JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.

Abstract

המחקר של גליקוסילציה אצל פרוקריוטים הוא אזור שגדל במהירות. על פני השטח שלהם יש לחיידקים מבנים גליקוסיליים שונים, שהגליקנים שלהם מהווים ברקוד ספציפי לזן. הגליקנים הקשורים אליהם מראים גיוון גבוה יותר בהרכב הסוכר ובמבנהו בהשוואה לאלה של אאוקריוטים, והם חשובים בתהליכי זיהוי חיידקים-מארחים ובאינטראקציה עם הסביבה. בחיידקים פתוגניים, גליקופרוטאינים היו מעורבים בשלבים שונים של תהליך הזיהום, ושינויי גליקאן יכולים להפריע לתפקודים ספציפיים של גליקופרוטאינים. עם זאת, למרות ההתקדמות שנעשתה בהבנת ההרכב, המבנה ומסלולי הביוסינתזה של הגליקנים, הבנת תפקידם של גליקופרוטאינים בפתוגניות או באינטראקציה עם הסביבה נותרה מוגבלת מאוד. יתר על כן, בחיידקים מסוימים, האנזימים הדרושים לגליקוזילציה של חלבונים משותפים עם מסלולים ביוסינטטיים אחרים של פוליסכרידים, כגון ליפופוליסכריד ומסלולים ביוסינטטיים כמוסות. החשיבות התפקודית של גליקוסילציה הובהרה במספר חיידקים באמצעות מוטציה של גנים ספציפיים שנחשבו מעורבים בתהליך הגליקוזילציה וחקר השפעתה על הביטוי של גליקופרוטאין המטרה והגליקן המשתנה. לאירומונס מזופילי יש פלגלום קוטבי יחיד ו-O-גליקוזילי. גליקנים פלאגלארים מראים גיוון בהרכב הפחמימות ובאורך השרשרת בין זני אירומונס . עם זאת, כל הזנים שנותחו עד כה מראים נגזרת של חומצה פסאודמינית כסוכר המקשר המשנה שאריות סרין או תראונין. נגזרת החומצה הפסאודמינית נדרשת להרכבת פלגלה קוטבית, ולאובדן שלה יש השפעה על הידבקות, היווצרות ביופילם והתיישבות. הפרוטוקול המפורט במאמר זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בבניית מוטנטים ריקים כדי להבין את המעורבות של גנים או אזורי גנום המכילים גליקוזילטרנספראזות פוטטיביות בביוסינתזה של גליקאן פלאגלאר. זה כולל את הפוטנציאל להבין את תפקודם של הגליקוזילטרנספראזות המעורבות ואת תפקידו של הגליקן. זה יושג על ידי השוואת המוטציה חסרת הגליקן לזן מסוג בר.

Introduction

גליקוזילציה של חלבונים תוארה הן בחיידקים גראם-חיוביים והן בחיידקים גראם-שליליים והיא מורכבת מהצמדה קוולנטית של גליקאן לשרשרת צד של חומצת אמינו 1,2. אצל פרוקריוטים, תהליך זה מתרחש בדרך כלל באמצעות שני מנגנונים אנזימטיים עיקריים: O- ו- N-glycosylation 3. ב-O-glycosylation, הגליקן מחובר לקבוצת ההידרוקסיל של שאריות סרין (Ser) או תראונין (Thr). ב-N-גליקוזילציה, הגליקן מחובר לשרשרת הצדדית של חנקן אמיד של שאריות אספרגין (Asn) בתוך רצפי הטריפפטידים Asn-X-Ser/Thr, כאשר X יכול להיות כל חומצת אמינו למעט פרולין.

גליקנים יכולים לאמץ מבנים ליניאריים או מסועפים והם מורכבים מחד-סוכרים או מפוליסכרידים המקושרים באופן קוולנטי על ידי קשרים גליקוזידיים. אצל פרוקריוטים, גליקנים בדרך כלל מראים גיוון בהרכב הסוכר ובמבנהו בהשוואה לגליקנים אאוקריוטים4. יתר על כן, תוארו שני מסלולי גליקוזילציה חיידקיים שונים הנבדלים זה מזה באופן שבו הגליקן מורכב ומועבר לחלבון המקבל: גליקוזילציה רציפה ו-en bloc 5,6. עבור גליקוזילציה רציפה, הגליקן המורכב בנוי ישירות על החלבון על ידי תוספת רצופה של חד-סוכרים. ב-en bloc glycosylation, גליקאן שהורכב מראש מועבר לחלבון מאוליגוזכריד המקושר בשומנים על ידי אוליגוסכריל-טרנספראז (OTase) מיוחד. שני המסלולים הוכחו כמעורבים בתהליכי N ו-O-glycosylation 7.

לגליקוזילציה של חלבונים יש תפקיד בוויסות התכונות הפיזיקוכימיות והביולוגיות של חלבונים. נוכחותו של גליקאן יכולה להשפיע על האופן שבו החלבון מתקשר עם הליגנד שלו, מה שמשפיע על הפעילות הביולוגית של החלבון, אך יכול גם להשפיע על יציבות החלבון, המסיסות, הרגישות לפרוטאוליזה, אימונוגניות ואינטראקציות בין חיידקים לפונדקאים 8,9. עם זאת, מספר פרמטרים של גליקוזילציה, כגון מספר הגליקנים, הרכב הגליקן, המיקום ומנגנון ההתקשרות, עשויים גם הם להשפיע על תפקוד ומבנה החלבון.

גליקוסילטרנספראזות (GTs) הם האנזימים המרכזיים בביוסינתזה של גליקנים וגליקו-קונג'וגטים מורכבים. אנזימים אלה מזרזים את היווצרות הקשר הגליקוזידי בין מוטי סוכר ממולקולת תורם פעילה לבין מקבל מצע מסוים. GTs יכולים להשתמש הן בנוקלאוטידים והן בנון-נוקלאוטידים כמולקולות תורמות ולמקד מקבלי מצעים שונים, כגון חלבונים, סכרידים, חומצות גרעין וליפידים10. לכן, הבנת ה-GTs ברמה המולקולרית חשובה כדי לזהות את מנגנוני הפעולה והספציפיות שלהם, וגם מאפשרת להבין כיצד הרכב הסוכר של הגליקנים שמשנים מולקולות רלוונטיות קשור לפתוגניות. מסד הנתונים של האנזים הפעיל בפחמימות (CAZy)11 מסווג GTs על פי הומולוגיה של הרצף שלהם, המספקת כלי חיזוי שכן, ברוב משפחות GT, הקפל המבני ומנגנוני הפעולה הם אינווריאנטים. עם זאת, ארבע סיבות מקשות על חיזוי ספציפיות המצע של GTs רבים: 1) לא נקבע מוטיב רצף ברור הקובע את ספציפיות המצע בפרוקריוטים12, 2) GTs ו- OTases רבים מראים הפקרות מצע13,14, 3) GTs פונקציונליים קשה לייצר בתפוקה גבוהה בצורה רקומביננטית ו -4) הזיהוי של מצעי התורם והמקבלים הוא מורכב. למרות זאת, מחקרי מוטגנזה שנערכו לאחרונה אפשרו להשיג התקדמות משמעותית בהבנת המנגנונים הקטליטיים ולחסר את הקשירה של GTs.

בחיידקים, נראה כי O-גליקוזילציה שכיחה יותר מאשר N-גליקוזילציה. אתרי ה-O-glycosylation אינם מראים רצף קונצנזוס, ורבים מחלבוני ה-O-glycosylated מופרשים או חלבונים על פני התא, כגון פלאגלינים, פילי או אוטו-טרנספורטרים1. הגליקוזילציה של פלאגלין מראה שונות במספר האתרים המקבלים, בהרכב הגליקן ובמבנה. לדוגמה, ל-Burkholderia spp flagellins יש רק אתר מקבל אחד, בעוד שבקמפילובקטר ג'ג'וני, לפלגלנים יש לא פחות מ-19 אתרים מקבלים15,16. יתר על כן, עבור חלק מהחיידקים, הגליקן הוא חד-סוכר יחיד, בעוד שחיידקים אחרים הם בעלי גליקנים הטרוגניים הטרוגניים שנפגעו מחד-סוכרים שונים ויוצרים אוליגוסכרידים. ההטרוגניות הזו מתרחשת אפילו בקרב זנים מאותו המין. הליקובקטר פלאגלינים משתנים רק על ידי חומצה פסאודאמינית (PseAc)17, וניתן לשנות את קמפילובקטר פלאגלינים על ידי PseAc, צורת האצטאמידינו של החומצה הפסאודמינית (PseAm) או חומצה לגיונאמינית (LegAm), וגליקנים המופקים מסוכרים אלה עם אצטיל, N-אצטילגלוקוסאמין, או תחליפים פרופיוניים 18,19. ב-Aeromonas, פלאגלינים משתנים על ידי גליקנים שהרכבם נע בין נגזרת אחת של חומצת PseAc להטרופוליסכריד20, והחיבור של גליקנים למונומרים של פלגלין הוא תמיד באמצעות נגזרת PseAc.

באופן כללי, גליקוזילציה של פלאגלינים חיונית להרכבת חוטים, תנועתיות, אלימות וספציפיות מארח. עם זאת, בעוד דגלונים של C. jejuni16, H. pylori17, ו - Aeromonas sp. 21 לא יכול להרכיב לתוך נימה אלא אם כן מונומרים חלבון הם glycosylated, Pseudomonas spp. ו Burkholderia spp. 15 אינם דורשים גליקוסילציה להרכבת פלגלה. יתר על כן, בחלק מזני C. jejuni , שינויים בהרכב הסוכר של הגליקן פלאגלה משפיעים על האינטראקציה בין חיידק לפונדקאי ועשויים למלא תפקיד בהתחמקות מתגובות חיסוניות מסוימות16. Autoagglutination הוא מאפיין פנוטיפי נוסף המושפע משינויים בהרכב של גליקנים הקשורים flagellins. אוטו-אגלוטינציה נמוכה יותר מובילה להפחתה ביכולת ליצור מיקרוקולוניות וביופילם22. בחיידקים מסוימים, היכולת של פלגלה לעורר תגובה פרו-דלקתית נקשרה לגליקוזילציה של פלגלין. לכן, ב P. aeruginosa, גליקוזילציה flagellin משרה תגובה פרו דלקתית גבוהה יותר מאשר unglycosylated23.

אירומונס הם חיידקים גראם-שליליים הנמצאים בכל מקום בסביבה, מה שמאפשר להם להיות בממשק של כל רכיבי One Health 24. לאירומונים מזופיליים יש פלאגלום קוטבי יחיד, המיוצר באופן מכונן. יותר ממחצית המבודדים הקליניים מבטאים גם פלאגלין לרוחב, בלתי ניתן להשראה במדיה או צלחות צמיגות גבוהה. מחקרים שונים קישרו בין שני סוגי הפלגלה לבין השלבים המוקדמים של פתוגנזה חיידקית25. בעוד שפלגלינים קוטביים שדווחו עד כה הם O-גליקוזיליים ב-5-8 Ser או Thr שאריות של התחומים האימונוגניים המרכזיים שלו, פלאגלינים לרוחב אינם O-גליקוזיליים בכל הזנים. אף על פי שהגליקנים של פלגלה קוטבית מזנים שונים מראים גיוון בהרכב הפחמימות שלהם ובאורך השרשרתשלהם 20, הסוכר המקשר הוכח כנגזרת של חומצה פסאודמינית.

מטרתו של כתב יד זה היא לתאר שיטה להשגת מוטציות ריקות ב-GTs או באזורים כרומוזומליים ספציפיים המכילים GTs כדי לנתח את מעורבותם בביוסינתזה של פוליסכרידים רלוונטיים ובפתוגניות חיידקית, כמו גם את תפקידו של הגליקן עצמו. כדוגמה, אנו מזהים ומוחקים אזור כרומוזומלי המכיל GTs של אירומונס כדי לבסס את מעורבותו בגליקוזילציה של פלאגלין קוטבי ולנתח את תפקידו של הגליקן פלאגלין. אנו מראים כיצד למחוק GT מסוים כדי לבסס את תפקודו בביוסינתזה של גליקאן זה ואת תפקידו של גליקאן שונה. למרות השימוש ב- Aeromonas כדוגמה, ניתן להשתמש בעיקרון כדי לזהות ולחקור איי גליקוזילציה של פלגלה של חיידקים גראם שליליים אחרים ולנתח את תפקודם של GTs המעורבים בביוסינתזה של גליקנים אחרים כגון O-אנטיגן ליפופוליסכריד.

Protocol

הייצוג הסכמטי של ההליך מוצג באיור 1.

1. זיהוי ביואינפורמטי של אי הגליקוזילציה פלאגלה (FGIs) באיארומונס

  1. כדי לזהות את האשכולות הביו-סינטטיים של PseAc בגנומים של אירומונס , השתמש בכלי ה-tblastn מתוך מסד הנתונים NCBI26. ראשית, לאחזר חלבונים אורתולוגיים ל-PseC ול-PseI של A. piscicola AH-3 (קודי הזיהוי הם OCA61126.1 ו-OCA61113.1) ממסדי נתונים של זני אירומונס מרוצפים, ולאחר מכן השתמש בכלי ה-tblastn כדי לחפש את רצפי הנוקלאוטידים המתורגמים שלהם.
    הערה: הגנים של pse מקיפים את ה-Aeromonas FGIs, כאשר pseB ו-pseC ממוקמים בקצה אחד של האשכול ו-pseI בקצה השני. המיקום של שאר הגנים של pse יכול להיות שונה מקבוצת FGI אחת לאחרת.
  2. בהתחשב בכך שאותם גנים של פלאגלין קוטבי של זנים רבים סמוכים ל- FGIs, השתמש ב - tblastn ממסד הנתונים של NCBI כדי למצוא חלבונים אורתולוגיים לפלגלין הקוטב FlaA ו- FlaB של A. piscicola AH-3 (קודי הזיהוי הם OCA61104.1 ו- OCA61105.1) ולגנים המקודדים אותם.
  3. בנוסף, אירומונס FGIs המעורבים בביוסינתזה של גליקנים הטרופוליסכרידיים (קבוצה II)27 מכילים מספר גנים המקודדים אנזימים המעורבים בסינתזה של חומצות שומן, כגון luxC ו - luxE. השתמש ב - tblastn ממסד הנתונים של NCBI כדי למצוא חלבונים אורתולוגיים ל- LuxC של A. piscicola AH-3 (קוד הזיהוי הוא OCA61121.1) והגן המקודד אותו.

2. יצירת מוטציות ריקות בגנים של אי הגליקוזילציה של פלאגלה

הערה: שיטה זו של מוטגנזה מבוססת על ההחלפה האלילית של תוצרי מחיקה בתוך מסגרת של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות וקטור ההתאבדות pDM428 (GenBank: KC795686.1). שכפול של וקטור pDM4 הוא תלוי למבדה פיר , והחילוף האלילי השלם נכפה על ידי שימוש בגן sacB הממוקם על הווקטור.

  1. בניית מוצרי מחיקה במסגרת PCR.
    1. תכנן שני זוגות של פריימרים המגבירים את אזורי הדנ"א במעלה הזרם (פריימרים A ו-B) ובמורד הזרם (פריימרים C ו-D) של הגן או האזור שנבחרו למחיקה (איור 2B).
    2. ודא שלפריימרים A ו-D יש יותר מ-600 bp במעלה הזרם מההתחלה ומלמטה מהעצירה, בהתאמה, של הגן או הגנים שיש למחוק. שני פריימרים אלה צריכים לכלול בקצה ה-5' אתר הגבלה עבור אנדונוקלאז המאפשר שיבוט ב-pDM4.
      הערה: אתר ההגבלה הכלול בסוף 5' של פריימרים A ו- D לא צריך להיות זהה לאתרים בתוך AMPLICONS AB או CD.
    3. ודא שפריימרים B ו-C נמצאים בתוך הגן שיש למחוק או בתוך הגן הראשון והאחרון, בהתאמה, של האזור שיש למחוק. ודאו ששני הפריימרים (B ו-C) נמצאים בתוך המסגרת וממוקמים בין 5-6 קודונים בתוך הגן. יתר על כן, ודא ששני הפריימרים כוללים בקצה ה-5 רצף משלים של 21 bp (טבלה 1) המאפשר צירוף של אמפליקוני הדנ"א AB ו-CD.
    4. הגדל את זן Aeromonas שנבחר ב-5 מ"ל של ציר סויה טריפטי (TSB) למשך הלילה (O/N) ב-30 מעלות צלזיוס. השתמש בערכה זמינה מסחרית לטיהור DNA גנומי ופעל לפי הוראות היצרן (טבלת חומרים). לכמת 2 μL של הדנ"א המטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: השתמש במים מזוקקים כפולים כריקים, כאשר המכשיר מוגדר לרשום ספיגה של 260 ננומטר. רשום ספיגה עם 2 μL של דנ"א מטוהר 3-5 פעמים וחשב קריאת ספיגה ממוצעת. השתמש בחוק באר-למברט כדי לחשב את ריכוז הדנ"א, כאשר A = Ɛ.c.l. כאשר "A" הוא ספיגה, "Ɛ" הוא מקדם ההכחדה הממוצע הטוחן עבור דנ"א, "c" הוא ריכוז DNA, ו- "l" הוא אורך הנתיב (עיין בהוראת היצרן עבור אורך הנתיב של כל מכשיר).
    5. השתמש ב-100 ננוגרם של דנ"א כרומוזומלי מטוהר כתבנית בשתי קבוצות של PCR אסימטריים עם פריימרים A-B ו-C-D (טבלת חומרים). השתמש ביחס טוחנת של 10:1 של זוגות פריימרים A:B ו- D:C (חומר משלים).
      הערה: PCRs אסימטריים מאפשרים הגברה מועדפת של גדיל אחד של התבנית יותר מאשר השני.
    6. נתחו את תוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז של 1%. השתמש ב- TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) כמאגר ריצה של ג'ל והגדרת הספק של 8 V/cm. כדי לדמיין דנ"א, הוסיפו אתידיום ברומיד (0.5 מיקרוגרם/מ"ל) לג'ל והדמיינו את תוצרי ה-PCR באמצעות תחנת הדמיה ביולוגית (טבלת חומרים).
    7. הוציאו את האמפליקונים מהג'ל באמצעות אזמל, טהרו בהתאם לפרוטוקול היצרן (טבלת החומרים) וכימתו אותם.
    8. הצטרף לאמפליקונים של AB ו-CD על-ידי רצפים חופפים של 21 bp בסוף 3' של מוצרי PCR (איור 3). יש לערבב 100 ננוגרם מכל אמפליקון (AB ו-CD) בצינור PCR עם ריאגנטים PCR (טרום-AD PCR), אך ללא פריימרים, ולהרחיב באמצעות תוכנית התרמוציקלר (חומר משלים). לאחר מכן, הוסף 100 μM של פריימרים A ו- D לתגובה (AD PCR) והגבר כמקטע יחיד (חומר משלים).
    9. נתחו את מוצר ה-PCR (AD amplicon) על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז של 1% באמצעות התנאים המתוארים בשלב 2.1.6, הוציאו את האמפליקון מהג'ל, טהרו בהתאם לפרוטוקול היצרן וכימתו את האמפליקון (טבלת החומרים).
  2. בניית פלסמיד רקומביננטי pDM4 עם מחיקה בתוך המסגרת.
    1. לגדל תרבות O/N של Escherichia coli cc18λ pir המכיל pDM4 במרק לוריא-ברטאני (LB) מילר (10 מ"ל) עם כלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    2. סובבו את התרבית בטמפרטורה של 5,000 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשעו את הכדור ב-600 μL של מים מזוקקים סטריליים. בצע מיצוי וטיהור של פלסמיד pDM4 באמצעות ערכת טיהור פלסמידים זמינה מסחרית, בהתאם להוראות הספק (טבלת חומרים).
    3. עכלו 1 מיקרוגרם של pDM4 ו-400 ננוגרם של אמפליקון AD למשך שעתיים עם אנדונוקלאז שמסוגל לעכל את שני הקצוות של אמפליקון AD ואת אתר השיבוט של pDM4 (איור 3). עקוב אחר פרוטוקול יצרן האנזים לתנאי תגובה (טבלת חומרים).
    4. נקו את הפלסמיד והאמפליקון המעוכלים באמצעות ערכת טיהור DNA וכימתו אותם בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
    5. כדי למנוע קשירה מחדש של ה-pDM4 הליניארי, הסר את קבוצת הפוספט משני הקצוות של 5 אינץ' באמצעות האנזים phosphatase אלקליין בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים). לאחר מכן, נקו את הפלסמיד המטופל וכימתו אותו באמצעות ספקטרופוטומטר כמתואר בשלב 2.1.4 (טבלת חומרים).
    6. שלב 150 ננוגרם של pDM4 מעוכל ופוספטאז אלקליין שטופל עם 95-100 ננוגרם של אמפליקון AD מעוכל ביחס וקטור טוחן:הוספה של 1:4. הכן את תגובת הקשירה בנפח של 15 μL, בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
    7. אינקובציה O / N ב 20 °C (76 °F) או בסוף השבוע ב 4 °C (64 °F). לאחר הדגירה, יש להשבית את הליגאז T4 בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    8. השתמש בקשירת קשר כדי להכניס את הפלסמיד לתוך Escherichia coli MC1061λpir strain על ידי אלקטרופורציה. השתמש בחיידקים אלקטרו-קומפקטיים ובקובטים אלקטרופורציה עם מרווח של 2 מ"מ.
  3. הכנת E. coli אלקטרו-קומפקטי ואלקטרופורציה של פלסמיד רקומביננטי pDM4
    1. לחסן מושבה אחת של E. coli MC1061λpir זן לתוך לוריא-ברטאני (LB) מרק מילר ולגדל O/N ב 30 °C עם 200 סל"ד רועדים.
    2. מדללים 2 מ"ל מתרבית החיידקים ב-18 מ"ל של ציר LB ודוגרים ב-30 מעלות צלזיוס עם רעד (200 סל"ד) עד להשגת צפיפות אופטית (OD600) בין 0.4-0.6.
    3. גלול את תרבית החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 5,000 x g ו 4 °C (88 °F) במשך 15 דקות. יש להשליך את ה-supernatant ולהשעות את הכדור ב-40 מ"ל של H2O מזוקק מצונן.
    4. חזרו על שלב ניקוי זה פעמיים נוספות כדי להסיר את כל מלחי התרבית. לבסוף, השעו את הכדור ב-4 מ"ל של H2O מזוקק מצונן והעבירו 1 מ"ל של ההשעיה לכל אחד מארבעה צינורות מיקרופוג' חרוטיים של 1.5 מ"ל.
    5. גלולה את תרבית החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 14,000 x גרם ו 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות. הסר את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור והשעה כל כדור ב-100 מיקרול' של H2O מזוקק מצונן.
    6. מוסיפים 3-3.5 מיקרול' מתערובת הקשירה לכל צינור ודוגרים על קרח למשך 5 דקות. לאחר מכן, העבירו את התוכן של כל צינור לקובט אלקטרופורציה מקורר של 2 מ"מ והחלו 2 קילו-וולט, 129 Ω וזמן קבוע סביב 5 אלפיות השנייה.
      הערה: קירור מראש של הקובטים האלקטרופורציה על קרח. לשמור על החיידקים על הקרח במהלך כל ההליך.
    7. לאחר אלקטרופורציה, הוסיפו 250 μL של מדיום SOC לכל אחד מארבעת הקובטים כדי לשחזר את תכולתם, העבירו אותן לצינור תרבית (כ-1 מ"ל), ודגרו למשך שעה אחת ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטולים (200 סל"ד).
    8. צלחת את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר לוריא-ברטאני (LB) בתוספת כלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל) כדי להבטיח שלכל המושבות הגדלות בצלחת יש את עמוד השדרה הפלסמידי.
    9. בחר כמה מושבות מלוחות אגר LB עם כלוראמפניקול ודגירה O / N ב 30 ° C. כאשר המושבות גדלות, בדוק את ההכנסה של מבנה המחיקה ל- pDM4 על ידי PCR באמצעות פריימרים הסובבים את צד השיבוט pDM4: pDM4for ו- pDM4rev (טבלה 1), ומושבות משועבדות כתבנית (חומר משלים).
    10. בחר מושבה אחת עם קיסם סטרילי וטבל אותה בצינור 1.5 מ"ל המכיל 15 μL של 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0. דגירה של הצינורות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן דקה אחת על קרח.
    11. סובבו את הצינורות במיקרו-פוגה במהירות של 12,000 x גרם במשך 10 דקות כדי לזרוק חיידקים ופסולת. השתמש ב- 1 μL של ה-supernatant כתבנית בתגובת ה-PCR (טבלת החומרים). טמפרטורת החישול של זוג הפריימרים היא 50 מעלות צלזיוס, ותגובת ה-PCR דורשת 10% DMSO (חומר משלים).
    12. לחסן את המושבות שהגבירו את המכפלה המעניינת ב-10 מ"ל של ציר LB עם כלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל) ולגדל O/N ב-30 מעלות צלזיוס. הוציאו את הפלסמיד מתרבויות כמתואר בשלבים 2.2.1-2.2.2. רצף באמצעות פריימרים pDM4 בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).
  4. העברת מחיקה בתוך המסגרת ל Aeromonas זן
    הערה: יש להכניס את הפלסמיד הרקומביננטי pDM4 לתוך הנבחר Aeromonas מאמץ על ידי הזדווגות משולשת (תרשים 4). Aeromonas זן צריך להיות עמיד בפני ריפאמפיצין כדי להיבחר לאחר ההזדווגות המשולשת. לכן, הגדל את הזנים שנבחרו O/N ב- TSB ב- 30 °C, צנטריפוגה 2 מ"ל, 4 מ"ל ו- 6 מ"ל של תרביות ב- 5,000 x g במשך 15 דקות, השעו כל כדור ב-100 מיקרול'ל של TSB, וצלחת ב-TSA עם ריפאמפיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל).
    1. הכינו תרביות O/N של E. coli MC1061λpir עם פלסמיד רקומביננטי pDM4 על אגר LB עם 25 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול (זן תורם), זן אירומונס עמיד בפני ריפאמפיצין על TSA עם ריפאמפיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל ריפאמפיצין (זן מקבל), ו-E. coli HB101 עם פלסמיד pRK2073 על אגר LB עם ספקטינומיצין 80 מיקרוגרם/מ"ל (זן עוזר) ב-30 מעלות צלזיוס.
    2. כאשר המושבות גדלו, השעו את אותו מספר מושבות (10-15 מושבות) של זני התורם, המקבל והעוזר בעדינות עם קיסם סטרילי בשלושה צינורות LB עם 150 μL של LB.
    3. לאחר מכן, על צלחת אגר LB, ללא אנטיביוטיקה, מערבבים את שלושת תרחיפי החיידק בשתי טיפות אצל המקבל: עוזר: יחס התורם של 5:1:1 (50 μL של המקבל, 10 μL של התורם, ו-10 μL של עוזר). דגירה של הצלחת עם הפנים כלפי מעלה O / N ב -30 מעלות צלזיוס. לבצע שליטה שלילית על הצמדה באמצעות זן התורם ללא פלסמיד רקומביננטי.
      הערה: זן העוזר נושא את הפלסמיד המצומד pRK2073 ומסייע בהעברת ה-pDM4 לתוך ה-Aeromonas. אין להשתמש במערבולת כדי להשעות את זני התורם, המקבל והמסייע כדי להימנע משבירת הפילי.
    4. קצירת חיידקים מצלחת האגר LB על ידי הוספת מרק 1 מ"ל של LB ופיזורו עם מפזר זכוכית סטרילי כדי לקבל תרחיף חיידקי. השתמשו בפיפטה כדי להעביר את ההשעיה החיידקית לצינור מיקרופוג' חרוטי של 1.5 מ"ל ולמערבולת במרץ.
    5. כדי לבחור את המושבות המקבלות המכילות את הפלסמיד הרקומביננטי pDM4, צלחת 100 μL של תרחיף החיידקים שנקטף על צלחות אגר LB עם ריפאמפיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) וכלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל).
    6. סובבו 200 μL ו-600 μL מהדגימות במיקרו-פוג ב-5,000 x גרם למשך 15 דקות, השעו את הכדור ב-100 μL של ציר LB וצלחת על LB אגר עם ריפאמפיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) וכלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל). דגירה של כל הצלחות למשך 24-48 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    7. הרימו את המושבות הגדלות, העבירו ללוחות LB עם ריפאמפיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) וכלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל), והדגרו אותן O/N ב-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אשרו כי המושבות הן אירומונס על ידי בדיקת האוקסידאז29 וכי פלסמיד רקומביננטי pDM4 הוכנס (רקומבינציה ראשונה) לאזור הכרומוזומלי הספציפי על ידי PCR באמצעות פריימרים E ו- F (חומר משלים), אשר נקשרים מחוץ לאזור מוגבר עם פריימרים A ו- D (טבלת חומרים). כפי שתואר בשלב 2.3.11, השתמש ב- 1 μL של מושבות שחוקות כתבנית.
    8. כדי להשלים את חילופי הדברים האליליים למחיקה בתוך המסגרת, כפה על המושבות את פלסמיד ההתאבדות המשולב לרקומבינציה שנייה. לגדל את המושבות הרקומביננטיות ב 2 מ"ל של LB עם 10% סוכרוז וללא אנטיביוטיקה, O / N ב 30 °C (84 °F).
    9. צלחת 100 μL של תרביות החיידקים משלב 2.4.8 על צלחת אגר LB עם סוכרוז (10%). כמו כן, צלחת 100 μL של דילולי תרבות שונים (10-2-10-4) ודגירה O / N ב 30 °C (74 °F).
    10. כדי לאשר את אובדן ה-pDM4, הרימו את המושבות, העבירו לצלחות LB עם ובלי כלוראמפניקול (25 מיקרוגרם/מ"ל), דגרו אותן O/N ב-30 מעלות צלזיוס, ואז בחרו במושבות הרגישות לכלוראמפניקול.
    11. נתח את המושבות הרגישות על ידי PCR באמצעות זוג פריימרים E-F ו-1 μL של מושבות ליסינג כתבנית (טבלת חומרים וחומר משלים). בחר את המושבות שמוצר ה-PCR שלהן תואם את גודל המבנה שנמחק.

3. מבחני תנועתיות

הערה: בכמה מיני חיידקים עם פלגלה גליקוזילית, שינויים ברמות הגליקוזילציה או הרכב הגליקנים משפיעים על ההרכבה של flagellins, אשר משתקף בדרך כלל כהפחתת תנועתיות או היעדר תנועתיות. לכן, שני מבחני תנועתיות בוצעו עם המוטנטים הריקים.

  1. בדיקת תנועתיות במדיה נוזלית
    1. תרבית אירומונס זנים O / N ב 1 מ"ל של TSB ב 25-30 מעלות צלזיוס. כדי להדביק שקופית כיסוי מיקרוסקופ לשקופית שנחפרה, הרימו כמות קטנה של סיליקון עם קצה קיסם ושמו טיפה קטנה על ארבע הפינות של מגלשת הכיסוי. לאחר מכן, הפקד 1 μL של תרבות Aeromonas באמצע שקופית העטיפה וערבב בטיפה של מדיית TSB טרייה (2 μL).
    2. הניחו שקופית שנחפרה על שקופית העטיפה. התאימו את החפירה לטיפה שהופקדה, לחצו בעדינות והפכו את המגלשה במהופך.
    3. נתחו את תנועתיות השחייה על ידי מיקרוסקופ אור באמצעות מיקרוסקופ אופטי (טבלת חומרים) עם מטרה של פי 100 באמצעות שמן טבילה.
      הערה: יש להשתמש בזן הפראי של אירומונס כבקרה חיובית. כבקרה שלילית, השתמש בחיידק שאינו מלוטש כגון קלבסיאלה.
  2. בדיקת תנועתיות במדיה מוצקה למחצה
    1. תרבית אירומונס זנים O / N ב- TSB (1 מ"ל) ב 25-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו 3 μL מהתרבית למרכז צלחת אגר רכה (1% טריפטון, 0.5% NaCl, 0.25% בקט אגר) ודגרו את הצלחת עם הפנים כלפי מעלה O/N ב-25-30 מעלות צלזיוס.
    2. באמצעות סרגל, מדוד את נדידת החיידקים דרך האגר ממרכז הצלחת לכיוון הפריפריה.

4. טיהור פלגלה

  1. בידוד של פלגלה מעוגן על פני השטח החיידקיים
    1. תרבית אירומונס זנים O / N ב- TSB (10 מ"ל) ב 25-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הרחיבו את התרבות לבקבוקון עם TSB (900 מ"ל) ותנו לה לגדל O/N ב-25-30 מעלות צלזיוס עם רעידות (200 סל"ד).
    2. צנטריפוגה ב 5,000 x g במשך 20 דקות ב 4 ° C. השעו את הכדור ב-20 מ"ל של מאגר Tris-HCl של 100 mM (pH 7.8).
    3. כדי להסיר את הפלגלה המעוגנת, גזזו את המתלים במערבולת עם מוט זכוכית (קוטר 2-3 מ"מ) למשך 3-4 דקות, ולאחר מכן עברו שוב ושוב (לפחות שש פעמים) דרך מזרק 21-G.
    4. חיידקי כדוריות על ידי שתי צנטריפוגות רצופות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס: הראשונה, ב-8,000 x גרם למשך 30 דקות. הסר את הסופרנאטנט והצנטריפוגה ב-18,000 x g למשך 20 דקות. אספו את הסופרנטנט, המכיל דגלונים חופשיים.
    5. Ultracentrifuge את supernatant ב 100,000 x g עבור 1 שעה ב 4 °C ולהשעות את הכדור ב 150 μL של 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) בתוספת 2 mM EDTA חיץ. הכדור מכיל חוטי דגלה.
    6. נתחו 5-10 μL של הכדור שעבר החייאה משלב 4.1.5 על ידי אלקטרופורזה בג'ל SDS-Polyacrylamide של 12% והדמיינו את החלבונים באמצעות צביעה כחולה של Coomassie.
      הערה: עקוב אחר הוראות היצרן עבור אלקטרופורזה של חלבון וכתם ג'ל. כבקרה חיובית על פלגלין גליקוזילוט, השתמש בפלגלה המטוהרת של הזן מסוג בר. לטהר את החלק המועשר של פלגלה בשיפוע צזיום כלוריד (ClCs).
  2. גרדיאנט צזיום כלוריד לטיהור פלגלה.
    1. יש לערבב 12.1 גרם של CsCl עם 27 מ"ל של H2O מזוקק.
    2. העבר את החלק המועשר של פלגלה (150 μL) לצינור דק-דופן שקוף במיוחד (14 מ"מ x 89 מ"מ) (טבלת חומרים) ומלא אותו ב-12 מ"ל של תמיסת CsCl.
    3. Ultracentrifuge את הצינור ב 60,000 x g במשך 48 שעות ב 4 °C ברוטור דלי מתנדנד (טבלת חומרים).
    4. אסוף את רצועת הדגל לתוך שיפוע CsCl עם מזרק ודיאליזה כנגד 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) בתוספת 2 mM EDTA. לאחר מכן, נתחו את הפלגלה הדיאליזדתית על ידי אלקטרופורזה בג'ל SDS-Polyacrylamide של 12% ובכתם כחול של Coomassie (שלב 4.1.6) או על ידי ספקטרומטריית מסה.

תוצאות

מתודולוגיה זו מספקת מערכת יעילה ליצירת מוטנטים ריקים בגנים או באזורים כרומוזומליים של אירומונס שיכולים להשפיע על הגליקוזילציה של פלאגלה ועל תפקידו של חוט פלגלה (איור 1).

הפרוטוקול מתחיל עם זיהוי ביואינפורמטי של FGIs putative ואת הגנים המקודדים GTs מציג באזור ?...

Discussion

השלב המוקדם הקריטי של שיטה זו הוא זיהוי של אזורים המעורבים בגליקוסילציה של פלגלה ו-GTs פוטטיביים מכיוון שאנזימים אלה מראים הומולוגיה גבוהה ומעורבים בתהליכים רבים. ניתוח ביואינפורמטי של גנומים של אירומונס במאגרי מידע ציבוריים מראה כי אזור זה צמוד לאזור הדגלה הקוטבי 2, המכיל את הגנים פל...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר הלאומית של קנדה, עבור תוכנית Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, ספרד) ועבור הגנרליטאט דה קטלוניה (מרכז ההתייחסות לביוטכנולוגיה).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction KitApplied Biosystems4337455Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelityInvitrogen12346-086Used for amplification of AB, CD and AD fragments
AgaroseConda-Pronadise8008Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)PromegaM1821Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agarBecton Dickinson214010Use for motility analysis
BamHIPromegaR6021Used for endonuclease restriction
BglIIPromegaR6081Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin SystemUVPBio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymeraseBiolineBIO-21040Used for colony screening
Cesium chlorideApplichemA1126,0100Used for flagella purification
ChloramphenicolApplichemA1806,0025Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification KitCytivia28-9034-71Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTAApplichem131026.1211Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gapVWR732-1133Used for transformation
Ethidium bromideApplichemA1152,0025Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb markerBiolineBIO-33053DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification KitInvitrogen10750204Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agarCondalab996Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller brothCondalab1551Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000NanoDrop Techonologies IncSpectrophotometer used for DNA quantification
RifampicinApplichemA2220,0005Used for triparental mating
SOC MediumInvitrogen15544034Used for electroporation recovery
SpectinomycinApplichemA3834,0005Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman331362Used for flagella purification
T4 DNA ligaseInvitrogen15224017Used for ligation reaction
Trypticasein soy agarCondalab1068Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy brothCondalab1224Used for Aeromonas grown
TryptoneCondalab1612Use for motility analysis
TrisApplichemA2264,0500Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100ApplichemA4975,0100Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)Beckman344059Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal CyclerApplied BiosystemsUsed for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II KitZymmo researchD4020Used for isolation of plasmid DNA

References

  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
  3. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
  4. Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
  5. Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
  6. Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
  7. Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
  8. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  9. Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
  10. Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
  11. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).
  12. Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
  13. Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
  14. Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
  15. Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
  16. Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
  17. Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
  18. McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
  19. Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
  20. Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
  21. Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).
  22. Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
  23. Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
  24. Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
  25. Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
  26. Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  27. Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
  28. Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
  29. Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
  30. Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
  31. Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
  32. Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
  33. Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181OCsCl

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved