JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы опишем построение нулевых мутантов Aeromonas в специфических гликозилтрансферазах или областях, содержащих гликозилтрансферазы, анализы подвижности и очистку жгутиков, выполненные для установления участия и функции их кодируемых ферментов в биосинтезе гликана, а также роль этого гликана в бактериальном патогенезе.

Аннотация

Изучение гликозилирования у прокариот является быстро растущей областью. Бактерии содержат различные гликозилированные структуры на своей поверхности, гликаны которых составляют специфический для штамма штрих-код. Ассоциированные гликаны демонстрируют более высокое разнообразие в составе и структуре сахара, чем у эукариот, и играют важную роль в процессах распознавания бактерий-хозяев и взаимодействия с окружающей средой. У патогенных бактерий гликопротеины были вовлечены в разные стадии инфекционного процесса, а модификации гликана могут мешать специфическим функциям гликопротеинов. Однако, несмотря на успехи, достигнутые в понимании состава гликана, структуры и путей биосинтеза, понимание роли гликопротеинов в патогенности или взаимодействии с окружающей средой остается очень ограниченным. Кроме того, у некоторых бактерий ферменты, необходимые для гликозилирования белка, совместно используются с другими полисахаридными биосинтетическими путями, такими как липополисахаридные и капсульные биосинтетические пути. Функциональная важность гликозилирования была выяснена у нескольких бактерий путем мутации специфических генов, которые, как считается, участвуют в процессе гликозилирования, и изучения его влияния на экспрессию целевого гликопротеина и модифицирующего гликана. Мезофильные аэромоны имеют одно- и О-гликозилированный полярный жгутик. Жгутиковые гликаны показывают разнообразие в углеводном составе и длине цепи между штаммами Aeromonas. Тем не менее, все штаммы, проанализированные на сегодняшний день, показывают производное псеудаминовой кислоты в качестве связующего сахара, который модифицирует остатки серина или треонина. Производное псеудаминовой кислоты требуется для сборки полярных жгутиков, и его потеря влияет на адгезию, образование биопленки и колонизацию. Протокол, подробно описанный в этой статье, описывает, как конструкция нулевых мутантов может быть использована для понимания участия генов или областей генома, содержащих предполагаемые гликозилтрансферазы, в биосинтезе жгутикового гликана. Это включает в себя потенциал для понимания функции вовлеченных гликозилтрансфераз и роли гликана. Это будет достигнуто путем сравнения гликан-дефицитного мутанта со штаммом дикого типа.

Введение

Гликозилирование белка было описано как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий и состоит из ковалентного прикрепления гликана к аминокислотной боковойцепи 1,2. У прокариот этот процесс обычно происходит через два основных ферментативных механизма: O- и N-гликозилирование 3. При О-гликозилировании гликан присоединяется к гидроксильной группе остатка серина (Ser) или треонина (Thr). При N-гликозилировании гликан присоединяется к боковой цепи амидного азота остатка аспарагина (Asn) в трипептидных последовательностях Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина.

Гликаны могут принимать линейные или разветвленные структуры и состоят из моносахаридов или полисахаридов, ковалентно связанных гликозидными связями. У прокариот гликаны обычно демонстрируют разнообразие в составе и структуре сахара по сравнению с эукариотическими гликанами4. Кроме того, были описаны два различных пути бактериального гликозилирования, которые отличаются тем, как гликан собирается и переносится в акцепторный белок: последовательное и блоковое гликозилирование 5,6. Для последовательного гликозилирования сложный гликан накапливается непосредственно на белке путем последовательного добавления моносахаридов. При гликозилировании в блоке предварительно собранный гликан переносится в белок из липидно-связанного олигосахарида специализированной олигосахарилтрансферазой (OTase). Было показано, что оба пути участвуют в процессах N- и O-гликозилирования 7.

Гликозилирование белка играет роль в модуляции физико-химических и биологических свойств белков. Присутствие гликана может влиять на то, как белок взаимодействует со своим лигандом, что влияет на биологическую активность белка, но также может влиять на стабильность белка, растворимость, восприимчивость к протеолизу, иммуногенность и взаимодействия микроб-хозяин 8,9. Однако некоторые параметры гликозилирования, такие как количество гликанов, состав гликана, положение и механизм присоединения, также могут влиять на функцию и структуру белка.

Гликозилтрансферазы (ГТ) являются ключевыми ферментами в биосинтезе сложных гликанов и гликоконъюгатов. Эти ферменты катализируют образование гликозидной связи между фрагментом сахара из активированной донорской молекулы и специфическим акцептором субстрата. ГТ могут использовать как нуклеотиды, так и ненуклеотиды в качестве донорских молекул и нацеливаться на различные акцепторы субстрата, такие как белки, сахариды, нуклеиновые кислоты и липиды10. Поэтому понимание ГТ на молекулярном уровне важно для выявления их механизмов действия и специфичности, а также позволяет понять, как сахарный состав гликанов, которые модифицируют соответствующие молекулы, связаны с патогенностью. База данных активных ферментов углеводов (CAZy)11 классифицирует GT в соответствии с их гомологией последовательностей, что обеспечивает прогностический инструмент, поскольку в большинстве семейств GT структурная складка и механизмы действия инвариантны. Однако четыре причины затрудняют прогнозирование субстратной специфичности многих ГТ: 1) у прокариот не определен четкий мотив последовательности, определяющий специфичность субстрата12, 2) многие ГТ и ОТА показывают распущенность субстрата 13,14, 3) функциональные ГТ трудно получить при высоком выходе в рекомбинантной форме и 4) идентификация как донорских, так и акцепторных субстратов сложна. Несмотря на это, недавние исследования мутагенеза позволили получить значительные успехи в понимании каталитических механизмов и вычитании связывания ГТ.

У бактерий O-гликозилирование, по-видимому, более распространено, чем N-гликозилирование. Участки O-гликозилирования не показывают консенсусной последовательности, и многие из O-гликозилированных белков секретируются или белки клеточной поверхности, такие как жгутики, пили или аутотранспортеры1. Гликозилирование флагеллина показывает изменчивость в количестве акцепторных участков, составе гликана и структуре. Например, флагеллины Burkholderia spp имеют только один акцепторный участок, в то время как в Campylobacter jejuni жгутики имеют целых 19 акцепторных сайтов15,16. Кроме того, для некоторых бактерий гликан представляет собой один моносахарид, в то время как другие бактерии обладают гетерогенными гликанами, скомпрометированными различными моносахаридами с образованием олигосахаридов. Такая гетерогенность встречается даже среди штаммов одного вида. Хеликобактерные флагеллины модифицируются только псевдоминовой кислотой (PseAc)17, а флагеллины Campylobacter могут быть модифицированы PseAc, ацетамидиновой формой псеудаминовой кислоты (PseAm) или легионаминовой кислоты (LegAm), и гликанами, полученными из этих сахаров с ацетилом, N-ацетилглюкозамином или пропионными заменителями 18,19. В Aeromonas жгутики модифицируются гликанами, состав которых варьируется от одного производного кислоты PseAc до гетерополисахарида20, а присоединение гликанов к мономерам флагеллина всегда происходит через производное PseAc.

В целом, гликозилирование жгутиков имеет важное значение для сборки жгутиковой нити, подвижности, вирулентности и специфичности хозяина. Однако, в то время как флагеллины C. jejuni16, H. pylori17 и Aeromonas sp. 21 не может собираться в нить, если белковые мономеры не являются гликозилированными, Pseudomonas spp. и Burkholderia spp. 15 не требуют гликозилирования для сборки жгутиков. Кроме того, в некоторых штаммах C. jejuni изменения в сахарном составе жгутикового гликана влияют на взаимодействие бактерий с хозяином и могут играть роль в уклонении от определенных иммунных реакций16. Аутоагглютинация является еще одной фенотипической характеристикой, на которую влияют изменения в составе гликанов, связанных с жгутиками. Более низкая аутоагглютинация приводит к снижению способности образовывать микроколонии и биопленку22. У некоторых бактерий способность жгутиков вызывать провоспалительную реакцию была связана с жгутиковым гликозилированием. Таким образом, у P. aeruginosa гликозилированный жгутикеллин вызывает более высокую провоспалительную реакцию, чем у негликозилированный23.

Аэромоны являются грамотрицательными бактериями, повсеместно распространенными в окружающей среде, что позволяет им находиться на стыке всех компонентов One Health 24. Мезофильные аэромоны имеют один полярный жгутик, который конститутивно образуется. Более половины клинических изолятов также экспрессируют боковой флагеллин, индуцируемый в высоковязких средах или пластинах. Различные исследования связывают оба типа жгутиков с ранними стадиями бактериального патогенеза25. В то время как полярные жгутики, о которых сообщалось на сегодняшний день, являются O-гликозилированными при 5-8 Остатках Ser или Thr его центральных иммуногенных доменов, боковые жгутики не являются O-гликозилированными во всех штаммах. Хотя гликаны полярных жгутиков из разных штаммов демонстрируют разнообразие в своем углеводном составе и длине цепи20, было показано, что связывающий сахар является производным псеудаминовой кислоты.

Целью данной рукописи является описание способа получения нулевых мутантов в конкретных ГТ или хромосомных областях, содержащих ГТ, для анализа их участия в биосинтезе соответствующих полисахаридов и в бактериальной патогенности, а также роли самого гликана. В качестве примера мы идентифицируем и удаляем хромосомную область, содержащую GT Aeromonas , чтобы установить ее участие в гликозилировании полярного флагеллина и проанализировать роль гликана флагеллина. Показано, как удалить конкретный ГТ, чтобы установить его функцию в биосинтезе этого гликана и роль модифицированного гликана. Хотя используя Aeromonas в качестве примера, этот принцип может быть использован для идентификации и изучения островов гликозилирования жгутиков других грамотрицательных бактерий и анализа функции GT, участвующих в биосинтезе других гликанов, таких как липополисахарид O-антигена.

протокол

Схематическое представление процедуры показано на рисунке 1.

1. Биоинформационная идентификация острова гликозилирования жгутиков (FGI) в Aeromonas

  1. Чтобы идентифицировать биосинтетические кластеры PseAc в геномах Aeromonas , используйте инструмент tblastn из базы данных NCBI26. Сначала извлеките ортологичные белки в PseC и PseI A. piscicola AH-3 (идентификационные коды OCA61126.1 и OCA61113.1) из баз данных секвенированных штаммов Aeromonas , а затем используйте инструмент tblastn для поиска их переведенных последовательностей нуклеотидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гены pse обрамляют FGI Aeromonas , с pseB и pseC , расположенными на одном конце кластера, и pseI на другом конце. Расположение остальных генов pse может отличаться от одной группы FGI к другой.
  2. Учитывая, что эти полярные гены флагеллина многих штаммов примыкают к FGI, используйте tblastn из базы данных NCBI, чтобы найти ортологичные белки к полярным жгутикам FlaA и FlaB A. piscicola AH-3 (идентификационные коды OCA61104.1 и OCA61105.1) и генам, которые их кодируют.
  3. Кроме того, ФГИ Aeromonas , участвующие в биосинтезе гетерополисахаридных гликанов (группа II)27 , содержат несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе жирных кислот, такие как luxC и luxE. Используйте tblastn из базы данных NCBI, чтобы найти ортологичные белки для LuxC A. piscicola AH-3 (идентификационный код OCA61121.1) и гена, который его кодирует.

2. Генерация нулевых мутантов в генах острова гликозилирования жгутиков

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод мутагенеза основан на аллельном обмене продуктов делеции полимеразной цепной реакции (ПЦР) в кадре с использованием вектора самоубийства pDM428 (GenBank: KC795686.1). Репликация вектора pDM4 лямбда-пир-зависима , а полный аллельный обмен принуждается с помощью гена sacB , расположенного на векторе.

  1. Построение продуктов для удаления ПЦР в рамке.
    1. Спроектируйте две пары праймеров, которые усиливают участки ДНК вверх по течению (праймеры A и B) и вниз по течению (праймеры C и D) выбранного гена или области, подлежащей удалению (рисунок 2B).
    2. Убедитесь, что праймеры A и D имеют более 600 bp вверх по течению от начала и вниз по течению от остановки, соответственно, гена или генов, подлежащих удалению. Эти два праймера должны включать в конце 5' участок ограничения для эндонуклеазы, который позволяет клонировать в pDM4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Участок ограничения, включенный в 5-футовый конец букварей A и D, не должен совпадать с участками в ампликонах AB или CD.
    3. Убедитесь, что праймеры B и C находятся внутри гена, подлежащего удалению, или внутри первого и последнего гена, соответственно, области, подлежащей удалению. Убедитесь, что оба праймера (B и C) находятся в кадре и расположены между 5-6 кодонами внутри гена. Кроме того, убедитесь, что оба праймера включают на 5' конце комплементарную последовательность 21 bp (таблица 1), которая позволяет объединить ампликоны ДНК AB и CD.
    4. Вырастите выбранный штамм Aeromonas в 5 мл триптического соевого бульона (TSB) в течение ночи (O/N) при 30 °C. Используйте коммерчески доступный комплект для геномной очистки ДНК и следуйте инструкциям производителя (Таблица материалов). Количественно оцените 2 мкл очищенной ДНК с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте двойную дистиллированную воду в качестве заготовки, с прибором, установленным для регистрации поглощения при 260 нм. Запишите абсорбцию с 2 мкл очищенной ДНК в 3-5 раз и рассчитайте среднее показание абсорбции. Используйте закон Бира-Ламберта для расчета концентрации ДНК, где A = Ɛ.c.l., где «A» — поглощение, «Ɛ» — молярный средний коэффициент вымирания для ДНК, «c» — концентрация ДНК, а «l» — длина пути (см. инструкцию производителя для длины пути каждого инструмента).
    5. Используйте 100 нг очищенной хромосомной ДНК в качестве шаблона в двух наборах асимметричных ПЦР с праймерами A-B и C-D (Таблица материалов). Используйте молярное соотношение 10:1 пар праймеров A:B и D:C (дополнительный материал).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Асимметричные ПЦР позволяют предпочтительно амплодировать одну нить шаблона больше, чем другую.
    6. Анализ продуктов ПЦР методом электрофореза в 1% агарозном геле. Используйте TAE (40 мМ трис-ацетата, 1 мМ ЭДТА) в качестве гелевого рабочего буфера и с настройкой мощности 8 В/см. Чтобы визуализировать ДНК, добавьте бромид этидия (0,5 мкг/мл) в гель и визуализируйте продукты ПЦР с помощью станции биовизуализации (Таблица материалов).
    7. Иссечение ампликонов из геля с помощью скальпеля, очистка по протоколу производителя (Таблица материалов) и их количественная оценка.
    8. Соедините ампликоны AB и CD с помощью их перекрывающихся последовательностей 21 bp в 3'-конце продуктов ПЦР (рисунок 3). Смешайте 100 нг каждого ампликона (AB и CD) в ПЦР-трубке с реагентами ПЦР (pre-AD PCR), но без праймеров, и расширьте с помощью термоциклерной программы (Дополнительный материал). Затем добавляют 100 мкМ праймеров А и D к реакции (AD PCR) и усиливают в виде одного фрагмента (дополнительного материала).
    9. Проанализируйте продукт ПЦР (ампликон АД) методом электрофореза в 1% агарозном геле с использованием условий, описанных на этапе 2.1.6, исключите ампликон из геля, очистите в соответствии с протоколом производителя и количественно оцените ампликон (Таблица материалов).
  2. Построение рекомбинантной плазмиды pDM4 с внутрирамочной делецией.
    1. Вырастите культуру O/N Escherichia coli cc18λ pir , содержащую pDM4, в бульоне Миллера Luria-Bertani (LB) (10 мл) с хлорамфениколом (25 мкг/мл) при 30 °C.
    2. Открутите культуру при 5000 х г при 4 °C и суспендируйте гранулу в 600 мкл стерильной дистиллированной воды. Выполните экстракцию и очистку плазмиды pDM4 с использованием коммерчески доступного комплекта для очистки плазмид в соответствии с инструкциями поставщика (Таблица материалов).
    3. Переваривает 1 мкг pDM4 и 400 нг ампликона AD в течение 2 ч с эндонуклеазой, способной переваривать оба конца ампликона AD и место клонирования pDM4 (рисунок 3). Следуйте протоколу производителя фермента для условий реакции (Таблица материалов).
    4. Очистите переваренную плазмиду и ампликон с помощью набора для очистки ДНК и количественно оцените их в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов).
    5. Чтобы предотвратить религирование линеаризированного pDM4, удалите фосфатную группу с обоих 5' концов с помощью фермента щелочной фосфатазы в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов). Затем очистите обработанную плазмиду и количественно оцените ее с помощью спектрофотометра, как описано на этапе 2.1.4 (Таблица материалов).
    6. Смешайте 150 нг переваренного и фосфатазно-щелочного обработанного pDM4 с 95-100 нг переваренного ампликона AD при молярном соотношении вектор:вставка 1:4. Готовят реакцию лигирования в объеме 15 мкл, следуя инструкциям производителя (Таблица материалов).
    7. Инкубируйте O/N при 20 °C или в выходные дни при 4 °C. После инкубации инактивируют Т4-лигазу при 70°С в течение 20 мин.
    8. Используют лигирование для введения плазмиды в штамм Escherichia coli MC1061λpir методом электропорации. Используйте электрокомпетентные бактерии и 2-миллиметровые электропорационные кюветы.
  3. Получение электрокомпетентной кишечной палочки и электропорация рекомбинантной плазмиды pDM4
    1. Инокулируют одну колонию штамма E. coli MC1061λpir в бульон Миллера Luria-Bertani (LB) и выращивают O/N при 30 °C с встряхиванием 200 об/мин.
    2. Развести 2 мл бактериальной культуры в 18 мл бульона LB и инкубировать при 30 °C с встряхиванием (200 об/мин) до достижения оптической плотности (OD600) между 0,4-0,6.
    3. Гранулирование бактериальной культуры центрифугированием при 5,000 х г и 4 °C в течение 15 мин. Выбрасываем супернатант и суспендируем гранулу в 40 мл охлажденного дистиллированногоH2O.
    4. Повторите этот этап очистки еще два раза, чтобы удалить все соли культуры. Наконец, суспендировать гранулу в 4 мл охлажденного дистиллированногоH2Oи перенести 1 мл суспензии в каждую из четырех конических микрофьюжных трубок по 1,5 мл.
    5. Гранулирование бактериальной культуры центрифугированием при 14 000 х г и 4 °C в течение 5 мин. Удалите супернатант, не нарушая гранулу, и суспендируйте каждую гранулу в 100 мкл охлажденного дистиллированногоH2O.
    6. Добавить в каждую пробирку 3-3,5 мкл лигативной смеси и инкубировать на льду в течение 5 мин. Затем перенесите содержимое каждой трубки в охлажденную электропорационную кювету с зазором 2 мм и нанесите 2 кВ, 129 Ω и постоянную времени около 5 мс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охладите электропорационные кюветы на льду. Поддерживайте бактерии на льду в течение всей процедуры.
    7. После электропорации добавляют 250 мкл среды SOC к каждой из четырех кювет для извлечения их содержимого, переносят их в культуральную трубку (около 1 мл) и инкубируют в течение 1 ч при 30 °C с встряхиванием (200 об/мин).
    8. Пластинчатые трансформированные клетки на агаровых пластинах Лурии-Бертани (LB), дополненных хлорамфениколом (25 мкг / мл), чтобы гарантировать, что все колонии, растущие в пластине, имеют плазмидную основу.
    9. Выберите несколько колоний из пластин агара LB с хлорамфениколом и инкубата O/N при 30 °C. Когда колонии растут, проверьте вставку конструкции делеции в pDM4 с помощью ПЦР, используя праймеры, которые обрамляют сторону клонирования pDM4: pDM4for и pDM4rev (таблица 1), и лизированные колонии в качестве шаблона (Дополнительный материал).
    10. Выберите одну колонию стерильной зубочисткой и окуните ее в трубку объемом 1,5 мл, содержащую 15 мкл 1% Triton X-100, 20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 2 мМ ЭДТА рН 8,0. Инкубировать пробирки при 100 °C в течение 5 мин, а затем 1 мин на льду.
    11. Раскрутите трубки в микрофуге по 12 000 х г в течение 10 мин до гранул бактерий и мусора. Используйте 1 мкл супернатанта в качестве шаблона в реакции ПЦР (Таблица материалов). Температура отжига пары праймеров составляет 50 °C, а реакция ПЦР требует 10% DMSO (дополнительного материала).
    12. Инокулируют колонии, которые усиливали интересующий продукт в 10 мл бульона LB, хлорамфениколом (25 мкг/мл) и выращивают O/N при 30 °C. Извлеките плазмиду из культур, как описано в шагах 2.2.1-2.2.2. Последовательность использования грунтовок pDM4 в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов).
  4. Перенос внутрифреймового удаления в Aeromonas напряжение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантная плазмида pDM4 должна быть введена в выбранную Aeromonas штамм путем спаривания с тремя родителями (Рисунок 4). Aeromonas штамм должен быть устойчивым к рифампицину, чтобы быть выбранным после трехродительского спаривания. Поэтому выращивайте выбранные штаммы O/N на TSB при 30 °C, центрифугах 2 мл, 4 мл и 6 мл культур при 5000 x g в течение 15 мин суспендировать каждую гранулу в 100 мкл TSB, а пластину в TSA с рифампицином (100 мкг/мл).
    1. Готовят O/N культуры E. coli MC1061λpir с рекомбинантной плазмидой pDM4 на агаре LB с хлорамфениколом 25 мкг/мл (донорский штамм), штамма Aeromonas , резистентного к рифампицину на TSA со 100 мкг/мл рифампицина (штамм реципиента), и E. coli HB101 с плазмидой pRK2073 на агаре LB со 80 мкг/мл спектиномицина (вспомогательный штамм) при 30 °C.
    2. Когда колонии вырастут, приостановите такое же количество колоний (10-15 колоний) донора, реципиента и вспомогательного штаммов осторожно стерильной зубочисткой в трех трубочках LB со 150 мкл LB.
    3. Затем, на агаровой пластине LB, без антибиотиков, смешайте три бактериальные суспензии в двух каплях у реципиента: соотношение помощник: донор 5: 1: 1 (50 мкл реципиента, 10 мкл донора и 10 мкл помощника). Инкубируйте пластину лицевой стороной вверх O/N при 30 °C. Осуществляют отрицательный контроль конъюгации с помощью донорского штамма без рекомбинантной плазмиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вспомогательный штамм несет конъюгативную плазмиду pRK2073 и способствует переносу pDM4 в Aeromonas. Не используйте вихрь, чтобы приостановить донорские, реципиентные и вспомогательные штаммы, чтобы избежать разрушения пили.
    4. Соберите бактерии с агаровой пластины LB, добавив 1 мл бульона LB и распространив его стерильным стеклянным разбрасывателем для получения бактериальной суспензии. Используйте пипетку, чтобы перенести бактериальную суспензию в коническую микрофьюжную трубку объемом 1,5 мл и энергично вихрь.
    5. Для отбора колоний-реципиентов, содержащих рекомбинантную плазмиду pDM4, пластину 100 мкл собранной бактериальной суспензии на пластинах агара LB с рифампицином (100 мкг/мл) и левомицетином (25 мкг/мл).
    6. Раскрутите 200 мкл и 600 мкл образцов в микрофуге при 5000 х г в течение 15 мин, суспендируйте гранулу в 100 мкл бульона LB и пластине на агаре LB с рифампицином (100 мкг/мл) и хлорамфениколом (25 мкг/мл). Инкубировать все пластины в течение 24-48 ч при 30 °C.
    7. Подберите выращенные колонии, переложите на пластины LB с рифампицином (100 мкг/мл) и хлорамфениколом (25 мкг/мл) и инкубируйте их O/N при 30 °C. Затем подтвердите, что колонии являются Aeromonas с помощью теста оксидазы29 и что рекомбинантная плазмида pDM4 была вставлена (первая рекомбинация) в конкретную хромосомную область с помощью ПЦР с использованием праймеров E и F (дополнительный материал), которые связываются за пределами области, усиленной праймерами A и D (Таблица материалов). Как описано на этапе 2.3.11, используйте в качестве шаблона 1 мкл лизированных колоний.
    8. Чтобы завершить аллельный обмен на внутрирамочную делецию, принудить колонии с интегрированной плазмидой самоубийства ко второй рекомбинации. Выращивать рекомбинантные колонии в 2 мл LB с 10% сахарозой и без антибиотиков, O/N при 30 °C.
    9. Пластина 100 мкл бактериальных культур со стадии 2.4.8 на пластине агара LB с сахарозой (10%). Кроме того, пластина 100 мкл различных культуральных разведений (10-2-10-4) и инкубация O/N при 30 °C.
    10. Чтобы подтвердить потерю pDM4, подберите колонии, перенесите на пластины LB с хлорамфениколом и без него (25 мкг/мл), инкубируйте их O/N при 30 °C, а затем выберите чувствительные к хлорамфениколу колонии.
    11. Анализ чувствительных колоний методом ПЦР с использованием пары праймеров E-F и 1 мкл лизированных колоний в качестве шаблона (Таблица материалов и дополнительного материала). Выберите колонии, продукт ПЦР которых коррелирует с размером удаленной конструкции.

3. Анализы подвижности

ПРИМЕЧАНИЕ: У некоторых видов бактерий с гликозилированными жгутиками модификации уровней гликозилирования или состава гликана влияют на сборку жгутиков, что обычно отражается как снижение подвижности или отсутствие подвижности. Поэтому с нулевыми мутантами были проведены два анализа подвижности.

  1. Анализ подвижности в жидких средах
    1. Культивирование штаммов Aeromonas O/N в 1 мл TSB при 25-30 °C. Чтобы приклеить горку крышки микроскопа к выкопанной горке, подберите небольшое количество силикона кончиком зубочистки и нанесите небольшую каплю на четыре угла затвора крышки. Затем нанесите 1 мкл культуры Aeromonas в середину слайда крышки и смешайте с каплей свежей среды TSB (2 мкл).
    2. Поместите выкопанную горку на горку крышки. Сопоставьте выемку с отложенной каплей, осторожно нажмите и переверните горку вверх дном.
    3. Анализ подвижности плавания с помощью световой микроскопии с помощью оптического микроскопа (Таблица материалов) со 100-кратным объективом с использованием погружного масла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм Aeromonas дикого типа должен использоваться в качестве положительного контроля. В качестве отрицательного контроля используйте небигепеллированную бактерию, такую как Клебсиелла.
  2. Анализ подвижности в полутвердых средах
    1. Культура штаммов Aeromonas O/N в TSB (1 мл) при 25-30 °C. Затем переложить 3 мкл культуры на центр мягкой агаровой пластины (1% триптона, 0,5% NaCl, 0,25% бактоагара) и инкубировать пластину лицевой стороной вверх O/N при 25-30 °C.
    2. Используя линейку, измерьте бактериальную миграцию через агар от центра пластины к периферии.

4. Очистка жгутиков

  1. Выделение жгутиков, закрепленных на бактериальной поверхности
    1. Культивирование штаммов Aeromonas O/N в TSB (10 мл) при 25-30 °C. Затем разверните культуру в колбу с TSB (900 мл) и дайте ей вырасти O/N при 25-30 °C с встряхиванием (200 об/мин).
    2. Центрифуга при 5 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Суспендировать гранулы в 20 мл буфера Tris-HCl 100 мМ (рН 7,8).
    3. Чтобы удалить закрепленные жгутики, срежьте суспензию в вихре со стеклянной планкой (диаметром 2-3 мм) в течение 3-4 мин, а затем пройдите повторно (минимум шесть раз) через шприц 21-G.
    4. Пеллетные бактерии двумя последовательными центрифугированием при 4 °C: сначала при 8000 х г в течение 30 мин. Удалите супернатант и центрифугу при 18 000 х г в течение 20 мин. Соберите супернатант, который содержит свободные жгутики.
    5. Ультрацентрифугируют супернатант при 100 000 х г в течение 1 ч при 4 °C и суспендируют гранулу в 150 мкл 100 мМ Tris-HCl (рН 7,8) плюс 2 мМ буфера ЭДТА. Гранула содержит жгутиковые нити.
    6. Анализируют 5-10 мкл ресуспендированной гранулы со стадии 4.1.5 методом электрофореза в 12% SDS-полиакриламидном геле и визуализируют белки с помощью синего окрашивания Coomassie.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя по электрофорезу белка и окрашиванию гелем. В качестве положительного контроля гликозилированного жгутика используют очищенные жгутики штамма дикого типа. Очищают обогащенную фракцию жгутиков в градиенте хлорида цезия (ClCs).
  2. Градиент хлорида цезия для очищения жгутиков.
    1. Смешайте 12,1 г CsCl с 27 мл дистиллированногоH2O.
    2. Переложить обогащенную фракцию жгутиков (150 мкл) в тонкостенную сверхпрозрачную трубку (14 мм х 89 мм) (Таблица материалов) и заполнить ее 12 мл раствора CsCl.
    3. Ультрацентрифугирование трубы при 60 000 х г в течение 48 ч при 4 °C в качающемся роторе ковша (Таблица материалов).
    4. Соберите жгутиковую полосу в градиент CsCl с помощью шприца и диализуйте против 100 мМ Tris-HCl (рН 7,8) плюс 2 мМ ЭДТА. Затем анализируют диализованные жгутики электрофорезом в 12% SDS-полиакриламидном геле и синим окрашиванием Кумасси (этап 4.1.6) или масс-спектрометрией.

Результаты

Эта методология обеспечивает эффективную систему для генерации нулевых мутантов в генах или хромосомных областях Aeromonas , которые могут влиять на гликозилирование жгутиков и роль нитей жгутиков (рисунок 1).

Протокол начинается с биоинформатической и?...

Обсуждение

Критическим ранним этапом этого метода является идентификация областей, участвующих в гликозилировании жгутиков и предполагаемых ГТ, поскольку эти ферменты показывают высокую гомологию и участвуют во многих процессах. Биоинформационный анализ геномов Aeromonas в общедоступных баз?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным исследовательским советом Канады, Национальным планом I+D (Ministerio de Economía y Competitividad, Испания) и Женералитатом Каталонии (Centre de Referència en Biotecnologia).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction KitApplied Biosystems4337455Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelityInvitrogen12346-086Used for amplification of AB, CD and AD fragments
AgaroseConda-Pronadise8008Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)PromegaM1821Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agarBecton Dickinson214010Use for motility analysis
BamHIPromegaR6021Used for endonuclease restriction
BglIIPromegaR6081Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin SystemUVPBio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymeraseBiolineBIO-21040Used for colony screening
Cesium chlorideApplichemA1126,0100Used for flagella purification
ChloramphenicolApplichemA1806,0025Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification KitCytivia28-9034-71Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTAApplichem131026.1211Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gapVWR732-1133Used for transformation
Ethidium bromideApplichemA1152,0025Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb markerBiolineBIO-33053DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification KitInvitrogen10750204Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agarCondalab996Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller brothCondalab1551Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000NanoDrop Techonologies IncSpectrophotometer used for DNA quantification
RifampicinApplichemA2220,0005Used for triparental mating
SOC MediumInvitrogen15544034Used for electroporation recovery
SpectinomycinApplichemA3834,0005Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman331362Used for flagella purification
T4 DNA ligaseInvitrogen15224017Used for ligation reaction
Trypticasein soy agarCondalab1068Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy brothCondalab1224Used for Aeromonas grown
TryptoneCondalab1612Use for motility analysis
TrisApplichemA2264,0500Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100ApplichemA4975,0100Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)Beckman344059Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal CyclerApplied BiosystemsUsed for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II KitZymmo researchD4020Used for isolation of plasmid DNA

Ссылки

  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
  3. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
  4. Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
  5. Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
  6. Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
  7. Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
  8. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  9. Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
  10. Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
  11. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).
  12. Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
  13. Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
  14. Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
  15. Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
  16. Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
  17. Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
  18. McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
  19. Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
  20. Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
  21. Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).
  22. Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
  23. Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
  24. Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
  25. Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
  26. Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  27. Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
  28. Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
  29. Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
  30. Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
  31. Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
  32. Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
  33. Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181CsCl

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены