JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول عزل الخلايا البطانية وزراعتها وتوصيفها من الشريان المساريقي البشري. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير طريقة لإعداد الشريان البشري للنسخ المكاني. يمكن إجراء البروتيوميات والنسخ والفحوصات الوظيفية على الخلايا المعزولة. يمكن إعادة استخدام هذا البروتوكول لأي شريان متوسط أو كبير الحجم.

Abstract

الخلايا البطانية (ECs) ضرورية لوظيفة الأوعية الدموية والجسم كله من خلال استجابتها الديناميكية للإشارات البيئية. يعد توضيح النسخ و epigenome من ECs أمرا بالغ الأهمية لفهم أدوارها في التنمية والصحة والمرض ، ولكنه محدود في توافر الخلايا الأولية المعزولة. وقد مكنت التكنولوجيات الحديثة من التنميط عالي الإنتاجية لنسخ EC و epigenome ، مما أدى إلى تحديد المجموعات الفرعية لخلايا EC غير المعروفة سابقا ومسارات النمو. في حين أن ثقافات EC هي أداة مفيدة في استكشاف وظيفة EC والخلل الوظيفي ، فإن ظروف الثقافة والممرات المتعددة يمكن أن تقدم متغيرات خارجية تغير خصائص EC الأصلية ، بما في ذلك المورفولوجيا والحالة اللاجينية وبرنامج التعبير الجيني. للتغلب على هذا القيد ، توضح هذه الورقة طريقة لعزل ECs الأولية البشرية عن الشرايين المساريقية المانحة التي تهدف إلى التقاط حالتها الأصلية. يتم فصل ECs في الطبقة الداخلية ميكانيكيا وكيميائيا حيويا باستخدام إنزيمات معينة. يمكن استخدام الخلايا الناتجة مباشرة للحمض النووي الريبي السائب أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو مطلي للزراعة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف سير العمل لإعداد الأنسجة الشريانية البشرية للنسخ المكاني ، وتحديدا لمنصة متاحة تجاريا ، على الرغم من أن هذه الطريقة مناسبة أيضا لتقنيات التنميط المكاني الأخرى. يمكن تطبيق هذه المنهجية على الأوعية المختلفة التي تم جمعها من مجموعة متنوعة من المانحين في الحالات الصحية أو المرضية لاكتساب رؤى ثاقبة حول التنظيم النسخي واللاجيني EC ، وهو جانب محوري في بيولوجيا الخلايا البطانية.

Introduction

بطانة تجويف الأوعية الدموية ، الخلايا البطانية (ECs) هي منظمات حاسمة للنغمة الوعائية وتروية الأنسجة. ECs رائعة في قدرتها على التفاعل مع البيئة خارج الخلية والتكيف مع التغيرات في ديناميكيات وتكوين تدفق الدم. يتم التوسط في هذه الاستجابات الديناميكية من خلال شبكة من أحداث الإشارات داخل الخلايا ، بما في ذلك التعديلات النسخية وما بعد النسخ بدقة مكانية زمانية. وينطوي خلل تنظيم هذه الاستجابات على العديد من الأمراض، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر أمراض القلب والأوعية الدموية والسكري والسرطان 1,2.

تستخدم نسبة كبيرة من الدراسات خطوط الخلايا أو النماذج الحيوانية لاستجواب نسخ EC. الأول هو أداة مفيدة ، بالنظر إلى سهولة الاستخدام النسبية وعدم التكلفة. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي الاستزراع التسلسلي إلى إدخال تغييرات مظهرية على ECs ، مثل ميزات الخلايا الليفية ونقص الاستقطاب ، وفصلها عن حالتها في الجسم الحي 3. كانت الخلايا الأولية ، على سبيل المثال ، الوريد السري البشري EC (HUVEC) خيارا شائعا منذ 1980s ولكنها مشتقة من سرير وعائي تنموي غير موجود لدى البالغين ، وبالتالي من غير المرجح أن يمثل ECs الناضجة بالكامل. تمثل الحيوانات ، وخاصة نماذج الفئران ، البيئة الفسيولوجية أو الفسيولوجية المرضية ل ECs بشكل أفضل وتسمح باستجواب النسخ نتيجة للاضطراب الوراثي. يمكن عزل Murine ECs من الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الشريان الأورطي والرئتين والأنسجة الدهنية باستخدام الإجراءات القائمة على الإنزيم4،5،6،7. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام الخلايا المعزولة لممرات متعددة ما لم يتم تحويلها6 وغالبا ما تكون محدودة في الأعداد ، مما يتطلب تجميعها من متعددة5،8،9.

إن ظهور تقنيات جديدة تستكشف بنية الأوعية على مستوى النسخ ، خاصة مع دقة الخلية الواحدة ، قد مكن من عصر جديد من البيولوجيا البطانية من خلال الكشف عن وظائف وخصائص جديدة ل ECs 5,10,11,12,13,14. جمع مورد غني بناه محققو Tabula Muris ملفات تعريف نسخية أحادية الخلية ل 100000 خلية بما في ذلك ECs عبر 20 عضوا فئوريا مختلفا15 ، والتي كشفت عن كل من جينات علامة EC الشائعة والتوقيعات النسخية الفريدة مع الاختلافات بين الأنسجة وداخلها 5,13. ومع ذلك ، هناك اختلافات واضحة بين الفأر والإنسان في الجينوم ، epigenome ، و transcriptome ، خاصة في المناطق غير المشفرة16،17،18. تؤكد هذه العيوب المذكورة أعلاه على أهمية تحليل ECs باستخدام عينات بشرية من أجل الحصول على ملف تعريف أمين لل ECs في حالتها الأصلية في الصحة والمرض.

تعتمد معظم طرق عزل EC على التفكك الجسدي من خلال التجانس والقطع الدقيق وفرم الأنسجة قبل الحضانة بالإنزيمات المحللة للبروتين لأوقات مختلفة. تختلف الإنزيمات والظروف أيضا اختلافا كبيرا بين أنواع الأنسجة ، من التربسين إلى الكولاجيناز ، المستخدمة بمفردها أو في تركيبة19،20،21. غالبا ما يتم تضمين المزيد من التخصيب أو التنقية القائمة على الأجسام المضادة لزيادة نقاء ECs. عادة ، يتم اقتران الأجسام المضادة ضد علامات غشاء EC ، على سبيل المثال ، CD144 و CD31 بالخرز المغناطيسي وتضاف إلى تعليق الخلية22,23. يمكن تكييف هذه الاستراتيجية بشكل عام لعزل EC عن الأنسجة البشرية والفئران المتعددة ، بما في ذلك التقنيات التي تم إدخالها في هذا البروتوكول.

في حالتها الأصلية ، تتفاعل ECs مع أنواع متعددة من الخلايا وقد توجد في منافذ الأوعية الدموية حيث يكون قرب الخلية أمرا بالغ الأهمية للوظيفة. في حين أن دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنووية الواحدة (scRNA و snRNA-seq) كانت ذات أهمية قصوى للاختراقات الأخيرة في وصف عدم تجانس EC ، فإن عملية التفكك تعطل سياق الأنسجة واتصال الخلايا الخلوية ، والتي هي أيضا مهمة لفهم بيولوجيا EC. تم تطوير التنميط المكاني في عام 2012 وأطلق عليه اسم طريقة العام في عام2020 24 ، وقد تم استخدام التنميط المكاني لتحديد ملامح التعبير الجيني العالمي مع الاحتفاظ بالسمات المكانية في الأنسجة المختلفة بما في ذلك الدماغ 25 والورم26 والأنسجة الدهنية27. يمكن استهداف التقنيات ، باستخدام مجسات متخصصة خاصة بتسلسلات الحمض النووي الريبي الخاصة المرتبطة بكواشف التقارب أو علامات الفلورسنت ، وبالتالي اكتشاف جينات مختارة بدقة دون خلوية28،29،30،31. يمكن أيضا أن تكون غير مستهدفة32,33 ، وعادة ما تستخدم oligonucleotides المشفرة مكانيا لالتقاط الحمض النووي الريبي ، والتي يتم تحويلها معا إلى cDNA لإعداد مكتبة seq اللاحقة ، وبالتالي لديها ميزة استنتاج التعبير الجيني للأنسجة بأكملها بطريقة غير متحيزة. ومع ذلك، لا يتم حاليا تحقيق الاستبانة المكانية على مستوى خلوي واحد باستخدام التكنولوجيات المتاحة تجاريا. يمكن التغلب على ذلك إلى حد ما من خلال تكامل البيانات مع بيانات scRNA-seq ، مما يسمح في النهاية برسم خرائط لنسخ الخلية الواحدة في سياق الأنسجة المعقدة مع الاحتفاظ بمعلوماتها المكانية الأصلية34.

هنا ، يتم وصف سير العمل لملف تعريف EC transcriptome باستخدام الشريان المساريقي البشري العلوي ، وهو شريان محيطي تم استخدامه لدراسة توسع الأوعية الدموية ، وإعادة تشكيل الأوعية الدموية ، والإجهاد التأكسدي ، والالتهاب35،36،37. يتم وصف تقنيتين: 1) لعزل وإثراء ECs من داخل الأوعية الدموية التي تجمع بين التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي المناسب لتسلسل النسخ أحادي الخلية أو في الثقافة المختبرية اللاحقة ؛ 2) إعداد أقسام الشرايين للتنميط المكاني (الشكل 1). يمكن تنفيذ هاتين التقنيتين بشكل مستقل أو متكامل لتحديد ملامح ECs والخلايا المحيطة بها. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف سير العمل هذا للاستخدام على أي شريان متوسط أو كبير.

Protocol

أجريت دراسات الأنسجة البشرية على عينات مجهولة الهوية تم الحصول عليها من مركز موارد خلايا جزيرة جنوب كاليفورنيا في مدينة الأمل. تم الحصول على موافقات البحث لاستخدام الأنسجة البشرية بعد الوفاة من أقرب أقرباء المتبرعين ، وتم منح الموافقة الأخلاقية لهذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمدينة الأمل (IRB No. 01046).

1. التفكك البدني (الوقت المقدر: 1-2 ساعة)

  1. ضع شريانا طازجا على طبق طوله 10 سم واغسله بمحلول ملحي معقم من دولبيكو المخزن بالفوسفات (D-PBS).
  2. باستخدام ملقط معقم ومقص تشريح ، قم بإزالة الدهون والأنسجة الضامة الخارجية حتى يصبح الوعاء نظيفا. قم بقياس طول الوعاء باستخدام مسطرة موضوعة خارج الطبق والتقط صورا للسجلات (الشكل 1A).
  3. قبل السخونة مناسبة الهضم العازلة إلى 37 درجة مئوية: ل scRNA-seq استخدام إنزيم تفكك الخلايا. لمقايسات زراعة الخلايا ، استخدم 1-6 مجم / مل من الكولاجيناز D ، 3 مجم / مل من البروتياز المشتق من البكتيريا ، 100 mM من HEPES ، 120 mM من كلوريد الصوديوم ، 50 mM من KCl ، 5 mM من الجلوكوز ، مع 1 mM من CaCl2 6,38 (الرقم الهيدروجيني 7.0 ، لا يتطلب تعديلا) تضاف قبل 5 دقائق من الاستخدام.
  4. خذ الشريان المساريقي (عادة بقطر 6-8 مم) وقطعه بالطول باستخدام مقص لفتح تجويف الوعاء عموديا.
  5. باستخدام الإبر ، قم بتوصيل الوعاء بالشمع الأسود في جميع الزوايا الأربع ، تاركا البطانة مكشوفة (الشكل 1B).
  6. أضف 1 مل من مخزن الهضم العازل قبل التسخين إلى العلاقة الحميمة. خذ مشرطا معقما وكشط تجويف الوعاء بلطف مرتين.
    ملاحظة: الغرض من هذا الإجراء هو فصل الطبقة الداخلية ، والتي قد تحتاج إلى ممارسة. يجب بذل قوة كافية لإزالة البطانة ، ولكن ليس لدرجة أن الطبقات العميقة من الأنسجة تتم إزالتها أيضا ، مما يقلل من تمثيل EC.
  7. انقل المخزن المؤقت للهضم إلى أنبوب 5 مل. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للهضم إلى intima وماصة لأعلى ولأسفل بعناية لجمع الخلايا المتبقية وإضافتها إلى أنبوب 5 مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، والدوران عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  8. أضف 2 مل من وسط M199 (أو D-PBS إذا استمر مع scRNA-seq) إلى تعليق الخلية لإخماد التفاعل الإنزيمي. تخلط بلطف وجهاز طرد مركزي على درجة حرارة 4 درجات مئوية ، 600 × جم لمدة 5 دقائق.
  9. قم بإزالة السوبرناتانت وتخزين السوبرناتان بشكل منفصل للزراعة كعنصر تحكم لمراقبة ما إذا كانت جميع الخلايا قد تم التقاطها في الكريات في الخطوة 1.8. أعد تعليق حبيبة الخلية في 1 مل من وسط M199 (أو D-PBS إذا استمر مع scRNA-seq).
  10. تقييم صلاحية الخلية عن طريق خلط 10 ميكرولتر من التربان الأزرق مع 10 ميكرولتر من مخزون الخلايا. راقب مورفولوجيا الخلية وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن استخدام الخلايا لتحديد كمية البروتين أو الحمض النووي الريبي أو استزراعها في المختبر باستخدام وسائط زراعة EC باتباع البروتوكولات القياسية39. بدلا من ذلك ، يمكن إعدادها للتسلسل كما هو موضح في القسم التالي.
  11. بالنسبة للثقافة ، قم بتغطية بئرين من صفيحة من 6 آبار عن طريق سحب 500 ميكرولتر من كاشف التعلق في الآبار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة كاشف التعلق والغسيل باستخدام D-PBS المعقم ، قم بتوزيع مخزون الخلايا الكامل في بئر واحد ، واحتفظ بالمادة الفائقة كعنصر تحكم في البئر الثاني.

2. التحضير لدراسات scRNA-seq (الوقت المقدر: 3-4 ساعات)

  1. الطرد المركزي لمخزون الخلايا من الخطوة 1.11 عند 4 درجات مئوية ، 600 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات بلطف باستخدام ماصة P1000 وطرف واسع التجويف في 1 مل من ألبومين مصل البقر بنسبة 0.04٪ (BSA) في D-PBS. اخلطي جيدا لضمان تعليق أحادي الخلية.
  2. مرر المحلول من خلال مصفاة 40 ميكرومتر لإزالة حطام الخلايا. إذا بقي الحطام ، فقم بالمرور عبر مصفاة ثانية إلى 4 مل من 0.04٪ BSA في D-PBS.
  3. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية ، 600 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من 0.04٪ BSA في D-PBS باستخدام ماصة P1000 مع طرف ماصة واسع التجويف. اخلطي جيدا لضمان تعليق أحادي الخلية.
  4. تقييم صلاحية الخلية عن طريق خلط 10 ميكرولتر من مخزون الخلايا مع 10 ميكرولتر من التربان الأزرق. باستخدام مقياس الدم ، راقب المورفولوجيا ، وحدد ما إذا كان هناك تعليق أحادي الخلية بدون مجموعات ، وتحقق من وجود حطام الأنسجة ، واحسب عدد الخلايا الحية والميتة.
  5. إذا كانت الخلايا متجمعة أو بقيت الحطام ، فكرر الغسيل باستخدام 0.04٪ BSA في D-PBS أو تمر عبر مصفاة 40 ميكرومتر مرة أخرى.
    ملاحظة: في حين أن هذا سيقلل من العائد ، فمن المهم أن توجد الخلايا في تعليق نظيف أحادي الخلية لتحقيق التسلسل الأمثل.
  6. يمكن استخدام التعليق أحادي الخلية ل scRNA-seq.

3. التنميط المكاني (الوقت المقدر: 3-4 ساعات)

  1. أضف الأيزوبنتان (2-ميثيل بيوتان) إلى علبة معدنية وقم بتبريده في النيتروجين السائل (LN 2) أو الثلج الجاف (يفضل LN2 لأنه سيجعل درجة الحرارة أقل من الثلج الجاف). صب مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) في آبار القوالب البلاستيكية المبردة المصنفة مع الحرص على عدم إنشاء فقاعات وإزالة تلك التي تظهر. اتركي الثلج على الثلج الجاف حتى يبرد.
  2. قطع ما لا يقل عن قسمين إكليليين ، بطول 1 سم من السفينة. باستخدام ملقط طويل (12 بوصة)، قم بغمر الأنسجة في الأيزوبنتان حتى يتم تجميدها. قم بغمر الأنسجة بسرعة في OCT عند التوجيه مع التجويف المرئي في المركز. احرص على إزالة أي فقاعات ، خاصة تلك الموجودة بجوار الأنسجة.
  3. باستخدام ملقط طويل (12 بوصة)، أمسك بقوالب التبريد، وأمسكها في العلبة المعدنية. في حين أن قاعدة القوالب يجب أن تكون في السائل ، إلا أنه لا ينبغي أن يكون عميقا جدا للسماح للإيزوبنتان بالركض فوق الأنسجة. لاحظ التجميد ، سيصبح OCT أبيض تدريجيا من الخارج في 1-2 دقيقة.
  4. قم بتخزين هذه الأقسام في حاوية مغلقة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    ملاحظة: احتفظ بالعينات على الثلج الجاف في جميع الأوقات ولا تسمح بأكثر من دورة تجميد وذوبان واحدة. يمكن استخدام هذا النسيج للتحليل النسيجي ، أو التهجين الفلوري للحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) ، أو النسخ المكاني ، والذي سيتم وصفه الآن.
  5. قم بإعداد درجة حرارة cryostat إلى -20 درجة مئوية للغرفة و -10 درجة مئوية لرأس العينة. قم بموازنة أقسام الأوعية المدمجة OCT والسكاكين والفرش والشرائح إلى -20 درجة مئوية في cryostat لمدة 30 دقيقة تقريبا. أثناء التوازن ، قم بتنظيف الماكينة وجميع المعدات التي قد تلمس الأقسام ، بما في ذلك الشفرة ، باستخدام 70٪ من الإيثانول متبوعا بمحلول إزالة التلوث RNase.
  6. قم بإرفاق العينة عن طريق توزيع كمية صغيرة من OCT على كتلة cryostat الدائرية ووضع العينة في الأعلى قبل أن تتجمد. ضع الكتلة في وسط رأس العينة وقم بتثبيت الكتلة في مكانها باستخدام مقبض أسود طويل القامة على اليسار. قطع أي OCT الزائدة المحيطة السفينة.
  7. بضبط سمك القطع على 10 ميكرومتر على المبرد ، قم بقطع ما يقرب من 60 قسما ووضعها في أنبوب 1.5 مل مبرد مسبقا. سيتم استخدام هذه الأقسام لتقييم جودة الحمض النووي الريبي. عند الإزالة من cryostat ، أضف على الفور 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي والدوامة حتى يتم إذابة الأقسام تماما.
  8. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم واخلطه حتى يشبه المحلول ميلك شيك الفراولة. جهاز طرد مركزي عند 11,200 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. جمع الطور المائي (مرحلة واضحة فوق الطبقات البيضاء والوردية) وإضافة 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إليها. اخلطي الأنابيب عن طريق قلب الأنابيب أكثر من 10 مرات وضعيها عند -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  10. جهاز طرد مركزي عند 11,200 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإذابة حبيبات الحمض النووي الريبي النقي في 5 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. فحص رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN).
    ملاحظة: يفضل العينات التي تحتوي على RIN ≥ 7 ، ولكن RIN ≥ 6 مقبول. قد يتطلب عدد أقسام الأنسجة وحجم المحلول لإذابة الحمض النووي الريبي التحسين اعتمادا على النظام المستخدم لضمان أن تركيز الحمض النووي الريبي النهائي ضمن نطاق وظيفة RIN للسماح بتقييم RIN بدقة.
  11. تدرب على قطع ووضع المقاطع بشكل صحيح داخل الإطارات الائتمانية باستخدام شرائح زجاجية عادية قبل الشروع في تحسين الأنسجة المتاحة تجاريا أو شرائح التعبير الجيني. يمكن تحقيق ذلك عن طريق رسم مربعات 6.5 مم × 6.5 مم على شريحة زجاجية عادية ، والتبريد إلى -20 درجة مئوية في cryostat ، ووضع أقسام في منطقة الالتقاط هذه.
  12. قم بقص مقاطع 10 ميكرومتر مع لوحة مضادة للتدحرج في مكانها ، واقلبها وتسطيحها بعناية عن طريق لمس القسم بلطف من خلال OCT المحيط.
  13. باستخدام فرش cryostat الخالية من RNase ، ضع قسم الأنسجة داخل المربع ، باستخدام OCT المحيط فقط. ضع على الفور إصبعا واحدا (في قفازات) على الجانب الخلفي من منطقة الالتقاط لإذابة القسم إلى الشريحة.
  14. بمجرد التصاق القسم ، ضع الشريحة على شريط التبريد للسماح للقسم بالتجمد. يجب توخي الحذر لتجنب طي الأنسجة والأنسجة التي تغطي الحواف المحددة للإطار الائتماني. إذا لزم الأمر ، قم بقطع الأنسجة إلى نصفين أو أرباع على طول التجويف باستخدام شفرة لضمان ملاءمة قسم الوعاء داخل الإطار 6.5 مم × 6.5 مم.
  15. قطع 10 ميكرومتر أقسام من الأنسجة وفقا ل 3.12-3.14 على تحسين الأنسجة أو شرائح التعبير الجيني. انقل الشريحة إلى بريدية شرائح موضوعة على الثلج الجاف. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع قبل متابعة البروتوكولات المكانية المنشورة33,34.

4. تحليل بيانات التسلسل (الوقت المقدر: ما يصل إلى 1 أسبوع اعتمادا على الإلمام بالبرامج)

ملاحظة: للتحليل الناسخ المكاني فقط، انتقل إلى الخطوة 4.8. تتم معالجة بيانات scRNA-seq باستخدام خط أنابيب موحد محاذاة ل hg38 المرجع البشري. تستخدم حزمة R Seurat (الإصدار 3.2.2) لتحليل بيانات scRNA-seq باتباع الإرشادات المنشورة40.

  1. التصفية باستخدام مقاييس مراقبة الجودة الراسخة: تتم إزالة الخلايا النادرة التي تحتوي على أعداد كبيرة جدا من الجينات (يحتمل أن تكون متعددة) والخلايا ذات النسب المئوية العالية للميتوكوندريا (غالبا ما تعرض الخلايا منخفضة الجودة أو المحتضرة تلوث الميتوكوندريا).
  2. تطبيع البيانات باستخدام "sctransform" ، وهي طريقة لتحسين تكامل العينة مقارنة بتطبيع السجل. وتستخدم هذه البيانات المعيارية لتقليل الأبعاد وتجميعها، في حين تستخدم مستويات التعبير المعيارية للسجل للتحليل استنادا إلى مستويات التعبير الجيني، مثل التصنيف41 من نوع الخلية.
  3. حدد جينات العلامات لكل نوع من الخلايا ، على سبيل المثال ، جزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية -1 (PECAM1) وعامل فون ويلبراند (VWF) ل ECs ، و lumican (LUM) ومحسن البروكولاجين C-Endopeptidase (PCOLCE) للخلايا الليفية ، وجين نقل الخلايا البائية 1 (BTG1) و CD52 للبلاعم ، و C1QA و C1QB للخلايا الأحادية ، وسلسلة الميوسين الثقيلة 11 (MYH11) و ترانسجيلين (TAGLN) لخلايا العضلات الملساء الوعائية36.
  4. احسب متوسط مستوى التعبير عبر خلايا مفردة بين كل زوج من العلامات من أجل الحصول على علامة واحدة بمتوسط مستوى تعبير مقترن بكل نوع خلية42.
  5. قم بتطبيق نموذج خليط غاوسي (GMM) مع مكونين على بيانات التعبير لكل علامة عبر خلايا مفردة من أجل فصل الخلايا إلى مجموعتين ، وهما التعبير العالي عن العلامة والتعبير عن العلامة بشكل منخفض. بهذه الطريقة ، لكل علامة ، يتم تعيين كل خلية واحدة إلى أحد المكونين42.
  6. استخدم الإثراء الإحصائي لمجموعة جينات العلامات، وهو اختبار فيشر الدقيق، لتعيين نوع خلية لكل مجموعة. من خلال القيام بذلك ، يتم الحصول على مجموعة من قيم p لكل مجموعة ، كل منها يتوافق مع نوع الخلية. يتم تعيين نوع الخلية ذات أدنى قيمة p إلى هذه المجموعة.
  7. معالجة البيانات النسخية المكانية باستخدام خطوط أنابيب Space Ranger مما يؤدي إلى فك الترميز الشريطي المكاني وتوليد مقاييس مراقبة الجودة (QC) ، بما في ذلك إجمالي القراءات المحاذاة ل hg38 human transcriptome ، ومتوسط عدد المعرف الجزيئي الفريد (UMI) أو الجينات لكل بقعة35.
    ملاحظة: تستخدم حزمة R Seurat (الإصدار 3.2.2) لتحليل البيانات التي يعالجها حارس الفضاء باتباع الإرشادات المنشورة40.
  8. تطبيع البيانات باستخدام "sctransform" ، وهي طريقة ثبت أنها تحسن التحليل النهائي مقارنة بتطبيع السجل نظرا لعدم تجانس الأنسجة والتباين الكبير جدا في الأعداد عبر البقع.

النتائج

يصور هنا تحليل ECs من الشريان المساريقي باستخدام مزيج من التفكك الميكانيكي والأنزيمي أو الحفظ بالتبريد للاستخدام في مختلف الفحوصات النهائية (الشكل 1). يمكن تحديد ملامح ECs في الشرايين المساريقية باستخدام الخطوات التالية: أ) الانفصال الميكانيكي عن البطانة الداخلية إلى جانب ه?...

Discussion

يفصل سير العمل المقدم مجموعة من التقنيات لتحديد ملامح ECs من قطعة واحدة من الشريان البشري بدقة أحادية الخلية ومكانية. هناك العديد من الخطوات الحاسمة والعوامل المقيدة في البروتوكول. أحد مفاتيح التنميط النصفي هو نضارة الأنسجة وسلامة الحمض النووي الريبي. من المهم الحفاظ على الأنسجة على الجلي...

Disclosures

S.Z. هو مؤسس وعضو مجلس إدارة شركة Genemo, Inc.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01HL108735 و R01HL145170 و R01HL106089 (إلى Z.B.C.) ؛ DP1DK126138 و DP1HD087990 (إلى S.Z.) ؛ منحة مؤسسة إيلا فيتزجيرالد ومشروع عائلة وانيك (إلى Z.B.C.) ؛ ومنحة شبكة بذور أطلس الخلايا البشرية (إلى Z.B.C. و S.Z.). شملت الأبحاث الواردة في هذا المنشور العمل المنجز في مركز الجينوم التكاملي في مدينة الأمل بدعم من المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة P30CA033572. يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور إسماعيل العبد الله والدكتور ميريجنغ تشي من فريق زراعة الجزر في مدينة الأمل لعزل الأنسجة البشرية ، والدكتور دونغتشيانغ يوان في مدينة الأمل على مساعدته في تحليل scRNA-seq ، والدكتور مارك هالوشكا في قسم أمراض القلب والأوعية الدموية ، كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز على رؤاه القيمة في علم الأنسجة الوعائية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL micro-centrifuge tubeUSA Scientific1615-5500
10 cm dishGenesee Scientific25-202
23G needlesBD305145
2-methylbutaneThermo FisherAC327270010
40 µm strainerFisher14100150
4200 TapeStation SystemAgilent TechnologiesG2991BA
5 mL tubeThermo Fisher14282300
6-well plateGreiner Bio-One07-000-208
Attachment factorCell Applications123-500Attachment reagent in the protocol
Black waxAny commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treatedFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeEppendorf
ChloroformFisherC607
Collagenase DRoche11088866001
CryostatLeica
Cryostat brushes
D-GlucoseFisherD16-1
Dimethyl sulfoxideFisherMT25950CQC
Dispase IIRoche4942078001Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety ScalpelsMyco Instrumentation6008TR-10
D-PBSThermo Fisher14080055
EthanolFisherBP2818-4
Fetal bovine serumFisher10437028
HemocytometerFisher267110
HEPESSigma AldrichH3375-100g
High sensitivity D1000 sample bufferAgilent Technologies5067-5603
High sensitivity D1000 screen tapeAgilent Technologies5067-5584
IncubatorKept at 37 °C 5% CO2
IsopropanolFisherBP26324
KClFisherP217-3
Liquid nitrogen
Medium 199Sigma AldrichM2520-10X
Metal cannister
MicroscopeLeicaTo assess cell morphology
Microvascular endothelial culture mediumCell Applications111-500
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shakerEppendorf
Optimal Cutting Temperature compoundFisher4585
Plastic cryomoldsFisher22363553
RNA screen tapeAgilent Technologies5067-5576
RNA screen Tape sample bufferAgilent Technologies5067-5577
RNase ZAPThermo FisherAM9780
RNase-free waterTakaraRR036BRNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forcepsF.S.T91100-16
Sterile fine forcepsF.S.T11050-10
Sterile fine scissorsF.S.T14061-11
Superfrost PLUS Gold SlidesFisher1518848
TRIzol reagentFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol redThermo Fisher12605010Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit10X GenomicsPN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns10X GenomicsPN-1000184

References

  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , 1-38 (2007).
  4. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  5. Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
  6. Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  7. Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
  8. Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
  9. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
  10. Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
  11. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  12. Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
  13. Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
  14. Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
  15. The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  16. Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
  17. Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
  18. Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
  19. Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
  20. McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
  21. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
  22. Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
  24. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  25. Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
  26. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  27. Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
  28. Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  29. Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
  30. Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
  31. Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
  32. Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  33. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  34. Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  35. Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
  36. Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
  37. Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
  38. Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  39. Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
  40. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  41. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
  42. Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
  43. Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
  44. Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
  45. Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
  46. van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  47. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
  48. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  49. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
  50. Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
  51. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
  52. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  53. Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved