosaccharides ou de polysaccharides liés de manière covalente par des liaisons glycosidiques. Chez les procaryotes, les glycanes présentent généralement une diversité dans la composition et la structure du sucre par rapport aux glycanes eucaryotes4. En outre, deux voies de glycosylation bactériennes différentes qui diffèrent dans la façon dont le glycane est assemblé et transféré à la protéine acceptrice ont été décrites: glycosylation séquentielle et en bloc 5,6. Pour la glycosylation séquentielle, le glycane complexe est construit directement sur la protéine par addition successive de monosaccharides. Dans la glycosylation en bloc, un glycane pré-assemblé est transféré à la protéine à partir d’un oligosaccharide lié aux lipides par une oligosaccharyltransférase spécialisée (OTase). Il a été démontré que les deux voies sont impliquées dans les processus de glycosylation N et O 7.

La glycosylation des protéines joue un rôle dans la modulation des propriétés physico-chimiques et biologiques des protéines. La présence d’un glycane peut influencer la façon dont la protéine interagit avec son ligand, ce qui affecte l’activité biologique de la protéine, mais peut également affecter la stabilité des protéines, la solubilité, la susceptibilité à la protéolyse, l’immunogénicité et les interactions microbe-hôte 8,9. Cependant, plusieurs paramètres de glycosylation, tels que le nombre de glycanes, la composition du glycane, la position et le mécanisme d’attachement, pourraient également affecter la fonction et la structure des protéines.

Les glycosyltransférases (GT) sont les enzymes clés dans la biosynthèse des glycanes complexes et des glycoconjugués. Ces enzymes catalysent la formation de liaison glycosidique entre une fraction de sucre d’une molécule donneuse activée et un accepteur de substrat spécifique. Les GT peuvent utiliser à la fois des nucléotides et des non-nucléotides comme molécules donneuses et cibler différents accepteurs de substrat, tels que des protéines, des saccharides, des acides nucléiques et des lipides10. Par conséquent, la compréhension des GT au niveau moléculaire est importante pour identifier leurs mécanismes d’action et leur spécificité, et permet également de comprendre comment la composition en sucre des glycanes qui modifient les molécules pertinentes est liée à la pathogénicité. La base de données sur les enzymes glucidiques actives (CAZy)11 classe les GT en fonction de leur homologie de séquence, ce qui fournit un outil prédictif puisque, dans la plupart des familles GT, le pli structurel et les mécanismes d’action sont invariants. Cependant, quatre raisons rendent difficile la prédiction de la spécificité du substrat de nombreux GT : 1) aucun motif de séquence clair déterminant la spécificité du substrat n’a été déterminé chez les procaryotes12, 2) de nombreux GT et OTases montrent la promiscuité du substrat13,14, 3) les GT fonctionnels sont difficiles à produire à haut rendement sous forme recombinante et 4) l’identification des substrats donneurs et accepteurs est complexe. Malgré cela, des études récentes sur la mutagénèse ont permis d’obtenir des avancées significatives dans la compréhension des mécanismes catalytiques et de soustraire la liaison des GT.

Chez les bactéries, l’O-glycosylation semble être plus répandue que la N-glycosylation. Les sites d’O-glycosylation ne montrent pas de séquence consensuelle, et de nombreuses protéines O-glycosylées sont sécrétées ou des protéines de surface cellulaire, telles que les flagellines, les pili ou les autotransporteurs1. La glycosylation de la flagelle montre une variabilité dans le nombre de sites accepteurs, la composition du glycane et la structure. Par exemple, les flagellines de Burkholderia spp n’ont qu’un seul site d’acceptation, tandis que chez Campylobacter jejuni, les flagellènes ont jusqu’à 19 sites d’acceptation15,16. De plus, pour certaines bactéries, le glycane est un monosaccharide unique, tandis que d’autres bactéries possèdent des glycanes hétérogènes compromis de différents monosaccharides pour former des oligosaccharides. Cette hétérogénicité se produit même parmi les souches de la même espèce. Les flagellines Helicobacter ne sont modifiées que par l’acide pseudaminique (PseAc)17, et les flagellines campylobacter peuvent être modifiées par PseAc, la forme acétamidino de l’acide pseudaminique (PseAm) ou de l’acide légionaminique (LegAm), et les glycanes dérivés de ces sucres avec de l’acétyle, de la N-acétylglucosamine ou des substitutions propioniques 18,19. Chez Aeromonas, les flagellènes sont modifiées par des glycanes dont la composition va d’un seul dérivé de l’acide PseAc à un hétéropolysaccharide20, et la fixation des glycanes aux monomères de flagelline se fait toujours via un dérivé PseAc.

En général, la glycosylation des flagellènes est essentielle pour l’assemblage du filament flagellaire, la motilité, la virulence et la spécificité de l’hôte. Cependant, alors que les flagellènes de C. jejuni16, H. pylori17 et Aeromonas sp. 21 ne peut s’assembler en filament que si les monomères de protéines sont glycosylés, Pseudomonas spp. et Burkholderia spp. 15 ne nécessitent pas de glycosylation pour l’assemblage des flagelles. De plus, chez certaines souches de C. jejuni, les changements dans la composition en sucre du flagelle glycane affectent l’interaction bactérie-hôte et peuvent jouer un rôle dans l’évasion de certaines réponses immunitaires16. L’autoagglutination est une autre caractéristique phénotypique affectée par les modifications de la composition des glycanes associées aux flagellines. Une autoagglutination plus faible entraîne une réduction de la capacité à former des microcolonies et du biofilm22. Chez certaines bactéries, la capacité des flagelles à déclencher une réponse pro-inflammatoire était liée à la glycosylation de la flagelline. Ainsi, chez P. aeruginosa, la flagelline glycosylée induit une réponse pro-inflammatoire plus élevée que le23 non glycolycosylé.

Les Aeromonas sont des bactéries à Gram négatif omniprésentes dans l’environnement, ce qui leur permet d’être à l’interface de tous les composants one health 24. Les Aeromonas mésophiles ont un seul flagelle polaire, qui est produit de manière constitutive. Plus de la moitié des isolats cliniques expriment également la flagelline latérale, inductible dans des milieux ou des plaques à haute viscosité. Différentes études ont lié les deux types de flagelles aux premiers stades de la pathogenèse bactérienne25. Alors que les flagellules polaires rapportées à ce jour sont O-glycosylées à 5-8 résidus Ser ou Thr de ses domaines immunogènes centraux, les flagellines latérales ne sont pas O-glycosylées dans toutes les souches. Bien que les glycanes flagelles polaires de différentes souches présentent une diversité dans leur composition glucidique et leur longueur de chaîne20, il a été démontré que le sucre de liaison est un dérivé de l’acide pseudaminique.

Le but de ce manuscrit est de décrire une méthode permettant d’obtenir des mutants nuls dans des GT spécifiques ou des régions chromosomiques contenant des GT afin d’analyser leur implication dans la biosynthèse des polysaccharides pertinents et dans la pathogénicité bactérienne, ainsi que le rôle du glycane lui-même. À titre d’exemple, nous identifions et supprimons une région chromosomique contenant des GT d’Aeromonas pour établir son implication dans la glycosylation de la flagelline polaire et analyser le rôle du glycane de flagelline. Nous montrons comment supprimer un GT spécifique pour établir sa fonction dans la biosynthèse de ce glycane et le rôle du glycane modifié. Bien qu’en utilisant Aeromonas comme exemple, le principe peut être utilisé pour identifier et étudier les îlots de glycosylation flagelle d’autres bactéries à Gram négatif et analyser la fonction des GT impliqués dans la biosynthèse d’autres glycanes tels que le lipopolysaccharide O-antigène.

Protocole

La représentation schématique de la procédure est illustrée à la figure 1.

1. Identification bioinformatique de l’îlot de glycosylation flagelle (IFFI) à Aeromonas

  1. Pour identifier les grappes de biosynthétiques PseAc dans les génomes d’Aeromonas , utilisez l’outil tblastn de la base de données NCBI26. Tout d’abord, récupérez les protéines orthologues en PseC et PseI d’A. piscicola AH-3 (les codes d’identification sont OCA61126.1 et OCA61113.1) à partir de bases de données de souches séquencées d’Aeromonas , puis utilisez l’outil tblastn pour rechercher leurs séquences de nucléotides traduites.
    REMARQUE: Les gènes pse flanquent les FFI Aeromonas , avec pseB et pseC situés à une extrémité de l’amas et pseI à l’autre extrémité. L’emplacement du reste des gènes pse peut être différent d’un groupe FGI à l’autre.
  2. Étant donné que ces gènes de flagelline polaire de nombreuses souches sont adjacents aux FFI, utilisez le tblastn de la base de données NCBI pour trouver des protéines orthologues aux flagellines polaires FlaA et FlaB de A. piscicola AH-3 (les codes d’identification sont OCA61104.1 et OCA61105.1) et les gènes qui les codent.
  3. De plus, les FFI d’Aeromonas impliqués dans la biosynthèse des glycanes hétéropolysaccharidiques (groupe II)27 contiennent plusieurs gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse des acides gras, tels que luxC et luxE. Utilisez le tblastn de la base de données NCBI pour trouver des protéines orthologues à LuxC de A. piscicola AH-3 (le code d’identification est OCA61121.1) et le gène qui le code.

2. Génération de mutants nuls dans les gènes insulaires de glycosylation des flagelles

REMARQUE: Cette méthode de mutagénèse est basée sur l’échange allélique de produits de délétion dans le cadre de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le vecteur suicide pDM428 (GenBank: KC795686.1). La réplication du vecteur pDM4 dépend du lambda pir , et l’échange allélique complet est contraint en utilisant le gène sacB situé sur le vecteur.

  1. Construction de produits de suppression dans le cadre de la PCR.
    1. Concevoir deux paires d’amorces qui amplifient les régions d’ADN en amont (amorces A et B) et en aval (amorces C et D) du gène ou de la région sélectionnés à supprimer (Figure 2B).
    2. Assurez-vous que les amorces A et D ont plus de 600 pb en amont du début et en aval de l’arrêt, respectivement, du ou des gènes à supprimer. Ces deux amorces doivent inclure à l’extrémité 5' un site de restriction pour une endonucléase qui permet le clonage dans pDM4.
      REMARQUE: Le site de restriction inclus à l’extrémité 5' des amorces A et D ne doit pas être le même que les sites dans les amplicons AB ou CD.
    3. Assurez-vous que les amorces B et C se trouvent dans le gène à supprimer ou à l’intérieur du premier et du dernier gène, respectivement, de la région à supprimer. Assurez-vous que les deux amorces (B et C) sont dans le cadre et situées entre 5 et 6 codons à l’intérieur du gène. De plus, assurez-vous que les deux amorces comprennent à l’extrémité 5' une séquence complémentaire de 21 pb (tableau 1) qui permet de joindre les amplicons d’ADN AB et CD.
    4. Cultiver la souche Aeromonas sélectionnée dans 5 mL de bouillon de soja tryptique (BST) pendant la nuit (O/N) à 30 °C. Utilisez une trousse disponible dans le commerce pour la purification de l’ADN génomique et suivez les instructions du fabricant (Table des matériaux). Quantifier 2 μL de l’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE: Utilisez de l’eau distillée double comme ébauche, l’instrument étant réglé pour enregistrer l’absorbance à 260 nm. Enregistrez l’absorbance avec 2 μL d’ADN purifié 3 à 5 fois et calculez une lecture d’absorbance moyenne. Utilisez la loi de Beer-Lambert pour calculer la concentration d’ADN, où A = Ɛ.c.l. dans lequel « A » est l’absorbance, « Ɛ » est le coefficient d’extinction molaire moyen pour l’ADN, « c » est la concentration d’ADN et « l » est la longueur du chemin (se référer à l’instruction du fabricant pour la longueur du chemin de chaque instrument).
    5. Utilisez 100 ng d’ADN chromosomique purifié comme modèle dans deux ensembles de PCR asymétriques avec des amorces A-B et C-D (Table des matériaux). Utilisez un rapport molaire de 10:1 de paires d’amorces A:B et D:C (matériau supplémentaire).
      REMARQUE: Les PCR asymétriques permettent l’amplification préférentielle d’un brin du modèle plus que de l’autre.
    6. Analyser les produits PCR par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1%. Utilisez TAE (40 mM de Tris-acétate, 1 mM d’EDTA) comme tampon de gel et un réglage de puissance de 8 V / cm. Pour visualiser l’ADN, ajoutez du bromure d’éthidium (0,5 μg/mL) au gel et visualisez les produits de PCR à l’aide d’une station de bio-imagerie (Table des matériaux).
    7. Excisez les amplicons du gel à l’aide d’un scalpel, purifiez-les en suivant le protocole du fabricant (Table des matériaux) et quantifiez-les.
    8. Joignez les amplicons AB et CD par leurs séquences de chevauchement de 21 pb dans la fin 3' des produits PCR (Figure 3). Mélanger 100 ng de chaque amplicon (AB et CD) dans un tube PCR avec des réactifs PCR (PCR pré-AD), mais sans amorces, et étendre à l’aide du programme thermocycleur (matériel supplémentaire). Ensuite, ajoutez 100 μM d’amorces A et D à la réaction (AD PCR) et amplifiez en un seul fragment (matériau supplémentaire).
    9. Analyser le produit PCR (amplicon AD) par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1 % en utilisant les conditions décrites à l’étape 2.1.6, exciser l’amplicon du gel, purifier selon le protocole du fabricant et quantifier l’amplicon (Table des matériaux).
  2. Construction du plasmide recombinant pDM4 avec délétion dans le cadre.
    1. Cultiver une culture O/N d’Escherichia coli cc18λ pir contenant du pDM4 dans un bouillon Luria-Bertani (LB) Miller (10 mL) avec du chloramphénicol (25 μg/mL) à 30 °C.
    2. Faire tourner la culture à 5 000 x g à 4 °C et suspendre la pastille dans 600 μL d’eau distillée stérile. Effectuer l’extraction et la purification du plasmide pDM4 à l’aide d’un kit de purification du plasmide disponible dans le commerce, en suivant les instructions du fournisseur (Table des matériaux).
    3. Digérer 1 μg de pDM4 et 400 ng d’amplicon AD pendant 2 h avec une endonucléase capable de digérer les deux extrémités de l’amplicon AD et le site de clonage du pDM4 (Figure 3). Suivez le protocole du fabricant de l’enzyme pour les conditions de réaction (Table des matériaux).
    4. Nettoyez le plasmide et l’amplicon digérés à l’aide d’un kit de purification de l’ADN et quantifiez-les en suivant les instructions du fabricant (Table des matériaux).
    5. Pour éviter la réligation du pDM4 linéarisé, retirez le groupe phosphate des deux extrémités 5' en utilisant l’enzyme phosphatase alcaline en suivant les instructions du fabricant (Table des matériaux). Ensuite, nettoyez le plasmide traité et quantifiez-le à l’aide d’un spectrophotomètre comme décrit à l’étape 2.1.4 (Tableau des matériaux).
    6. Combiner 150 ng de pDM4 digéré et traité par phosphatase alcaline avec 95-100 ng d’amplicon AD digéré à un rapport vecteur molaire/insert de 1:4. Préparer la réaction de ligature dans un volume de 15 μL, en suivant les instructions du fabricant (tableau des matériaux).
    7. Incuber O/N à 20 °C ou le week-end à 4 °C. Après incubation, inactiver la ligase T4 à 70 °C pendant 20 min.
    8. Utilisez la ligature pour introduire le plasmide dans la soucheλpir d’Escherichia coli MC1061 par électroporation. Utilisez des bactéries électrocompétentes et des cuvettes d’électroporation de 2 mm d’intervalle.
  3. Préparation de l’électrocompétent E. coli et électroporation du plasmide recombinant pDM4
    1. Inoculer une seule colonie de la souche E. coli MC1061λpir dans le bouillon Luria-Bertani (LB) Miller et faire pousser O/N à 30 °C avec une agitation de 200 tr/min.
    2. Diluer 2 mL de la culture bactérienne dans 18 mL de bouillon LB et incuber à 30 °C en agitant (200 tr/min) jusqu’à ce qu’une densité optique (OD600) comprise entre 0,4 et 0,6 soit atteinte.
    3. Granulés de culture bactérienne par centrifugation à 5 000 x g et 4 °C pendant 15 min. Jeter le surnageant et suspendre la pastille dans 40 mL deH2Odistillé réfrigéré.
    4. Répétez cette étape de nettoyage deux fois de plus pour éliminer tous les sels de culture. Enfin, suspendre la pastille dans 4 mL deH2Odistillé réfrigéré et transférer 1 mL de la suspension dans chacun des quatre tubes coniques de 1,5 mL de microfuge.
    5. Granulés de culture bactérienne par centrifugation à 14 000 x g et 4 °C pendant 5 min. Retirer le surnageant sans perturber la pastille et suspendre chaque pastille dans 100 μL deH2Odistillé réfrigéré.
    6. Ajouter 3-3,5 μL du mélange de ligature à chaque tube et incuber sur de la glace pendant 5 min. Ensuite, transférez le contenu de chaque tube dans une cuvette d’électroporation réfrigérée de 2 mm d’espace et appliquez 2 kV, 129 Ω et une constante de temps d’environ 5 ms.
      REMARQUE: Pré-refroidir les cuvettes d’électroporation sur de la glace. Maintenez les bactéries sur la glace pendant toute la procédure.
    7. Après électroporation, ajouter 250 μL de milieu SOC à chacune des quatre cuvettes pour récupérer leur contenu, les transférer dans un tube de culture (environ 1 mL) et incuber pendant 1 h à 30 °C en agitant (200 tr/min).
    8. Plaquez les cellules transformées sur des plaques de gélose Luria-Bertani (LB) complétées par du chloramphénicol (25 μg / mL) pour s’assurer que toutes les colonies qui se développent dans la plaque ont l’épine dorsale plasmidique.
    9. Choisissez quelques colonies dans les plaques de gélose LB avec du chloramphénicol et incubez O/N à 30 °C. Lorsque les colonies se développent, vérifiez l’insertion de la construction de délétion dans pDM4 par PCR à l’aide d’amorces qui flanquent le côté clonage pDM4 : pDM4for et pDM4rev (Tableau 1), et les colonies lysées comme modèle (Matériel supplémentaire).
    10. Choisissez une colonie avec un cure-dent stérile et trempez-la dans un tube de 1,5 mL contenant 15 μL de Triton X-100 à 1 %, 20 mM de Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0. Incuber les tubes à 100 °C pendant 5 min, puis 1 min sur de la glace.
    11. Faire tourner les tubes dans un microfuge à 12 000 x g pendant 10 min pour granuler les bactéries et les débris. Utilisez 1 μL du surnageant comme modèle dans la réaction pcrurgique (Table des matériaux). La température de recuit de la paire d’apprêts est de 50 °C et la réaction pcr nécessite 10% de DMSO (matériau supplémentaire).
    12. Inoculer les colonies qui ont amplifié le produit d’intérêt dans 10 mL de bouillon LB avec du chloramphénicol (25 μg/mL) et faire croître O/N à 30 °C. Extraire le plasmide des cultures comme décrit aux étapes 2.2.1-2.2.2. Séquence à l’aide des amorces pDM4 en suivant les instructions du fabricant (Table des matériaux).
  4. Transfert de la suppression dans le cadre vers le Aeromonas filtrer
    REMARQUE: Le plasmide recombinant pDM4 doit être introduit dans le Aeromonas déformation par accouplement triparental (Graphique 4). Aeromonas La souche doit être résistante à la rifampicine pour être sélectionnée après l’accouplement triparental. Par conséquent, cultiver les souches sélectionnées O/N sur TSB à 30 °C, centrifuger 2 mL, 4 mL et 6 mL de cultures à 5 000 x g pendant 15 min, suspendre chaque pastille dans 100 μL de BST et plaquer dans la TSA avec de la rifampicine (100 μg/mL).
    1. Préparer des cultures O/N d’E. coli MC1061λpir avec le plasmide recombinant pDM4 sur gélose LB avec 25 μg/mL de chloramphénicol (souche donneuse), la souche Aeromonas résistante à la rifampicine sur TSA avec 100 μg/mL de rifampicine (souche réceptrice), et le plasmide E. coli HB101 avec le plasmide pRK2073 sur gélose LB avec 80 μg/mL de spectinomycine (souche auxiliaire) à 30 °C.
    2. Lorsque les colonies se sont développées, suspendez doucement le même nombre de colonies (10 à 15 colonies) des souches donneuses, receveuses et auxiliaires avec un cure-dent stérile dans trois tubes LB contenant 150 μL de LB.
    3. Ensuite, sur une plaque de gélose LB, sans antibiotiques, mélanger les trois suspensions bactériennes en deux gouttes chez un receveur: rapport aide: donneur de 5: 1: 1 (50 μL du receveur, 10 μL du donneur et 10 μL d’aide). Incuber la plaque face vers le haut O/N à 30 °C. Effectuer un contrôle négatif de la conjugaison en utilisant la souche donneuse sans plasmide recombinant.
      REMARQUE: La souche auxiliaire porte le plasmide conjugatif pRK2073 et facilite le transfert du pDM4 dans l’Aeromonas. N’utilisez pas de vortex pour suspendre les souches donneuses, receveuses et auxiliaires afin d’éviter de casser le pili.
    4. Récoltez les bactéries de la plaque de gélose LB en ajoutant 1 mL de bouillon LB et en l’étalant avec un épandeur de verre stérile pour obtenir une suspension bactérienne. Utilisez une pipette pour transférer vigoureusement la suspension bactérienne dans un tube de microfuge conique de 1,5 mL et un vortex.
    5. Pour sélectionner les colonies receveuses contenant le plasmide recombinant pDM4, plaque 100 μL de la suspension bactérienne récoltée sur des plaques de gélose LB avec de la rifampicine (100 μg/mL) et du chloramphénicol (25 μg/mL).
    6. Faire tourner 200 μL et 600 μL des échantillons dans une microfugie à 5 000 x g pendant 15 min, suspendre la pastille dans 100 μL de bouillon LB et plaquer sur gélose LB avec de la rifampicine (100 μg/mL) et du chloramphénicol (25 μg/mL). Incuber toutes les plaques pendant 24-48 h à 30 °C.
    7. Ramasser les colonies cultivées, transférer sur des plaques LB avec de la rifampicine (100 μg/mL) et du chloramphénicol (25 μg/mL), et les incuber O/N à 30 °C. Ensuite, confirmez que les colonies sont des Aeromonas par le test d’oxydase29 et que le plasmide recombinant pDM4 a été inséré (première recombinaison) dans la région chromosomique spécifique par PCR à l’aide des amorces E et F (Matériau supplémentaire), qui se lient à l’extérieur de la région amplifiée avec les amorces A et D (Table des matériaux). Comme décrit à l’étape 2.3.11, utilisez 1 μL de colonies lysées comme modèle.
    8. Pour compléter l’échange allélique pour la délétion dans le cadre, contraindre les colonies avec le plasmide suicidaire intégré à une deuxième recombinaison. Cultiver les colonies recombinantes dans 2 mL de LB avec 10% de saccharose et sans antibiotiques, O/N à 30 °C.
    9. Plaque 100 μL des cultures bactériennes de l’étape 2.4.8 sur plaque de gélose LB avec saccharose (10%). En outre, plaquer 100 μL de différentes dilutions de culture (10-2-10-4) et incuber O/N à 30 °C.
    10. Pour confirmer la perte de pDM4, ramasser les colonies, transférer sur des plaques LB avec et sans chloramphénicol (25 μg/mL), les incuber O/N à 30 °C, puis sélectionner les colonies sensibles au chloramphénicol.
    11. Analyser les colonies sensibles par PCR en utilisant la paire d’amorces E-F et 1 μL de colonies lysées comme modèle (Tableau des matériaux et matériaux supplémentaires). Sélectionnez les colonies dont le produit PCR est en corrélation avec la taille de la construction supprimée.

3. Essais de motilité

REMARQUE: Chez certaines espèces bactériennes avec des flagelles glycosylés, les modifications des niveaux de glycosylation ou de composition du glycane affectent l’assemblage des flagellènes, ce qui se traduit généralement par une réduction de la motilité ou une absence de motilité. Par conséquent, deux tests de motilité ont été effectués avec les mutants nuls.

  1. Essai de motilité en milieu liquide
    1. Culture Aeromonas filtre O/N dans 1 mL de BST à 25-30 °C. Pour coller une lame de couverture de microscope à une lame excavée, prenez une petite quantité de silicone avec la pointe d’un cure-dent et placez une petite goutte sur les quatre coins de la lame de couverture. Ensuite, déposez 1 μL de la culture Aeromonas au milieu de la lame de couverture et mélangez dans une goutte de milieu frais du BST (2 μL).
    2. Placez une glissière excavée sur la glissière de couverture. Faites correspondre l’excavation avec la goutte déposée, appuyez doucement et tournez la glissière à l’envers.
    3. Analysez la motilité de nage par microscopie optique à l’aide d’un microscope optique (Table des matériaux) avec un objectif 100x à l’aide d’huile d’immersion.
      REMARQUE: La souche de type sauvage d’Aeromonas doit être utilisée comme témoin positif. Comme témoin négatif, utilisez une bactérie non flagellée telle que Klebsiella.
  2. Essai de motilité dans des milieux semi-solides
    1. Culture Aeromonas souches O/N dans le BST (1 mL) à 25-30 °C. Ensuite, transférer 3 μL de la culture sur le centre d’une plaque de gélose molle (1% de tryptone, 0,5% de NaCl, 0,25% de bacto agar) et incuber la plaque face vers le haut O/N à 25-30 °C.
    2. À l’aide d’une règle, mesurez la migration bactérienne à travers la gélose du centre de la plaque vers la périphérie.

4. Purification des flagelles

  1. Isolement des flagelles ancrés à la surface bactérienne
    1. Culture Aeromonas souches O/N dans le BST (10 mL) à 25-30 °C. Ensuite, développez la culture dans une fiole avec du BST (900 mL) et laissez-la pousser O/N à 25-30 °C en agitant (200 tr/min).
    2. Centrifuger à 5 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Suspendre la pastille dans 20 mL de tampon Tris-HCl de 100 mM (pH 7,8).
    3. Pour retirer les flagelles ancrés, cisaillez la suspension dans un vortex avec une barre de verre (2-3 mm de diamètre) pendant 3-4 min, puis passez de manière répétitive (au moins six fois) à travers une seringue de 21 G.
    4. Bactéries en granulés par deux centrifugations consécutives à 4 °C : d’abord, à 8 000 x g pendant 30 min. Retirer le surnageant et centrifuger à 18 000 x g pendant 20 min. Collectez le surnageant, qui contient des flagelles libres.
    5. Ultracentrifugez le surnageant à 100 000 x g pendant 1 h à 4 °C et suspendez la pastille dans 150 μL de 100 mM de Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM de tampon EDTA. La pastille contient des filaments de flagelles.
    6. Analysez 5 à 10 μL de la pastille remise en suspension de l’étape 4.1.5 par électrophorèse dans un gel SDS-Polyacrylamide à 12% et visualisez les protéines à l’aide de la coloration bleue de Coomassie.
      REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour l’électrophorèse des protéines et la coloration sur gel. Comme contrôle positif de la flagelline glycosylée, utilisez les flagelles purifiés de la souche de type sauvage. Purifier la fraction enrichie de flagelles dans un gradient de chlorure de césium (ClC).
  2. Gradient de chlorure de césium pour purifier les flagelles.
    1. Mélanger 12,1 g de CsCl avec 27 mL deH2Odistillé.
    2. Transférer la fraction enrichie de flagelles (150 μL) dans un tube ultra-clair à paroi mince (14 mm x 89 mm) (Table des matériaux) et le remplir de 12 mL de solution de CsCl.
    3. Ultracentrifugez le tube à 60 000 x g pendant 48 h à 4 °C dans un rotor à godet oscillant (Table des matériaux).
    4. Recueillir la bande flagelle dans le gradient CsCl avec une seringue et dialyze contre 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA. Ensuite, analysez les flagelles dialysés par électrophorèse dans un gel SDS-Polyacrylamide à 12% et coloration bleu Coomassie (étape 4.1.6) ou par spectrométrie de masse.

Résultats

Cette méthodologie fournit un système efficace pour générer des mutants nuls dans les gènes ou les régions chromosomiques d’Aeromonas qui peuvent affecter la glycosylation des flagelles et le rôle du filament de flagelle (Figure 1).

Le protocole commence par l’identification bioinformatique des FFI putatifs et des gènes codant pour les GT présents dans cette région. Chez Aeromonas, la localisation chromosomique des FFI est basée su...

Discussion

L’étape précoce critique de cette méthode est l’identification des régions impliquées dans la glycosylation des flagelles et des GT putatifs, car ces enzymes présentent une homologie élevée et sont impliquées dans de nombreux processus. L’analyse bioinformatique des génomes d’Aeromonas dans les bases de données publiques montre que cette région est adjacente à la région polaire flagellelle 2, qui contient les gènes de flagelline dans de nombreuses souches et contient des gènes impliqués ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Conseil national de recherches du Canada, pour le Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Espagne) et pour la Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction KitApplied Biosystems4337455Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelityInvitrogen12346-086Used for amplification of AB, CD and AD fragments
AgaroseConda-Pronadise8008Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)PromegaM1821Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agarBecton Dickinson214010Use for motility analysis
BamHIPromegaR6021Used for endonuclease restriction
BglIIPromegaR6081Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin SystemUVPBio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymeraseBiolineBIO-21040Used for colony screening
Cesium chlorideApplichemA1126,0100Used for flagella purification
ChloramphenicolApplichemA1806,0025Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification KitCytivia28-9034-71Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTAApplichem131026.1211Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gapVWR732-1133Used for transformation
Ethidium bromideApplichemA1152,0025Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb markerBiolineBIO-33053DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification KitInvitrogen10750204Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agarCondalab996Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller brothCondalab1551Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000NanoDrop Techonologies IncSpectrophotometer used for DNA quantification
RifampicinApplichemA2220,0005Used for triparental mating
SOC MediumInvitrogen15544034Used for electroporation recovery
SpectinomycinApplichemA3834,0005Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman331362Used for flagella purification
T4 DNA ligaseInvitrogen15224017Used for ligation reaction
Trypticasein soy agarCondalab1068Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy brothCondalab1224Used for Aeromonas grown
TryptoneCondalab1612Use for motility analysis
TrisApplichemA2264,0500Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100ApplichemA4975,0100Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)Beckman344059Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal CyclerApplied BiosystemsUsed for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II KitZymmo researchD4020Used for isolation of plasmid DNA

Références

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