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Resumo

Aqui, descrevemos a construção de mutantes nulos de Aeromonas em glicosyltransferases específicas ou regiões contendo glicosyltransferases, os ensaios de motilidade e a purificação de flagela realizadas para estabelecer o envolvimento e função de suas enzimas codificadas na biossíntese de um glicano, bem como o papel deste glicano em patógenos bacterianos.

Resumo

O estudo da glicosylation em procariotes é uma área de rápido crescimento. As bactérias abrigam diferentes estruturas glicosylated em sua superfície cujos glicanos constituem um código de barras específico para a cepa. Os glicanos associados apresentam maior diversidade na composição e estrutura do açúcar do que os de eucariotes e são importantes nos processos de reconhecimento de hospedeiros bacterianos e na interação com o meio ambiente. Em bactérias patogênicas, as glicoproteínas estiveram envolvidas em diferentes estágios do processo infeccioso, e modificações glicais podem interferir com funções específicas de glicoproteínas. No entanto, apesar dos avanços na compreensão das vias de composição, estrutura e biossíntese glicano, a compreensão do papel das glicoproteínas na patogenicidade ou interação com o ambiente permanece muito limitada. Além disso, em algumas bactérias, as enzimas necessárias para a glicossiltação proteica são compartilhadas com outras vias biossintéticas de polissacarídeo, como lipopoliposcarídeos e vias biossintéticas de cápsulas. A importância funcional da glicossylation tem sido elucidada em várias bactérias através da mutação de genes específicos considerados envolvidos no processo de glicosylation e no estudo de seu impacto na expressão da glicoproteína alvo e da glican modificadora. Aeromonas mesofílicas têm um único e O-glycosylated flagellum polar. Os glicanos flageladores mostram diversidade na composição de carboidratos e comprimento da cadeia entre cepas de Aeromonas. No entanto, todas as cepas analisadas até o momento mostram um derivado de ácido pseudaminic como o açúcar de ligação que modifica resíduos de serina ou threonina. O derivado de ácido pseudaminico é necessário para a montagem de flagella polar, e sua perda tem um impacto na adesão, formação de biofilme e colonização. O protocolo detalhado neste artigo descreve como a construção de mutantes nulos pode ser usada para entender o envolvimento de genes ou regiões do genoma contendo glicosyltransferases putativas na biosíntese de um glicano flagelar. Isso inclui o potencial de compreender a função das glicosyltransferases envolvidas e o papel do glicano. Isso será alcançado comparando o mutante deficiente glicano com a cepa selvagem.

Introdução

A glicossylação proteica tem sido descrita em ambas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e consiste no apego covalente de um glicano a uma cadeia lateral de aminoácidos 1,2. Em procariotes, esse processo geralmente ocorre através de dois mecanismos enzimáticos principais: O- e N-glicosylation3. Na O-glicosylation, o glicano é anexado ao grupo hidroxyl de um resíduo serino (Ser) ou threonine (Thr). Na N-glicosylation, o glicano é anexado à cadeia lateral em meio a nitrogênio de um resíduo de asparagine (Asn) dentro das sequências de tripeptídeos Asn-X-Ser/Thr, onde X poderia ser qualquer aminoácido, exceto proline.

Os glicanos podem adotar estruturas lineares ou ramificadas e são compostos de monossacarídeos ou polissacarídeos covalentemente ligados por ligações glicossídicas. Em procariotes, os glicanos costumam mostrar diversidade na composição e estrutura do açúcar em comparação com os glicanos eucarióticos4. Além disso, duas diferentes vias de glicosylation bacteriana que diferem na forma como o glicano é montado e transferido para a proteína aceitadora foram descritas: glicossolation sequencial e en bloco 5,6. Para a glicossicação sequencial, o glicano complexo é construído diretamente sobre a proteína por sucessivas adição de monossacarídeos. Na glicosylation en bloc, um glicano pré-montado é transferido para a proteína a partir de um oligossacarídeo ligado a lipídios por um oligossacaryltransferase especializado (OTase). Ambas as vias mostraram-se envolvidas nos processos de N e O-glicosylation 7.

A glicossomilation proteica tem um papel na modulação das propriedades físico-químicas e biológicas das proteínas. A presença de um glicano pode influenciar como a proteína interage com seu ligante, que afeta a atividade biológica da proteína, mas também pode afetar a estabilidade proteica, solubilidade, suscetibilidade à proteólise, imunogenicidade e interações micróbios8,9. No entanto, vários parâmetros de glicosylation, como o número de glicanos, composição glica, posição e mecanismo de apego, também podem afetar a função e a estrutura da proteína.

As glicosilatransferases (GTs) são as enzimas-chave na biossíntese de glicanos complexos e glicoconjugados. Essas enzimas catalisam a formação de ligação glicósdica entre uma moiety de açúcar de uma molécula de doador ativada e um aceitador de substrato específico. Os GTs podem usar nucleotídeos e não-nucleotídeos como moléculas de doadores e atingir diferentes aceitadores de substratos, como proteínas, sacarídeos, ácidos nucleicos e lipídios10. Portanto, compreender os GTs no nível molecular é importante para identificar seus mecanismos de ação e especificidade, e também permite entender como a composição do açúcar dos glicanos que modificam moléculas relevantes está relacionada à patogenicidade. O banco de dados de enzimas enzimásis Ativos de Carboidratos (CAZy)11 classifica os GTs de acordo com sua sequência de homologia, que fornece uma ferramenta preditiva, uma vez que, na maioria das famílias GT, a dobra estrutural e os mecanismos de ação são invariantes. No entanto, quatro razões dificultam a previsão da especificidade do substrato de muitos GTs: 1) nenhum motivo de sequência clara determinando a especificidade do substrato foi determinado nos procariotes12, 2) muitos GTs e OTases mostram promiscuidade de substrato 13,14, 3) GTs funcionais são difíceis de produzir em alto rendimento em forma recombinante e 4) a identificação de substratos doadores e aceitadores é complexa. Apesar disso, estudos recentes de mutagênese permitiram obter avanços significativos na compreensão de mecanismos catalíticos e subtrair a vinculação dos GTs.

Em bactérias, o-glicosylation parece ser mais prevalente do que n-glicosylation. Os locais de o-glicosylation não mostram uma sequência de consenso, e muitas das proteínas O-glicosylated são secretas ou proteínas de superfície celular, como flagellins, pili ou autotransportadores1. A glicossylation flagellin mostra variabilidade no número de locais de aceitação, composição glica e estrutura. Por exemplo, burkholderia spp flagellins têm apenas um site de aceitação, enquanto em Campylobacter jejuni, flagellins têm até 19 locais de aceitação15,16. Além disso, para algumas bactérias, o glicano é um único monossacarídeo, enquanto outras bactérias possuem glicanos heterogêneos comprometidos de diferentes monossacarídeos para formar oligossacarídeos. Essa heterogenicidade ocorre mesmo entre cepas da mesma espécie. As flagellins helicobacter só são modificadas por ácido pseudaminic (PseAc)17, e as flagellins campylobacter podem ser modificadas por PseAc, a forma acetamidino do ácido pseudaminico (PseAm) ou ácido legionamínico (LegAm), e glycans derivados desses açúcares com acetil, N-acetilglucosamina, ou substituições propiônicas 18,19. Em Aeromonas, as flagellins são modificadas por glicanos cuja composição varia de um único derivado ácido PseAc a um heteropolysacarídeo20, e o apego dos glicanos aos monômeros flagellin é sempre através de um derivado PseAc.

Em geral, a glicossylation de flagellins é essencial para a montagem de filamento flagelar, motilidade, virulência e especificidade do hospedeiro. No entanto, enquanto flagellins de C. jejuni16, H. pylori17, e Aeromonas sp. 21 não pode se montar em filamentos a menos que os monômeros proteicos sejam glicosiltos, Pseudomonas spp. e Burkholderia spp. 15 não requerem glicossylation para montagem flagela. Além disso, em algumas cepas de C. jejuni , alterações na composição do açúcar da flagelaglicano podem afetar a interação bacteriana-hospedeira e podem desempenhar um papel na fuga de certas respostas imunes16. A autoaglictinação é outra característica fenotípica afetada por modificações na composição de glicanos associados a flagellins. Uma autoagglutinação mais baixa leva a uma redução na capacidade de formar microcolônias e biofilme22. Em algumas bactérias, a capacidade de flagela para desencadear uma resposta pró-inflamatória estava ligada à glicoslação flagellina. Assim, em P. aeruginosa, o flagellin glicosilado induz uma resposta pró-inflamatória maior do que o ungcosylated23.

Aeromonas são bactérias Gram-negativas onipresentes no ambiente, o que permite que elas estejam na interface de todos os componentes do One Health 24. Aeromonas mesofílicas têm um único flagelo polar, que é produzido constitutivamente. Mais da metade dos isolados clínicos também expressam flagellin lateral, indutível em mídia ou placas de alta viscosidade. Diferentes estudos relacionaram ambos os tipos de flagela com os estágios iniciais da patogênese bacteriana25. Enquanto as bandeiras polares relatadas até o momento são O-glycosylated em 5-8 Resíduos de Ser ou Thr de seus domínios imunológicos centrais, flagellins laterais não são O-glycosylated em todas as cepas. Embora as glicans flagella polares de diferentes cepas mostrem diversidade em sua composição de carboidratos e comprimento da cadeia20, o açúcar de ligação tem se mostrado um derivado de ácido pseudaminic.

O objetivo deste manuscrito é descrever um método para obter mutantes nulos em GTs específicos ou regiões cromossômicas contendo GTs para analisar seu envolvimento na biossíntese de polissacarídeos relevantes e na patogenicidade bacteriana, bem como o papel do próprio glicano. Como exemplo, identificamos e excluímos uma região cromossômica contendo GTs de Aeromonas para estabelecer seu envolvimento na glicosilação de bandeira polar e analisar o papel do glicano flagellin. Mostramos como excluir um GT específico para estabelecer sua função na biosíntese deste glicano e o papel do glicano modificado. Embora usando Aeromonas como exemplo, o princípio pode ser usado para identificar e estudar ilhas de glicosilação flagella de outras bactérias Gram-negativas e analisar a função de GTs envolvidos na biosíntese de outros glicanos, como o lipopólio-de-o-antígeno.

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Protocolo

A representação esquemática do procedimento é mostrada na Figura 1.

1. Identificação bioinformática da ilha flagella glicosylation (FGIs) em Aeromonas

  1. Para identificar os clusters biossintéticos PseAc nos genomas de Aeromonas , use a ferramenta tblastn do banco de dados NCBI26. Primeiro, recupere proteínas ortologos para PseC e PseI de A. piscicola AH-3 (códigos de identificação são OCA61126.1 e OCA61113.1) de bancos de dados de cepas de Aeromonas sequenciadas e, em seguida, use a ferramenta tblastn para pesquisar suas sequências de nucleotídeos traduzidos.
    NOTA: Os genes de pse flanqueiam os Aeromonas FGIs, com pseB e pseC localizados em uma extremidade do cluster e do PSEI na outra extremidade. A localização do resto dos genes de pse pode ser diferente de um grupo FGI para outro.
  2. Dado que esses genes de bandeira polar de muitas cepas são adjacentes aos FGIs, use o tblastn do banco de dados NCBI para encontrar proteínas ortologos para as bandeiras polares FlaA e FlaB de A. piscicola AH-3 (códigos de identificação são OCA61104.1 e OCA61105.1) e os genes que os codificam.
  3. Além disso, os FGIs aeromonas envolvidos na biosíntese de glicocanos heteropolícitas (grupo II)27 contêm várias enzimas de codificação de genes envolvidas na síntese de ácidos graxos, como luxC e luxE. Use o tblastn do banco de dados NCBI para encontrar proteínas ortologos para LuxC de A. piscicola AH-3 (código de identificação é OCA61121.1) e o gene que o codifica.

2. Geração de mutantes nulos em genes da ilha flagella glicoslação

NOTA: Este método de mutagênese baseia-se na troca aélica de produtos de exclusão em cadeia de polimerase (PCR) utilizando o vetor de suicídio pDM428 (GenBank: KC795686.1). A replicação do vetor pDM4 é dependente de lambda pir , e a troca allelic completa é coagida utilizando o gene sacB localizado no vetor.

  1. Construção de produtos de exclusão in-frame pcr.
    1. Projete dois pares de primers que amplificam as regiões de DNA rio acima (primers A e B) e a jusante (primers C e D) do gene ou região selecionado a serem excluídos (Figura 2B).
    2. Certifique-se de que os Primers A e D tenham mais de 600 bp upstream desde o início e a jusante da parada, respectivamente, do gene ou genes a serem excluídos. Esses dois primers precisam incluir no final de 5' um local de restrição para um endonuclease que permite a clonagem no pDM4.
      NOTA: O site de restrição incluído no final de 5' dos primers A e D não deve ser o mesmo que os sites dentro de amplificadores AB ou CD.
    3. Certifique-se de que os Primers B e C estejam dentro do gene a ser excluído ou dentro do primeiro e último gene, respectivamente, da região a ser excluído. Certifique-se de que ambos os primers (B e C) estão no quadro e localizados entre 5-6 códons dentro do gene. Além disso, certifique-se de que ambos os primers incluam no final de 5' uma sequência complementar de 21 bp (Tabela 1) que permite a junção dos amplificadores de DNA AB e CD.
    4. Cresça a cepa de Aeromonas selecionada em 5 mL de caldo de soja tripptic (TSB) durante a noite (O/N) a 30 °C. Use um kit comercialmente disponível para purificação genômica de DNA e siga as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Quantifique 2 μL do DNA purificado usando um espectotômetro.
      NOTA: Use água dupla destilada em branco, com o instrumento definido para registrar a absorção a 260 nm. Registo de absorvância com 2 μL de DNA purificado 3-5 vezes e calcule uma leitura média de absorvência. Use a lei Beer-Lambert para calcular a concentração de DNA, onde A = Ɛ.c.l. em que "A" é absorvente, "Ɛ" é o coeficiente médio de extinção molar para DNA, "c" é concentração de DNA, e "l" é o comprimento do caminho (consulte a instrução do fabricante para o comprimento do caminho de cada instrumento).
    5. Use 100 ng de DNA cromossômico purificado como modelo em dois conjuntos de PCRs assimétricos com primers A-B e C-D (Tabela de Materiais). Use uma relação molar de 10:1 de pares de primer A:B e D:C (Material Suplementar).
      NOTA: Os PCRs assimétricos permitem a amplificação preferencial de um fio do modelo mais do que o outro.
    6. Analise os produtos PCR por eletroforese em um gel de 1% de agarose. Use TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) como tampão de corrida de gel e uma configuração de potência de 8 V/cm. Para visualizar o DNA, adicione brometo de ethidium (0,5 μg/mL) ao gel e visualize os produtos PCR utilizando uma estação de bioimagem (Tabela de Materiais).
    7. Extirpar os amplicons do gel usando um bisturi, purificar seguindo o protocolo do fabricante (Tabela de Materiais) e quantificá-los.
    8. Junte-se a amplificadores AB e CD por suas sequências sobrepostas de 21 bps na extremidade de 3' dos produtos PCR (Figura 3). Misture 100 ng de cada amplicon (AB e CD) em um tubo PCR com reagentes PCR (PCR pré-AD), mas sem primers, e estenda-se usando o programa termociclador (Material Suplementar). Em seguida, adicione 100 μM de primers A e D à reação (AD PCR) e amplie como um único fragmento (Material Suplementar).
    9. Analisar o produto PCR (AD amplicon) por eletroforese em um gel de 1% de agarose utilizando as condições descritas na etapa 2.1.6, retirar a amplicon do gel, purificar seguindo o protocolo do fabricante e quantificar o amplicon (Tabela de Materiais).
  2. Construção do plasmídeo recombinante pDM4 com a exclusão no quadro.
    1. Cresça uma cultura O/N de Escherichia coli cc18λ pir contendo pDM4 em caldo de Luria-Bertani (LB) Miller (10 mL) com clorofenicol (25 μg/mL) a 30 °C.
    2. Gire a cultura a 5.000 x g a 4 °C e suspenda a pelota em 600 μL de água destilada estéril. Realize a extração e purificação do pDM4 plasmídeo utilizando um kit de purificação plasmídeo disponível comercialmente, seguindo as instruções do provedor (Tabela de Materiais).
    3. Digerir 1 μg de pDM4 e 400 ng de amplicon AD por 2 h com uma endonuclease capaz de digerir ambas as extremidades do amplicon AD e o local de clonagem de pDM4 (Figura 3). Siga o protocolo do fabricante de enzimas para condições de reação (Tabela de Materiais).
    4. Limpe o plasmídeo digerido e amplicon usando um kit de purificação de DNA e quantifique-os seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
    5. Para evitar a religação do pDM4 linearizado, remova o grupo fosfato das duas extremidades de 5' usando a enzima fosfatas alcalina seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Em seguida, limpe o plasmídeo tratado e quantifique-o usando um espectotômetro descrito na etapa 2.1.4 (Tabela de Materiais).
    6. Combine 150 ng do pDM4 tratado alcalino digerido e fosfattase com 95-100 ng de amplicon AD digerido em uma razão vetorial molar:insert ratio de 1:4. Prepare a reação de ligadura em um volume de 15 μL, seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
    7. Incubar O/N a 20 °C ou no fim de semana a 4 °C. Após a incubação, inative a liga ligadura T4 a 70 °C por 20 min.
    8. Use ligadura para introduzir o plasmídeo na cepa deλpir Escherichia coli MC1061 por eletroporação. Use bactérias eletrocompetentes e cuvetas de eletroporação de 2 mm.
  3. Preparação de eletrocompetente E. coli e eletroporação de plasmídeo recombinante pDM4
    1. Inocular uma única colônia de E. coli MC1061λpir tensão em Luria-Bertani (LB) Caldo miller e crescer O/N a 30 °C com 200 rpm tremendo.
    2. Diluir 2 mL da cultura bacteriana em 18 mL de caldo LB e incubar a 30 °C com agitação (200 rpm) até que uma densidade óptica (OD600) entre 0,4-0,6 seja alcançada.
    3. Pelota a cultura bacteriana por centrifugação a 5.000 x g e 4 °C por 15 min. Descarte o supernatante e suspenda a pelota em 40 mL de H2O destilado refrigerado.
    4. Repita esta etapa de limpeza mais duas vezes para remover todos os sais de cultura. Por fim, suspenda a pelota em 4 mL de H2O destilado refrigerado e transfira 1 mL da suspensão para cada um dos quatro tubos cônicos de 1,5 mL de microfuça.
    5. Pelota a cultura bacteriana por centrifugação a 14.000 x g e 4 °C por 5 min. Remova o supernatante sem perturbar a pelota e suspenda cada pelota em 100 μL de H2O destilado refrigerado.
    6. Adicione 3-3,5 μL da mistura de ligadura a cada tubo e incubar no gelo por 5 minutos. Em seguida, transfira o conteúdo de cada tubo para um cuvette de eletroporação de 2 mm refrigerado e aplique 2 kV, 129 Ω e tempo constante em torno de 5 ms.
      NOTA: Pré-esfrie as cuvetas de eletroporação no gelo. Mantenha as bactérias no gelo durante todo o procedimento.
    7. Após a eletroporação, adicione 250 μL de soc médio a cada uma das quatro cuvetas para recuperar seu conteúdo, transfira-os para um tubo de cultura (cerca de 1 mL) e incubar por 1h a 30 °C com agitação (200 rpm).
    8. Emplaque as células transformadas em placas de ágar Luria-Bertani (LB) suplementadas com clorofenicol (25 μg/mL) para garantir que todas as colônias que crescem na placa tenham a espinha dorsal plasmida.
    9. Escolha algumas colônias das placas de ágar LB com clorofífenicol e incubar O/N a 30 °C. Quando as colônias crescerem, verifique a inserção da exclusão construída em pDM4 por PCR usando primers que flanqueiam o lado da clonagem pDM4: pDM4for e pDM4rev (Tabela 1), e colônias lístidas como o modelo (Material Suplementar).
    10. Escolha uma colônia com um palito estéril e mergulhe-o em um tubo de 1,5 mL contendo 15 μL de 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0. Incubar os tubos a 100 °C por 5 min e, em seguida, 1 min no gelo.
    11. Gire os tubos em um microfumes a 12.000 x g por 10 minutos para pellet bactérias e detritos. Use 1 μL do supernatante como modelo na reação PCR (Tabela de Materiais). A temperatura de ressaramento do par de primer é de 50 °C, e a reação pcr requer 10% DMSO (Material Suplementar).
    12. Inocular as colônias que amplificaram o produto de interesse em 10 mL de caldo LB com clororamfenicol (25 μg/mL) e crescer O/N a 30 °C. Extrair o plasmídeo das culturas descritas nas etapas 2.2.1-2.2.2. Sequência usando os primers pDM4 seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
  4. Transferência de exclusão no quadro para o Aeromonas coar
    NOTA: O plasmídeo recombinante pDM4 deve ser introduzido no selecionado Aeromonas tensão por acasalamento triparental (Figura 4). Aeromonas a cepa tem que ser resistente à rifampicina para ser selecionada após o acasalamento triparental. Portanto, cresça as cepas selecionadas O/N no TSB a 30 °C, centrífuga de 2 mL, 4 mL e 6 mL de culturas a 5.000 x g para 15 min, suspenda cada pelota em 100 μL de TSB, e placa em TSA com rifampicina (100 μg/mL).
    1. Prepare as culturas O/N de E. coli MC1061λpir com o plasmídeo recombinante pDM4 no ágar LB com 25 μg/mL chloramphenicol (cepa de doador), a cepa Aeromonas resistente à rifampicina na TSA com 100 μg/mL rifampicina (cepa receptora), e o E. coli HB101 com o plasmídeo pRK2073 no ágar LB com 80 μg/mL de espectinomicina (cepa de ajudante) a 30 °C.
    2. Quando as colônias crescerem, suspenda o mesmo número de colônias (10-15 colônias) do doador, receptor e ajudante, espetos suavemente com um palito estéril em três tubos LB com 150 μL de LB.
    3. Em seguida, em uma placa de ágar LB, sem antibióticos, misture as três suspensões bacterianas em duas gotas em um receptor: auxiliar: proporção de doador de 5:1:1 (50 μL de receptor, 10 μL do doador e 10 μL de ajudante). Incubar a placa de frente para cima O/N a 30 °C. Realize o controle negativo da conjugação usando a cepa do doador sem plasmídeo recombinante.
      NOTA: A cepa do ajudante carrega o plasmídeo conjugal pRK2073 e auxilia na transferência do pDM4 para as Aeromonas. Não use vórtice para suspender as cepas de doador, receptor e ajudante para evitar quebrar o pili.
    4. Colher bactérias da placa de ágar LB adicionando 1 mL de caldo LB e espalhando-o com um espalhador de vidro estéril para obter uma suspensão bacteriana. Use uma pipeta para transferir a suspensão bacteriana para um tubo de microfuça cônico de 1,5 mL e vórtice vigorosamente.
    5. Para selecionar as colônias receptoras contendo o plasmídeo recombinante pDM4, placa 100 μL da suspensão bacteriana colhida em placas de ágar LB com rifampicina (100 μg/mL) e clororamfenicol (25 μg/mL).
    6. Gire 200 μL e 600 μL das amostras em um microfumesco a 5.000 x g por 15 min, suspenda a pelota em 100 μL de caldo LB e placa no ágar LB com rifampicina (100 μg/mL) e clororamfenicol (25 μg/mL). Incubar todas as placas por 24-48 h a 30 °C.
    7. Pegue as colônias cultivadas, transfira para placas LB com rifampicina (100 μg/mL) e clororamfenicol (25 μg/mL), e incuba-as O/N a 30 °C. Em seguida, confirme que as colônias são Aeromonas pelo teste oxidase29 e que o plasmídeo recombinante pDM4 foi inserido (primeira recombinação) na região cromossômica específica pela PCR utilizando as primers E e F (Material Suplementar), que se ligam fora da região amplificada com as primers A e D (Tabela de Materiais). Como descrito na etapa 2.3.11, use 1 μL de colônias líssedas como modelo.
    8. Para completar a troca allelic pela exclusão no quadro, coagir as colônias com o plasmídeo de suicídio integrado a uma segunda recombinação. Cresça as colônias recombinantes em 2 mL de LB com 10% de sacarose e sem antibióticos, O/N a 30 °C.
    9. Placa 100 μL das culturas bacterianas a partir do passo 2.4.8 na placa de ágar LB com sacarose (10%). Além disso, placa 100 μL de diferentes diluições culturais (10-2-10-4) e incubar O/N a 30 °C.
    10. Para confirmar a perda do pDM4, pegue as colônias, transfira para placas LB com e sem clororamfenicol (25 μg/mL), incubar-as O/N a 30 °C e, em seguida, selecionar as colônias sensíveis ao clororamfenícol.
    11. Analise as colônias sensíveis por PCR utilizando o par de primers E-F e 1 μL de colônias líssedas como modelo (Tabela de Materiais e Material Suplementar). Selecione as colônias cujo produto PCR está correlacionado com o tamanho da construção excluída.

3. Ensaios de motilidade

NOTA: Em algumas espécies bacterianas com flagela glicosilada, modificações nos níveis de glicossiltação ou composição glica afetam a montagem de flagellins, o que geralmente se reflete como uma redução de motilidade ou ausência de motilidade. Portanto, dois ensaios de motilidade foram realizados com os mutantes nulos.

  1. Ensaio de motilidade em mídia líquida
    1. A Cultura Aeromonas o/N em 1 mL de TSB a 25-30 °C. Para aderir a uma tampa de microscópio deslizar para um slide escavado, pegue uma pequena quantidade de silicone com a ponta de um palito e coloque uma pequena gota nos quatro cantos do slide da tampa. Em seguida, deposite 1 μL da cultura Aeromonas no meio do slide da tampa e misture em uma gota de mídia TSB fresca (2 μL).
    2. Coloque um slide escavado no slide da tampa. Combine a escavação com a gota depositada, pressione suavemente e vire o slide de cabeça para baixo.
    3. Analise a motilidade da natação por microscopia leve usando um microscópio óptico (Tabela de Materiais) com um objetivo de 100x usando óleo de imersão.
      NOTA: A cepa de Aeromonas de tipo selvagem deve ser usada como controle positivo. Como controle negativo, use uma bactéria não sinalizada como Klebsiella.
  2. Ensaio de motilidade em mídia semissólida
    1. A Cultura Aeromonas o/N em TSB (1 mL) a 25-30 °C. Em seguida, transfira 3 μL da cultura para o centro de uma placa de ágar macio (1% triptona, 0,5% NaCl, 0,25% bacto agar) e incubar a placa face até O/N a 25-30 °C.
    2. Usando uma régua, meça a migração bacteriana através do ágar do centro da placa em direção à periferia.

4. Purificação flagela

  1. Isolamento da flagela ancorada na superfície bacteriana
    1. A Cultura Aeromonas o/N em TSB (10 mL) a 25-30 °C. Em seguida, expanda a cultura em um frasco com TSB (900 mL) e deixe crescer O/N a 25-30 °C com agitação (200 rpm).
    2. Centrifugar a 5.000 x g por 20 min a 4 °C. Suspenda a pelota em 20 mL de tampão Tris-HCl de 100 mM (pH 7.8).
    3. Para remover a flagela ancorada, corte a suspensão em um vórtice com uma barra de vidro (2-3 mm de diâmetro) por 3-4 min e, em seguida, passe repetidamente (mínimo seis vezes) através de uma seringa de 21 G.
    4. Bactérias de pelotas por duas centrífugas consecutivas a 4 °C: primeiro, a 8.000 x g por 30 min. Remova o supernatante e a centrífuga a 18.000 x g por 20 min. Colete o supernatante, que contém flagela grátis.
    5. Ultracentrizar o supernascido a 100.000 x g por 1 h a 4 °C e suspender a pelota em 150 μL de 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) mais 2 mM EDTA tampão. A pelota contém filamentos flagela.
    6. Analise 5-10 μL da pelota resuspended a partir da etapa 4.1.5 por eletroforese em um gel de 12% SDS-Polyacrylamida e visualize as proteínas usando coloração azul Coomassie.
      NOTA: Siga as instruções do fabricante para eletroforese proteica e coloração de gel. Como um controle positivo do flagellin gllicosilado, use a flagela purificada da cepa do tipo selvagem. Purifique a fração enriquecida de flagela em um gradiente de cloreto de césio (CICS).
  2. Gradiente de cloreto de césio para purificar flagela.
    1. Misture 12,1 g de CsCl com 27 mL de H2O destilado.
    2. Transfira a fração enriquecida de flagela (150 μL) para um tubo ultraclacho de paredes finas (14 mm x 89 mm) (Tabela de Materiais) e encha-a com 12 mL de solução CsCl.
    3. Ultracentrificar o tubo a 60.000 x g por 48 h a 4 °C em um rotor de balde balançando (Tabela de Materiais).
    4. Colete a banda flagella no gradiente CsCl com uma seringa e diálise contra 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) mais 2 mM EDTA. Em seguida, analise a flagela dialisada por eletroforese em um gel de poliacrilamida de 12% e coloração azul Coomassie (passo 4.1.6) ou por espectrometria de massa.

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Resultados

Esta metodologia fornece um sistema eficaz para gerar mutantes nulos em genes ou regiões cromossômicas de Aeromonas que podem afetar a glicosylation flagella e o papel do filamento flagela (Figura 1).

O protocolo começa com a identificação bioinformática dos FGIs putativos e os genes que codificam os GTs presentes nesta região. Em Aeromonas, a localização cromossômica dos FGIs baseia-se na detecção de três tipos de genes: genes envol...

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Discussão

O passo crítico inicial desse método é a identificação de regiões envolvidas na glicosilação de flagela e GTs putativas porque essas enzimas apresentam alta homologia e estão envolvidas em muitos processos. A análise bioinformática dos genomas de Aeromonas em bancos de dados públicos mostra que esta região é adjacente à região de flagela polar 2, que contém os genes flagellin em muitas cepas e contém genes envolvidos na biosíntese do ácido udaminic27. Isso possibilitou...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá, pelo Plano Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Espanha) e pelo Centro de Referência em Biotecnologia.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction KitApplied Biosystems4337455Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelityInvitrogen12346-086Used for amplification of AB, CD and AD fragments
AgaroseConda-Pronadise8008Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)PromegaM1821Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agarBecton Dickinson214010Use for motility analysis
BamHIPromegaR6021Used for endonuclease restriction
BglIIPromegaR6081Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin SystemUVPBio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymeraseBiolineBIO-21040Used for colony screening
Cesium chlorideApplichemA1126,0100Used for flagella purification
ChloramphenicolApplichemA1806,0025Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification KitCytivia28-9034-71Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTAApplichem131026.1211Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gapVWR732-1133Used for transformation
Ethidium bromideApplichemA1152,0025Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb markerBiolineBIO-33053DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification KitInvitrogen10750204Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agarCondalab996Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller brothCondalab1551Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000NanoDrop Techonologies IncSpectrophotometer used for DNA quantification
RifampicinApplichemA2220,0005Used for triparental mating
SOC MediumInvitrogen15544034Used for electroporation recovery
SpectinomycinApplichemA3834,0005Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman331362Used for flagella purification
T4 DNA ligaseInvitrogen15224017Used for ligation reaction
Trypticasein soy agarCondalab1068Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy brothCondalab1224Used for Aeromonas grown
TryptoneCondalab1612Use for motility analysis
TrisApplichemA2264,0500Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100ApplichemA4975,0100Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)Beckman344059Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal CyclerApplied BiosystemsUsed for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II KitZymmo researchD4020Used for isolation of plasmid DNA

Referências

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